第三章工業(yè)微生物的菌種選育已

1、第三章第三章 工業(yè)微生物的菌種選育工業(yè)微生物的菌種選育目的：目的：改良菌株特性，使其符合改良菌株特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求工業(yè)生產(chǎn)的要求。內(nèi)容：內(nèi)容：根據(jù)菌種自然變異而進行的根據(jù)菌種自然變異而進行的自然選育自然選育，以及，以及人工的方法人工的方法引起菌株變異或形成新的雜種，再按引起菌株變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求進行照工業(yè)生產(chǎn)的要求進行篩選篩選來獲得新的變種或雜來獲得新的變種或雜種。種。微生物快速生長和繁殖積累大量代謝產(chǎn)物菌種選育控制培養(yǎng)條件打破菌的正常代謝菌種選育分類：菌種選育分類：n經(jīng)典育種：經(jīng)典育種：自然選育，誘變育種，有一自然選育，誘變育種，有一定盲目性定盲目性n定向育種

2、：定向育種：雜交育種，分子育種雜交育種，分子育種(DNA(DNA重重組技術(shù)組技術(shù)) )第一節(jié)第一節(jié) 自然選育自然選育1. 自然選育的概念自然選育的概念n自然選育：自然選育：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的處理，利用菌種的自然突變自然突變(Spontaneous Mutation)而進行的菌種篩選過程，又叫而進行的菌種篩選過程，又叫自然分離。自然分離。自然突變的原因：自然突變的原因：（1）多因素低劑量的誘變效應(yīng)）多因素低劑量的誘變效應(yīng)n由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，如充斥空間的各種短波輻射、自然綜合效應(yīng)，

3、如充斥空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的低濃度誘變物質(zhì)、微生物自身界中普遍存在的低濃度誘變物質(zhì)、微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)如代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)如H2O2等的作用。等的作用。（2）互變異構(gòu)效應(yīng)）互變異構(gòu)效應(yīng)n胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)和鳥嘌呤和鳥嘌呤(G)(G)的第六位上可以的第六位上可以酮式或酮式或烯醇式烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶出現(xiàn)，胞嘧啶(C)(C)和腺嘌呤和腺嘌呤(A)(A)第六位可以第六位可以氨基式或亞氨基式氨基式或亞氨基式出現(xiàn)，平衡一般傾向于出現(xiàn)，平衡一般傾向于酮式和酮式和氨基式氨基式，但在偶然情況下，會出現(xiàn)稀有的烯醇式，但在偶然情況下，會出現(xiàn)稀有的烯醇式和亞氨基式，使和亞氨基式，使

4、DNADNA雙鏈結(jié)構(gòu)中常出現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)中常出現(xiàn)的ATAT和和GCGC堿基對變成堿基對變成GTGT和和ACAC，發(fā)生突變，幾率約為，發(fā)生突變，幾率約為1010-8-81010-9-9。NNNNOHH2NHNNNNOHH2NH123456789鳥嘌呤(Guanine)Keto formEnol formNNNHOHHNNNH2OH321654胞嘧啶(Cytosine)Imino formAmino formNNNNNH2HNNOOHHCH3腺嘌呤(Adenine)NNOOHH胸腺嘧啶(Thymine)尿嘧啶(Uracil)2. 2. 自然選育的目的自然選育的目的n發(fā)酵工業(yè)使用的發(fā)酵工業(yè)使用的生產(chǎn)菌

5、株生產(chǎn)菌株，幾乎都是經(jīng)過人工，幾乎都是經(jīng)過人工誘變處理后獲得突變株，遺傳特性往往不夠穩(wěn)誘變處理后獲得突變株，遺傳特性往往不夠穩(wěn)定，定，容易繼續(xù)發(fā)生變異容易繼續(xù)發(fā)生變異，變異的方向一個是菌，變異的方向一個是菌種衰退，造成發(fā)酵產(chǎn)量的降低，另一個是菌種種衰退，造成發(fā)酵產(chǎn)量的降低，另一個是菌種變異獲得優(yōu)良性狀，使發(fā)酵產(chǎn)量提高。經(jīng)常進變異獲得優(yōu)良性狀，使發(fā)酵產(chǎn)量提高。經(jīng)常進行行自然選育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存自然選育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存優(yōu)良的菌株，穩(wěn)定和提高發(fā)酵產(chǎn)量。優(yōu)良的菌株，穩(wěn)定和提高發(fā)酵產(chǎn)量。菌種衰退原因：菌種衰退原因：n由于異核現(xiàn)象、自發(fā)突變和回復(fù)突變，以由于異核現(xiàn)象、自發(fā)突變和

