第14章第39講生物技術在其他方面的應用

1、12生物技術實踐生物技術實踐第第 講講3一、一、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)1.原理原理：植物細胞的全能性：植物細胞的全能性2.基本過程基本過程：4(1)脫分化和再分化的比較脫分化和再分化的比較起點起點關鍵因素關鍵因素條件條件脫分化脫分化外植體外植體植物激素植物激素一般暗培養(yǎng)一般暗培養(yǎng)再分化再分化 愈傷組織愈傷組織細胞分裂素和細胞分裂素和生長素比例生長素比例必須要光照必須要光照(2)愈傷組織的特點：細胞排列疏松而無規(guī)愈傷組織的特點：細胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形的薄壁則，是一種高度液泡化的呈無定形的薄壁細胞。細胞。53.影響因素影響因素(1)外植體的選擇：材料本身的種類、外植體的

2、選擇：材料本身的種類、年齡、保存時間長短等。年齡、保存時間長短等。無機營養(yǎng)無機營養(yǎng)大量元素：如大量元素：如N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：如微量元素：如Cu、Mn、B、Fe、Zn(2)營養(yǎng)營養(yǎng)有機營養(yǎng)：維生素、甘氨酸、煙酸、肌醇以有機營養(yǎng)：維生素、甘氨酸、煙酸、肌醇以及蔗糖等及蔗糖等6(3)植物激素植物激素常用激素：生長素和細胞分裂素。常用激素：生長素和細胞分裂素。使用激素順序不同對試驗結果的影使用激素順序不同對試驗結果的影響：響：使用順序使用順序?qū)嶒灲Y果實驗結果先使用生長素，后使先使用生長素，后使用細胞分裂素用細胞分裂素有利于細胞分裂，但細有利于細胞分裂，但細胞不分化胞不分化先使用細胞分

3、裂素，先使用細胞分裂素，后使用生長素后使用生長素細胞既分裂又分化細胞既分裂又分化同時使用同時使用分化頻率提高分化頻率提高7生長素用量比細胞分裂素用量，其比生長素用量比細胞分裂素用量，其比值不同，對細胞發(fā)育的方向影響不同：值不同，對細胞發(fā)育的方向影響不同：比值高時：有利于根的分化，抑制芽的比值高時：有利于根的分化，抑制芽的形成形成比值低時：有利于芽的分化，抑制根的比值低時：有利于芽的分化，抑制根的形成形成比值適中：促進愈傷組織的形成比值適中：促進愈傷組織的形成(4)溫度：一般將溫度控制在溫度：一般將溫度控制在1822 (5)pH：一般將：一般將pH控制在控制在5.8左右左右(6)光照：每日用日光

4、燈照射光照：每日用日光燈照射12 h84.實驗操作步驟實驗操作步驟(1)制備制備MS固體培養(yǎng)基：配制各種母液固體培養(yǎng)基：配制各種母液配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基滅菌滅菌(2)外植體消毒：酒精溶液消毒外植體消毒：酒精溶液消毒無菌水無菌水清洗清洗次氯酸鈉次氯酸鈉(或氯化汞或氯化汞)溶液溶液無菌水清洗無菌水清洗(3)接種接種(4)培養(yǎng)培養(yǎng)(5)移栽移栽(6)栽培栽培95.月季的花藥培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)(1)被子植物的花粉發(fā)育被子植物的花粉發(fā)育小孢子母細胞小孢子母細胞4個小孢子個小孢子1個小孢子個小孢子(單核居中期單核居中期)1個小孢子個小孢子(單核靠邊期單核靠邊期)花花粉粒粉粒(含一個花粉管細胞核和一個生殖細

5、胞核含一個花粉管細胞核和一個生殖細胞核)(2)產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑10(3)影響花藥培養(yǎng)的因素影響花藥培養(yǎng)的因素不同植物的誘導成功率很不相同；不同植物的誘導成功率很不相同；同種植物的生理狀況；同種植物的生理狀況；花粉發(fā)育時期；花粉發(fā)育時期；親本植株的生長條件、材料和低溫預親本植株的生長條件、材料和低溫預處理以及接種密度等。處理以及接種密度等。116.花粉植株的產(chǎn)生和植物莖的組織培養(yǎng)的比較花粉植株的產(chǎn)生和植物莖的組織培養(yǎng)的比較菊花莖的組織培養(yǎng)菊花莖的組織培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)理論理論依據(jù)植物細胞的全能性依據(jù)植物細胞的全能性基本過程基本過程脫分化、再分化脫分化、再

6、分化影響因素影響因素 選材、營養(yǎng)、激素、選材、營養(yǎng)、激素、pH、溫度、光照等、溫度、光照等操作流程操作流程制備固體培養(yǎng)基制備固體培養(yǎng)基外植體消毒外植體消毒接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)移栽移栽栽栽培培選材選材材料消毒材料消毒接種和培養(yǎng)接種和培養(yǎng)篩選篩選和誘導和誘導移栽移栽栽栽培選育二、蛋白質(zhì)培選育二、蛋白質(zhì)的提取和分離的提取和分離12二、二、蛋白質(zhì)的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離1.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(1)具有兩性具有兩性(2)可以發(fā)生水解反應可以發(fā)生水解反應(3)可溶性、具有膠體的性質(zhì)可溶性、具有膠體的性質(zhì)(4)鹽析鹽析(5)蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(6)顏色反應顏色反應132.操作步驟操作步

7、驟蛋白質(zhì)的提取和分離一般為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般為四步：樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定(1)樣品處理樣品處理14(1)紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌采集血樣采集血樣低速短時間離心低速短時間離心吸吸取血漿取血漿鹽水洗滌鹽水洗滌低速離心低速離心重復重復步驟三次步驟三次(2)血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加蒸餾將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌置于磁力攪拌器上充分攪拌10 min。15(3)分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以

8、將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/min的速度離心的速度離心10min后，試管中的溶后，試管中的溶液分為液分為4層：層：第第1層層(最上層最上層)：甲苯層：甲苯層(無色透明無色透明)第第2層層(中上層中上層)：脂溶性物質(zhì)沉淀層：脂溶性物質(zhì)沉淀層(白白色薄層固體色薄層固體)第第3層層(中下層中下層)：血紅蛋白的水溶液層：血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體紅色透明液體)第第4層層(最下層最下層)：雜質(zhì)沉淀層：雜質(zhì)沉淀層(暗紅色暗紅色)16(4)透析透析取取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度

9、為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析的磷酸緩沖液中，透析12 h，目的，目的是除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。是除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。(2)凝膠色譜分離凝膠色譜分離制作凝膠色譜柱制作凝膠色譜柱裝填凝膠色譜柱裝填凝膠色譜柱樣品加入和洗脫樣品加入和洗脫17(3)結果分析與評價結果分析與評價對于血液樣品的處理，需要經(jīng)過洗滌、對于血液樣品的處理，需要經(jīng)過洗滌、釋放、分離、透析幾個步驟。由于血紅蛋白釋放、分離、透析幾個步驟。由于血紅蛋白與氧氣結合變成鮮紅色，與二氧化碳結合變與氧氣結合變成鮮紅色，與二氧化碳結合變成暗紅色，所以剛分離后的血紅蛋白溶液呈成暗紅色，所以剛分離后的血紅蛋白溶液呈紅

10、色。紅色。紅色區(qū)帶的移動是實驗成功與否的標紅色區(qū)帶的移動是實驗成功與否的標志。紅色區(qū)帶在洗脫過程中均勻一致移動，志。紅色區(qū)帶在洗脫過程中均勻一致移動，說明實驗分離成功。說明實驗分離成功。18三、三、PCR技術的基本操作和應用技術的基本操作和應用1.細胞內(nèi)細胞內(nèi)DNA復制條件分析復制條件分析：條件條件組分組分作用作用模板模板DNA的兩條鏈的兩條鏈提供復制的模板提供復制的模板原料原料四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸合成合成DNA子鏈的原料子鏈的原料酶酶解旋酶、解旋酶、DNA聚聚合酶合酶打開打開DNA雙螺旋催化合成雙螺旋催化合成DNA子鏈子鏈能量能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能為解螺旋和合成子鏈供能引物