6、回復(fù)突變，以及菌種傳代次數(shù)過多，菌種保藏條件不良及菌種傳代次數(shù)過多，菌種保藏條件不良造成菌種遺傳性狀改變。造成菌種遺傳性狀改變。n培養(yǎng)條件不適當(dāng)使菌種處于不利于發(fā)酵生培養(yǎng)條件不適當(dāng)使菌種處于不利于發(fā)酵生產(chǎn)的生理狀況產(chǎn)的生理狀況 3. 3. 自然選育的一般程序：自然選育的一般程序：采用單菌落分離法采用單菌落分離法n單細胞或單孢子懸浮液要求有良好的分散度：單細胞或單孢子懸浮液要求有良好的分散度：n細菌應(yīng)轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中培養(yǎng)，取得分散的菌體細菌應(yīng)轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中培養(yǎng)，取得分散的菌體n放線菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢放線菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后在過濾子后

7、在過濾, 對粘性大的孢子，可以加入對粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散劑的分散劑(如如Tween 80， 一種非離子活性劑一種非離子活性劑)菌種單孢子或單細胞懸浮液稀釋固體平板分離部分單菌落生產(chǎn)能力測定反復(fù)篩選優(yōu)良菌株留種保藏4. 4. 自然選育的特點自然選育的特點n簡單易行；簡單易行；n效率低、進展慢、難以使生產(chǎn)水平大幅效率低、進展慢、難以使生產(chǎn)水平大幅度提高，需要與誘變育種結(jié)合交替使用。度提高，需要與誘變育種結(jié)合交替使用。第二節(jié)第二節(jié) 誘變育種誘變育種1. 誘變育種的基本原理誘變育種的基本原理n誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，即，即DNADNA分子結(jié)分子結(jié)構(gòu)中

8、某一部位發(fā)生變化。由各種物理、化學(xué)、構(gòu)中某一部位發(fā)生變化。由各種物理、化學(xué)、生物的因素人工生物的因素人工誘發(fā)基因突變誘發(fā)基因突變，引起微生物的，引起微生物的遺傳變異，可使菌種發(fā)生遺傳變異，可使菌種發(fā)生突變的頻率和變異的突變的頻率和變異的幅度得到提高幅度得到提高，從而使篩選獲得優(yōu)良特性的變，從而使篩選獲得優(yōu)良特性的變異菌株的幾率得到提高，因而具有速度快、收異菌株的幾率得到提高，因而具有速度快、收效大、方法簡便的優(yōu)點。但是效大、方法簡便的優(yōu)點。但是誘發(fā)突變?nèi)狈ΧㄕT發(fā)突變?nèi)狈Χㄏ蛐韵蛐?，因此必須與大量的篩選工作結(jié)合才能收，因此必須與大量的篩選工作結(jié)合才能收到良好效果。到良好效果。代謝控制育種n代謝控

9、制育種的活力在于以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過了微生物正常代謝的突變株，從而人為的使有用產(chǎn)物選擇性地大量產(chǎn)生，并且在有控制的條件下培養(yǎng)，大量地生產(chǎn)這種有用產(chǎn)物。其要害是打破了微生物調(diào)節(jié)機制這一天然屏障。(定向性)誘變育種誘變育種過程過程1.1 突變誘發(fā)過程突變誘發(fā)過程n從誘變劑進入細胞到突變型出現(xiàn)的整個從誘變劑進入細胞到突變型出現(xiàn)的整個過程都會有一些因素過程都會有一些因素影響突變的誘發(fā)影響突變的誘發(fā)。1.1.1 誘變劑接觸誘變劑接觸DNA分子前分子前誘變劑DNA細胞的透性細胞質(zhì)某些組分和酶是否處于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)突變的誘發(fā)1.1.2 DNA損傷的修復(fù)損傷的修復(fù)n五種修復(fù)方式：五種修復(fù)方式：

10、光復(fù)活作用；切補修復(fù)；光復(fù)活作用；切補修復(fù)；重組修復(fù)；重組修復(fù)；SOS修復(fù)系統(tǒng)；修復(fù)系統(tǒng)；DNA多聚酶多聚酶的校正作用。的校正作用。（D）SOS修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)系統(tǒng)n這是一種能夠造成誤差修復(fù)的這是一種能夠造成誤差修復(fù)的“呼救信呼救信號號”修復(fù)系統(tǒng)。當(dāng)修復(fù)系統(tǒng)。當(dāng)DNA受到誘變劑損傷受到誘變劑損傷而阻斷而阻斷DNA復(fù)制過程時，復(fù)制過程時，DNA損傷相當(dāng)損傷相當(dāng)于一個呼救信號于一個呼救信號，促使細胞中的有關(guān)酶促使細胞中的有關(guān)酶系解除阻遏，而進行系解除阻遏，而進行DNA的修復(fù)。的修復(fù)。在修在修復(fù)過程中，復(fù)過程中，DNA多聚酶多聚酶在無模板的情況在無模板的情況下下進行進行DNA的修復(fù)的修復(fù)（E）DNA多聚