11、引物RNA為為DNA聚合酶提供合成的聚合酶提供合成的3端起點端起點192.DNA分子復分子復制的人工控制制的人工控制解開螺旋：在解開螺旋：在80100 時，時，DNA雙螺雙螺旋打開，形成兩條旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。單鏈，稱為變性?；謴吐菪涸诨謴吐菪涸?0 左右時，兩條左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。203.PCR的反應過程的反應過程變性：在變性：在95 時時DNA解旋解旋復性：在復性：在50 時引物與時引物與DNA單鏈結合單鏈結合延伸：在延伸：在72 時合成時合成DNA子鏈子鏈(兩個引兩個引物間的序列物間的序列)214.實

12、驗操作實驗操作(1)PCR反映體系：緩沖液、反映體系：緩沖液、DNA模板、四種模板、四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種聚合酶、兩種RNA引物、水引物、水(2)實驗操作步驟：實驗操作步驟：按照按照PCR反應體系配方配制反應液反應體系配方配制反應液將將PCR反應體系反應體系50L用微量移液器轉(zhuǎn)移到用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管中微量離心管中將微量離心管放到將微量離心管放到PCR儀儀設置設置PCR儀的工作參數(shù)儀的工作參數(shù)DNA在在PCR儀器中大量擴增儀器中大量擴增22水浴法：將微型離心管依次在水浴法：將微型離心管依次在95 、55 、72 的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應時間

13、的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應時間5.實驗注意事項：實驗注意事項：(1)避免外源避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等必須進行高壓滅菌蒸餾水等必須進行高壓滅菌(2)緩沖液和酶分裝成小份，緩沖液和酶分裝成小份，-20 保存保存(3)每添加一種反應成分，更換一個移液器的每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭槍頭(4)混勻后離心處理，使反應液集中在離心管混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部底部231.植物細胞表現(xiàn)出全能性的條件和步驟植物細胞表現(xiàn)出全能性的條件和步驟植物細胞要表現(xiàn)出全能性，需要經(jīng)過以下植物細胞要表現(xiàn)出全能性，需要經(jīng)過以下幾個步驟：幾個步驟：成熟細胞成熟

14、細胞分生細胞分生細胞胚狀體胚狀體完整植株完整植株成熟細胞成熟細胞愈傷組織愈傷組織生根出芽生根出芽完整植完整植株株誘導細胞的脫分化，需要的條件：離體；誘導細胞的脫分化，需要的條件：離體；給予適宜營養(yǎng)和外界條件給予適宜營養(yǎng)和外界條件(包括光照、植物激包括光照、植物激素等素等)242.植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基、無土栽培培養(yǎng)液、植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基、無土栽培培養(yǎng)液、微生物培養(yǎng)基的比較微生物培養(yǎng)基的比較無土栽培：液體培養(yǎng)液；不含有有機物及植無土栽培：液體培養(yǎng)液；不含有有機物及植物激素；培養(yǎng)過程中不需要更換培養(yǎng)液；不需要滅物激素；培養(yǎng)過程中不需要更換培養(yǎng)液；不需要滅菌；菌；植物組織培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基；含有礦質(zhì)元植

15、物組織培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基；含有礦質(zhì)元素、蔗糖、維生素、植物激素、有機添加劑等；培素、蔗糖、維生素、植物激素、有機添加劑等；培養(yǎng)過程中需要更換培養(yǎng)基；需要滅菌；養(yǎng)過程中需要更換培養(yǎng)基；需要滅菌；微生物培養(yǎng)基：一般是固體培養(yǎng)基；含有碳微生物培養(yǎng)基：一般是固體培養(yǎng)基；含有碳源、氮源、生長因子、無機鹽、水，不含植物激素；源、氮源、生長因子、無機鹽、水，不含植物激素；培養(yǎng)過程中不需要更換培養(yǎng)基；需要滅菌。培養(yǎng)過程中不需要更換培養(yǎng)基；需要滅菌。25植物細胞表現(xiàn)出全能性的必要條件是植物細胞表現(xiàn)出全能性的必要條件是()A.給予適宜的營養(yǎng)和外界條件給予適宜的營養(yǎng)和外界條件B.導入其他植物細胞的基因?qū)肫渌参锛?/p>

16、胞的基因C.脫離母體后，給予適宜的營養(yǎng)和外界條件脫離母體后，給予適宜的營養(yǎng)和外界條件D.將成熟的篩管細胞核移植到去核卵細胞中將成熟的篩管細胞核移植到去核卵細胞中C26 在植物體內(nèi)，細胞沒有表現(xiàn)出全能在植物體內(nèi)，細胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織，這是基因選性，而是分化成為不同的組織，這是基因選擇性表達的結果。只有當植物組織或細胞脫擇性表達的結果。只有當植物組織或細胞脫離母體后，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他離母體后，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，植物組織或細胞才能表外界條件的作用下，植物組織或細胞才能表現(xiàn)出全能性?，F(xiàn)出全能性。27下列不可能在離體條件下實現(xiàn)全下列不可能在

17、離體條件下實現(xiàn)全能性的是（雙選）能性的是（雙選）()A.胡蘿卜的韌皮部細胞胡蘿卜的韌皮部細胞B.雜交瘤細胞雜交瘤細胞C.花粉粒花粉粒D.保存完好的細胞核保存完好的細胞核BD28細胞全能性是指已經(jīng)分化的細胞細胞全能性是指已經(jīng)分化的細胞仍然具有發(fā)育的潛能。高度分化的植物細仍然具有發(fā)育的潛能。高度分化的植物細胞具有全能性，特化的動物細胞的細胞核胞具有全能性，特化的動物細胞的細胞核具有全能性，但不同細胞全能性大小有差具有全能性，但不同細胞全能性大小有差異：受精卵異：受精卵生殖細胞生殖細胞體細胞。另外，細體細胞。另外，細胞完成各項生命活動的必要條件是細胞結胞完成各項生命活動的必要條件是細胞結構保持完整性

18、。構保持完整性。29可以成為植物組織培養(yǎng)條件的是可以成為植物組織培養(yǎng)條件的是()CO2有機物生長素細胞分裂素有機物生長素細胞分裂素水礦質(zhì)元素水礦質(zhì)元素A.B.C.D.C進行植物組織培養(yǎng)需要有機物、植進行植物組織培養(yǎng)需要有機物、植物激素、水和礦質(zhì)元素，但不需要物激素、水和礦質(zhì)元素，但不需要CO2，因，因不能進行光合作用。不能進行光合作用。30植物組織培養(yǎng)和無土栽培所用的植物組織培養(yǎng)和無土栽培所用的培養(yǎng)基的共同點是培養(yǎng)基的共同點是()A.都需要滅菌都需要滅菌B.都含有植物激素都含有植物激素C.都含有蔗糖等有機物都含有蔗糖等有機物D.都含有礦質(zhì)元素都含有礦質(zhì)元素D31無土栽培把植物生長發(fā)育過程中無土

19、栽培把植物生長發(fā)育過程中所需要的各種礦質(zhì)元素，按照一定的比例所需要的各種礦質(zhì)元素，按照一定的比例配成營養(yǎng)液，營養(yǎng)液中不含有有機物和植配成營養(yǎng)液，營養(yǎng)液中不含有有機物和植物激素。植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要礦質(zhì)物激素。植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要礦質(zhì)元素、蔗糖、維生素、植物激素和有機添元素、蔗糖、維生素、植物激素和有機添加物。培養(yǎng)過程中需要更換培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)加物。培養(yǎng)過程中需要更換培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及比例。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及比例。32【真題真題1】(10江蘇江蘇)明黨參是我國珍稀藥用明黨參是我國珍稀藥用植物，對其進行保護性開發(fā)利用的方法有植物，對其進行保護性開發(fā)利用的方法有(多多選選)( ) A設計細胞培養(yǎng)反應器，實現(xiàn)藥用成分的設計細胞培養(yǎng)反應器，實現(xiàn)藥用成分的工廠化生產(chǎn)工廠化生產(chǎn) B大量培養(yǎng)愈傷組織，直接提取藥用成分大量培養(yǎng)愈傷組織，直接提取藥用成分 C大規(guī)模栽培組織培養(yǎng)苗，獲取藥用成分大規(guī)模栽培組織培養(yǎng)苗，獲取藥用成分 D. 利用組織培養(yǎng)獲得胚狀體，制成人工種利用組織培養(yǎng)獲得胚狀體，制成人工種子子33 【解析解析】本題考查了植物組織培養(yǎng)技術本題考查了植物組織培養(yǎng)技術的應用。對明黨參進行保護性開發(fā)可采用設