11、酶的校正作用多聚酶的校正作用n除了上述種種修復(fù)作用以外，細胞還具有對復(fù)制過程中出除了上述種種修復(fù)作用以外，細胞還具有對復(fù)制過程中出現(xiàn)的差錯加以校正的功能。大腸桿菌中的現(xiàn)的差錯加以校正的功能。大腸桿菌中的DNA復(fù)制依賴于復(fù)制依賴于三種三種DNA多聚酶的作用，多聚酶的作用，這三種酶除了對于多核苷酸的多這三種酶除了對于多核苷酸的多聚作用以外，還具有聚作用以外，還具有3到到5核酸外切酶的作用。核酸外切酶的作用。一般認(rèn)為一般認(rèn)為依靠依靠DNA多聚酶的這一作用，多聚酶的這一作用，能在復(fù)制過程中隨時切除不能在復(fù)制過程中隨時切除不正常的核苷酸。正常的核苷酸。如果如果DNA多聚酶發(fā)生突變而使其核酸外切多聚酶發(fā)生

12、突變而使其核酸外切酶活性減弱，那么它切除不正常核苷酸的能力減弱，菌體酶活性減弱，那么它切除不正常核苷酸的能力減弱，菌體的突變率相應(yīng)地提高，成為的突變率相應(yīng)地提高，成為增變突變型增變突變型，DNA多聚酶為多聚酶為DNA修復(fù)作用所必需，所以增變突變型對于誘變劑的作用修復(fù)作用所必需，所以增變突變型對于誘變劑的作用格外敏感。格外敏感。1.1.3 從前突變到突變從前突變到突變n誘變劑造成的誘變劑造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變稱為稱為前突變前突變。前突變可以通過影響。前突變可以通過影響DNA復(fù)制而復(fù)制而成為成為真正的突變真正的突變，也可以經(jīng)過修復(fù)，也可以經(jīng)過修復(fù)不發(fā)生突變。不

13、發(fā)生突變。n一般認(rèn)為光復(fù)活作用、切補修復(fù)和一般認(rèn)為光復(fù)活作用、切補修復(fù)和DNA多聚酶多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突變的誘發(fā)，的校正作用具有校正功能而不利于突變的誘發(fā)，而重組修復(fù)和而重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng)具有引起差錯的性修復(fù)系統(tǒng)具有引起差錯的性質(zhì)而有利于突變的發(fā)生。質(zhì)而有利于突變的發(fā)生。n一切影響一切影響DNA修復(fù)系統(tǒng)中酶活性以及與突變相修復(fù)系統(tǒng)中酶活性以及與突變相關(guān)的酶活性的因素都能影響由關(guān)的酶活性的因素都能影響由前突變向突變的前突變向突變的轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)變。n例如：咖啡堿能抑制切補修復(fù)系統(tǒng)，從而增強例如：咖啡堿能抑制切補修復(fù)系統(tǒng)，從而增強誘變作用；誘變作用；SOS修復(fù)系統(tǒng)和重組修復(fù)依賴于

14、蛋修復(fù)系統(tǒng)和重組修復(fù)依賴于蛋白質(zhì)合成，因而利于蛋白質(zhì)合成的因素有利于白質(zhì)合成，因而利于蛋白質(zhì)合成的因素有利于提高突變率；提高突變率；Ba2+ （鋇）鋇）通過對通過對DNA多聚酶的多聚酶的3核酸外切酶活性的抑制提高突變率。核酸外切酶活性的抑制提高突變率。1.1.4 從突變到突變型從突變到突變型n表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象稱為表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象稱為表型表型延遲延遲。分離性延遲和生理性延遲分離性延遲和生理性延遲分離性延遲：分離性延遲：n經(jīng)誘變后，細胞中野生型基因和突變型基因并經(jīng)誘變后，細胞中野生型基因和突變型基因并存于同一細胞中，突變型基因由于存于同一細胞中，突變型基因由于屬于隱

15、性基屬于隱性基因而沒有表達因而沒有表達，需要經(jīng)過復(fù)制、分離，在細胞，需要經(jīng)過復(fù)制、分離，在細胞中只有突變型基因，沒有野生型基因時，其性中只有突變型基因，沒有野生型基因時，其性狀才得到表達。狀才得到表達。生理性延遲：生理性延遲：n在突變基因已經(jīng)為純的狀態(tài)后，突變表型在突變基因已經(jīng)為純的狀態(tài)后，突變表型還不一定出現(xiàn)，必須等到還不一定出現(xiàn)，必須等到原有基因的產(chǎn)物原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度才表現(xiàn)出來稀釋到某一程度才表現(xiàn)出來，而這些原有，而這些原有基因產(chǎn)物的濃度降低到能改變表型的臨界基因產(chǎn)物的濃度降低到能改變表型的臨界水平前，細胞已經(jīng)分裂多次，經(jīng)過多個世水平前，細胞已經(jīng)分裂多次，經(jīng)過多個世代。（如噬菌

16、體菌株的表達會出現(xiàn)）代。（如噬菌體菌株的表達會出現(xiàn)）2.誘變育種的方案設(shè)計誘變育種的方案設(shè)計n誘變育種包括誘變育種包括三個環(huán)節(jié)三個環(huán)節(jié)：突變的誘發(fā)突變的誘發(fā)、突變株的篩選突變株的篩選、突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)，根據(jù)這三個環(huán)節(jié)進行方案設(shè)計。根據(jù)這三個環(huán)節(jié)進行方案設(shè)計。n 制定篩選目標(biāo)制定篩選目標(biāo)n 對于隨機對于隨機出現(xiàn)的多種變異性狀出現(xiàn)的多種變異性狀，篩選的目標(biāo)除了要求高篩選的目標(biāo)除了要求高產(chǎn)量之外，還應(yīng)從生產(chǎn)的角度考慮其它產(chǎn)量之外，還應(yīng)從生產(chǎn)的角度考慮其它有利性狀有利性狀如如：生：生長速度快、產(chǎn)孢子多；消除某些色素或無益組分；能有長速度快、產(chǎn)孢子多；消除某些色素或無益組分；能有效利

17、用廉價的發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中的某些缺陷效利用廉價的發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中的某些缺陷(如泡沫過多、對溫度波動敏感、菌絲太多、自溶早、過如泡沫過多、對溫度波動敏感、菌絲太多、自溶早、過濾困難等濾困難等)。n 但是所定的篩選目標(biāo)不可太多。但是所定的篩選目標(biāo)不可太多。因為篩選工作量大，往因為篩選工作量大，往往要篩選往要篩選1000個左右的突變株，經(jīng)過多次誘變和篩選，個左右的突變株，經(jīng)過多次誘變和篩選，才獲得一個高產(chǎn)菌株，所以要根據(jù)實際情況確定篩選目才獲得一個高產(chǎn)菌株，所以要根據(jù)實際情況確定篩選目標(biāo)，并考慮實現(xiàn)這些目標(biāo)的可能性。標(biāo)，并考慮實現(xiàn)這些目標(biāo)的可能性。見教材見教材P45 需要注意以下幾

18、點：需要注意以下幾點： 誘變過程：誘變過程：a.出發(fā)菌株的斜面要求是出發(fā)菌株的斜面要求是最佳培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)基，并且是在對誘變劑，并且是在對誘變劑最最敏感的斜面種齡敏感的斜面種齡，孢子數(shù)量和活力要適當(dāng)孢子數(shù)量和活力要適當(dāng)，即前面提到，即前面提到的的DNA處于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)處于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)b.誘變處理前后孢子要計數(shù)誘變處理前后孢子要計數(shù)，以控制處理液的孢子數(shù)和統(tǒng)計，以控制處理液的孢子數(shù)和統(tǒng)計誘變致死率，常用的孢子液濃度是誘變致死率，常用的孢子液濃度是105108個個/ml. 篩選過程：篩選過程：a.傳種斜面要傳種斜面要挑取挑取生長良好的生長良好的正常形態(tài)的菌落正常形態(tài)的菌落，也可挑選少，也可挑選

19、少量量形態(tài)或色素有變異的菌落形態(tài)或色素有變異的菌落，而形態(tài)嚴(yán)重變異的往往是，而形態(tài)嚴(yán)重變異的往往是低產(chǎn)菌株低產(chǎn)菌株b.留種保藏菌種，經(jīng)篩選后挑出比對照留種保藏菌種，經(jīng)篩選后挑出比對照生產(chǎn)能力高生產(chǎn)能力高10%以上以上的的菌株保藏菌株保藏n要篩選出高產(chǎn)菌株，需要經(jīng)過要篩選出高產(chǎn)菌株，需要經(jīng)過反復(fù)多次的誘變、初篩和反復(fù)多次的誘變、初篩和復(fù)篩，并考察其穩(wěn)定性、菌株特性和最適培養(yǎng)條件復(fù)篩，并考察其穩(wěn)定性、菌株特性和最適培養(yǎng)條件等。等。3 突變的誘發(fā)突變的誘發(fā)3.1 出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇n出發(fā)菌株就是用來進行誘變實驗的菌株，對它出發(fā)菌株就是用來進行誘變實驗的菌株，對它的選擇是誘變育種工作成敗的關(guān)

20、鍵，挑選出發(fā)的選擇是誘變育種工作成敗的關(guān)鍵，挑選出發(fā)菌株有以下幾點原則：菌株有以下幾點原則：a.選擇純種作為出發(fā)菌株選擇純種作為出發(fā)菌株n在柱晶白霉素產(chǎn)生菌的選育過程中，采用不純在柱晶白霉素產(chǎn)生菌的選育過程中，采用不純的出發(fā)菌株，經(jīng)過的出發(fā)菌株，經(jīng)過36代誘變，發(fā)酵單位由代誘變，發(fā)酵單位由30u/mL提高到提高到20002500u/mL，采用純的出發(fā)，采用純的出發(fā)菌株后，經(jīng)過菌株后，經(jīng)過32代誘變，可由代誘變，可由30u/mL提高到提高到12000u/mL，可見選擇純種對育種的影響多么大。，可見選擇純種對育種的影響多么大。b.選擇出發(fā)菌株，不僅選擇出發(fā)菌株，不僅要選產(chǎn)量高的，還要考慮要選產(chǎn)量高

21、的，還要考慮其它有利于發(fā)酵產(chǎn)物合成的性狀，其它有利于發(fā)酵產(chǎn)物合成的性狀，出發(fā)菌株應(yīng)出發(fā)菌株應(yīng)具有生產(chǎn)上所需要的代謝特征。具有生產(chǎn)上所需要的代謝特征。n例如適合補料生產(chǎn)工藝的高產(chǎn)菌株是從糖、氮例如適合補料生產(chǎn)工藝的高產(chǎn)菌株是從糖、氮代謝速度較快的出發(fā)菌株的來的。用生活力旺代謝速度較快的出發(fā)菌株的來的。用生活力旺盛而發(fā)酵產(chǎn)量又不是很低的形態(tài)回復(fù)突變株作盛而發(fā)酵產(chǎn)量又不是很低的形態(tài)回復(fù)突變株作為出發(fā)菌株，常可收到好的效果。為出發(fā)菌株，?？墒盏胶玫男Ч.選擇選擇對誘變劑敏感的菌株對誘變劑敏感的菌株作為出發(fā)菌株作為出發(fā)菌株3.2 誘變劑和誘變方式的選擇誘變劑和誘變方式的選擇3.2.1 常用的誘變劑及

22、其類型常用的誘變劑及其類型（見下表）（見下表）物理物理誘變誘變劑劑化化 學(xué)學(xué) 誘誘 變變 劑劑生物生物誘變誘變劑劑堿基類似物堿基類似物與堿基反應(yīng)的物質(zhì)與堿基反應(yīng)的物質(zhì)DNA分子中插入或缺失分子中插入或缺失一個或幾個堿基物質(zhì)一個或幾個堿基物質(zhì)紫外線紫外線2-氨基嘌呤氨基嘌呤硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)吖啶類物質(zhì)吖啶類物質(zhì)噬菌體噬菌體快中子快中子5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯(EMS)ICR類物質(zhì)類物質(zhì)(美國腫美國腫瘤研究所合成的吖啶瘤研究所合成的吖啶類的氮芥衍生物類的氮芥衍生物)X射線射線8-氮鳥嘌呤氮鳥嘌呤亞硝基胍亞硝基胍(NTG)射線射線8-AG亞硝基甲基脲亞硝基甲基脲(NM

23、U)激光激光亞硝基乙基脲亞硝基乙基脲(NEU)亞硝酸亞硝酸(NA)氮芥氮芥(NM)4-硝基喹啉硝基喹啉 1-氧化物氧化物(4NQO)乙烯亞胺乙烯亞胺(EI)羥胺羥胺3.2.2 誘變劑的選擇誘變劑的選擇n對野生型菌株對野生型菌株，單一誘變因素有時也能取得好的，單一誘變因素有時也能取得好的效果，但效果，但對老菌種對老菌種重復(fù)使用單一誘變因素，突變重復(fù)使用單一誘變因素，突變的效果不高，可以利用的效果不高，可以利用復(fù)合因素復(fù)合因素來擴大誘變幅度、來擴大誘變幅度、提高誘變效果。例如氮芥和紫外線的復(fù)合處理、提高誘變效果。例如氮芥和紫外線的復(fù)合處理、乙烯亞胺和紫外線的復(fù)合處理，氯化鋰和紫外線乙烯亞胺和紫外線

24、的復(fù)合處理，氯化鋰和紫外線的復(fù)合處理，都用的比較普遍。其中氯化鋰本身的復(fù)合處理，都用的比較普遍。其中氯化鋰本身無誘變作用，但和一些誘變因子一起使用時，具無誘變作用，但和一些誘變因子一起使用時，具有協(xié)同作用，能增強突變作用。有協(xié)同作用，能增強突變作用。3.2.3 誘變劑的劑量選擇誘變劑的劑量選擇n變異率取決于誘變劑量，而變異率與致死率之變異率取決于誘變劑量，而變異率與致死率之間有一定關(guān)系，因此可以用致死率作為選擇適間有一定關(guān)系，因此可以用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)。宜劑量的依據(jù)。采用致死率高的劑量，如采用致死率高的劑量，如9099.9%致死率的劑量，雖然負(fù)變株多，但變異致死率的劑量，雖然負(fù)變株

25、多，但變異幅度大；采用中等劑量如幅度大；采用中等劑量如7580%或更低的劑或更低的劑量，不會導(dǎo)致太多的負(fù)變株和形態(tài)突變株，量，不會導(dǎo)致太多的負(fù)變株和形態(tài)突變株，出出現(xiàn)高產(chǎn)菌株的幾率高，現(xiàn)高產(chǎn)菌株的幾率高，而且低劑量誘變劑可能而且低劑量誘變劑可能更利于高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定。更利于高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定。n確定合適的誘變劑量需要多次的摸索，確定合適的誘變劑量需要多次的摸索，積累經(jīng)驗。積累經(jīng)驗。一般誘變效應(yīng)隨劑量的增大一般誘變效應(yīng)隨劑量的增大而提高，但達到一定劑量后，再增加劑而提高，但達到一定劑量后，再增加劑量反而會使誘變率下降。量反而會使誘變率下降。 3.2.4 影響誘變效果的因素影響誘變效果的因素a.

26、菌種的生理狀態(tài)與誘變效果有密切關(guān)系菌種的生理狀態(tài)與誘變效果有密切關(guān)系n堿基類似物、亞硝基胍等只對分裂中的堿基類似物、亞硝基胍等只對分裂中的DNA有有效，對靜止的或休眠的孢子或細胞無效；紫外效，對靜止的或休眠的孢子或細胞無效；紫外線、亞硝酸、烷化劑、電離輻射等直接與線、亞硝酸、烷化劑、電離輻射等直接與DNA作用，對靜止的細胞也有誘變效果，但對分裂作用，對靜止的細胞也有誘變效果，但對分裂中的細胞更有效。因此對放線菌和真菌的孢子中的細胞更有效。因此對放線菌和真菌的孢子在誘變前經(jīng)培養(yǎng)稍加萌發(fā)可以提高誘變率。在誘變前經(jīng)培養(yǎng)稍加萌發(fā)可以提高誘變率。b.誘變前后的培養(yǎng)條件對誘變效果有明顯誘變前后的培養(yǎng)條件對

27、誘變效果有明顯影響影響n可以在培養(yǎng)基中加入某些物質(zhì)可以在培養(yǎng)基中加入某些物質(zhì)(如核酸如核酸堿基、咖啡因、氨基酸、氯化鋰、重金堿基、咖啡因、氨基酸、氯化鋰、重金屬離子等屬離子等)來影響細胞對來影響細胞對DNA損傷的修損傷的修復(fù)作用，使之出現(xiàn)更多的差錯，提高誘復(fù)作用，使之出現(xiàn)更多的差錯，提高誘變率。變率。c.其他外界條件其他外界條件如溫度、氧氣、如溫度、氧氣、pH、可見、可見光等對誘變也有影響光等對誘變也有影響3.2.5 幾種誘變方式介紹幾種誘變方式介紹3.2.5.1 快中子快中子n中子由回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生，中子由回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生，它不直接產(chǎn)生電離，但它不

28、直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子來，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)，幾乎完全是射出質(zhì)子來，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)，幾乎完全是由質(zhì)子造成的。由質(zhì)子造成的?？熘凶拥哪芰繛榭熘凶拥哪芰繛?.2百萬百萬10百萬電子百萬電子伏特，比伏特，比X射線、射線、射線有較大的電離密度，因而能更射線有較大的電離密度，因而能更多的多的引起點突變和染色體畸變引起點突變和染色體畸變。用快中子進行誘變育。用快中子進行誘變育種時，用菌種時，用菌(孢子孢子)懸浮液或長在平皿上的菌落進行處理，懸浮液或長在平皿上的菌落進行處理，所用劑量范圍為所用劑量范圍為1001500戈。戈?？熘凶诱T變育種有較

29、好快中子誘變育種有較好的效果，國內(nèi)已廣泛使用。的效果，國內(nèi)已廣泛使用。3.2.5.2 N-甲基甲基-N-硝基硝基-N-亞硝基胍亞硝基胍(NTG)n亞硝基胍是亞硝基烷基類化合物的一種，可亞硝基胍是亞硝基烷基類化合物的一種，可誘誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，故有的營養(yǎng)缺陷型菌株，故有超誘變劑超誘變劑之之稱。稱。NTG較難溶解，在甲酰胺中溶解度較大，較難溶解，在甲酰胺中溶解度較大，可用甲酰胺處理可用甲酰胺處理NTG，提高處理濃度。通常在，提高處理濃度。通常在濃度濃度300g/ml、溫度為、溫度為28和時間為和時間為60mi

30、n的條的條件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。3.2.5.3 航天育種航天育種n航天育種即航天育種即利用空間環(huán)境高真空、微重力和強利用空間環(huán)境高真空、微重力和強輻射的特點，在宇宙射線輻射的作用下，使生輻射的特點，在宇宙射線輻射的作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良菌種。從而選育出優(yōu)良菌種。利用航天育種處理植物種子目前已獲得滿意結(jié)利用航天育種處理植物種子目前已獲得滿意結(jié)果，而對微生物進行遺傳育種在國內(nèi)尚處于起果，而對微生物進行遺傳育種在國內(nèi)尚處于起步階段，步階段，1996年以來，國防科工委年以來，國防科工委863-2辦公室辦公室相繼組

31、織了返地衛(wèi)星和高空氣球搭載微生物、相繼組織了返地衛(wèi)星和高空氣球搭載微生物、動物細胞和植物種子，為微生物的誘變育種提動物細胞和植物種子，為微生物的誘變育種提供了新的手段。供了新的手段。4 突變株的篩選突變株的篩選n菌體細胞經(jīng)誘變處理后，要從大量的變異菌株中，把菌體細胞經(jīng)誘變處理后，要從大量的變異菌株中，把一些具有優(yōu)良性狀的突變株挑選出來，需要明確的篩一些具有優(yōu)良性狀的突變株挑選出來，需要明確的篩選目標(biāo)和篩選方法。選目標(biāo)和篩選方法。育種工作中常用隨機篩選和理性育種工作中常用隨機篩選和理性篩選這兩種方法。篩選這兩種方法。4.1 隨機篩選隨機篩選n隨機篩選即菌種經(jīng)誘變處理后，進行平板分離，隨機隨機篩選

32、即菌種經(jīng)誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選菌落，從中篩選出高產(chǎn)菌株。挑選菌落，從中篩選出高產(chǎn)菌株。a.搖瓶篩選法搖瓶篩選法b.瓊脂塊篩選法瓊脂塊篩選法c.篩選自動化和篩選工具微型化。篩選自動化和篩選工具微型化。4.2 理性化篩選理性化篩選n由于誘變后出現(xiàn)正突變株的幾率小，用隨機篩由于誘變后出現(xiàn)正突變株的幾率小，用隨機篩選的方法要耗費大量的人力物力，因而篩選方選的方法要耗費大量的人力物力，因而篩選方法逐漸轉(zhuǎn)向理性化篩選。法逐漸轉(zhuǎn)向理性化篩選。n理性化篩選：理性化篩選：運用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，運用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝生物合成途徑

33、、代謝調(diào)控機制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)調(diào)控機制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進行設(shè)計和采用的來進行設(shè)計和采用的一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高突變菌株。機制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高突變菌株。 4.2.1 初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選a. 降低終產(chǎn)物濃度降低終產(chǎn)物濃度n篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型；篩選細胞膜透性篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型；篩選細胞膜透性改變的突變株；改變的突變株；b. 篩選抗反饋突變菌株篩選抗反饋突變菌株n篩選結(jié)構(gòu)類似物篩選結(jié)構(gòu)類似物(抗代謝物抗代謝物)抗性突變株；抗性突變株；4.2 理性化篩選理性化篩選4.2.2次

34、級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選(主要是抗生素主要是抗生素) a.利用營養(yǎng)缺陷型篩選利用營養(yǎng)缺陷型篩選 b.篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株 c.篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株 d.篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株 e.篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 f.篩選二價金屬離子抗性突變株篩選二價金屬離子抗性突變株 g.篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 h.篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株4.2 理性化篩選理性化篩選4.2.3 根據(jù)菌株其它生

35、理特性的篩選根據(jù)菌株其它生理特性的篩選n用于菌株理性化篩選的除了代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株用于菌株理性化篩選的除了代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選，根據(jù)制定的篩選目標(biāo)，還有其它類型的篩選，根據(jù)制定的篩選目標(biāo)，還有其它類型的突變株，包括組成性突變株、的突變株，包括組成性突變株、消除無益組分消除無益組分的突變株的突變株、能有效利用廉價的發(fā)酵原材料的突能有效利用廉價的發(fā)酵原材料的突變株變株、細胞形態(tài)改變利于分離提取工藝的突變、細胞形態(tài)改變利于分離提取工藝的突變株、株、抗噬菌體突變株抗噬菌體突變株等等。這些篩選目標(biāo)雖然等等。這些篩選目標(biāo)雖然不直接以產(chǎn)量為目標(biāo)，但它們所具備的優(yōu)良特不直接以產(chǎn)量為目標(biāo)，但它們所具備的優(yōu)良特性

36、往往能導(dǎo)致產(chǎn)量的提高。性往往能導(dǎo)致產(chǎn)量的提高。4.2 理性化篩選理性化篩選5 突變基因的表現(xiàn)突變基因的表現(xiàn)n誘變過程中出現(xiàn)的高產(chǎn)菌株必須由合適的培養(yǎng)誘變過程中出現(xiàn)的高產(chǎn)菌株必須由合適的培養(yǎng)條件相配合，其高產(chǎn)基因才能在生產(chǎn)規(guī)模下得條件相配合，其高產(chǎn)基因才能在生產(chǎn)規(guī)模下得以表現(xiàn)。以表現(xiàn)。例如在土霉素產(chǎn)生菌選育過程的初篩例如在土霉素產(chǎn)生菌選育過程的初篩培養(yǎng)基中適當(dāng)增加淀粉和硫酸銨，可以篩選到培養(yǎng)基中適當(dāng)增加淀粉和硫酸銨，可以篩選到能利用較高濃度的糖和氮以及效價亦比原菌株能利用較高濃度的糖和氮以及效價亦比原菌株略高的突變株，用該培養(yǎng)基連續(xù)篩選，進一步略高的突變株，用該培養(yǎng)基連續(xù)篩選，進一步增加糖、氮，

37、獲得了對糖、氮利用能力強的菌增加糖、氮，獲得了對糖、氮利用能力強的菌株，發(fā)揮了它的生產(chǎn)潛力。株，發(fā)揮了它的生產(chǎn)潛力。第三節(jié)第三節(jié) 雜交育種雜交育種n雜交育種：雜交育種：兩個不同基因型的菌株通過兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。菌株。 n雜交育種的優(yōu)勢：雜交育種的優(yōu)勢：因為已知親本的性狀，因為已知親本的性狀，把不同菌株的優(yōu)良性狀集中于組合體中，具有把不同菌株的優(yōu)良性狀集中于組合體中，具有定向育種的性質(zhì)；定向育種的性質(zhì)；可以克服長期用誘變劑處可以克服長期用誘變劑處理造

38、成的菌株生活力下降，對誘變劑不敏感，理造成的菌株生活力下降，對誘變劑不敏感，產(chǎn)量上升緩慢等缺陷；產(chǎn)量上升緩慢等缺陷；可以擴大變異范圍，可以擴大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種。改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種。n雜交育種分為雜交育種分為常規(guī)的雜交育種常規(guī)的雜交育種和和原生質(zhì)體融原生質(zhì)體融合合兩種方法，后一種方法較為多見。兩種方法，后一種方法較為多見。1. 常規(guī)的雜交育種常規(guī)的雜交育種n常規(guī)的雜交育種常規(guī)的雜交育種不對菌體的細胞壁進行處理不對菌體的細胞壁進行處理，直接使細胞接合而發(fā)生遺傳物質(zhì)的重新組合。直接使細胞接合而發(fā)生遺傳物質(zhì)的重新組合。n由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世

39、代，用來配對的直接由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代，用來配對的直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記以便于篩選，親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記以便于篩選，常用的遺常用的遺傳標(biāo)記傳標(biāo)記有顏色、營養(yǎng)要求和抗藥性等，營養(yǎng)標(biāo)記菌株有顏色、營養(yǎng)要求和抗藥性等，營養(yǎng)標(biāo)記菌株(即即營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)缺陷型菌株)是最常用的遺傳標(biāo)記之一。是最常用的遺傳標(biāo)記之一。n細菌、放線菌、霉菌均能進行雜交育種，但迄今發(fā)現(xiàn)有細菌、放線菌、霉菌均能進行雜交育種，但迄今發(fā)現(xiàn)有雜交現(xiàn)象的微生物為數(shù)不多，在有工業(yè)價值的微生物中雜交現(xiàn)象的微生物為數(shù)不多，在有工業(yè)價值的微生物中則更少，而且即使發(fā)生雜交，遺傳重組的頻率也不高，則更少，而且即使發(fā)生

40、雜交，遺傳重組的頻率也不高，妨礙了在微生物育種中的應(yīng)用。妨礙了在微生物育種中的應(yīng)用。微生物雜交育種基本程序：選擇原始親本+誘變篩選直接親本直接親本之間親和力鑒定雜交分離到基本培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選重組體重組體分析鑒定。微生物雜交育種程序(1) 親本菌株的選擇親本菌株的選擇 an原始親本原始親本是微生物雜交育種中具有不同遺傳背景的是微生物雜交育種中具有不同遺傳背景的優(yōu)質(zhì)出發(fā)菌株。優(yōu)質(zhì)出發(fā)菌株。n通常根據(jù)雜交的目的，選擇具有優(yōu)良性狀、發(fā)酵性通常根據(jù)雜交的目的，選擇具有優(yōu)良性狀、發(fā)酵性能好的菌株為原始親本。如產(chǎn)量高、代謝快、產(chǎn)孢能好的菌株為原始親本。如產(chǎn)量高、代謝快、產(chǎn)孢子能力強、無色素、泡沫

41、少、黏性小等。子能力強、無色素、泡沫少、黏性小等。n它們可以來自生產(chǎn)用菌或誘變過程中的某些符它們可以來自生產(chǎn)用菌或誘變過程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分離的野生型菌合要求的菌株，也可以是自然分離的野生型菌株。株。n原始親本還應(yīng)該具有野生型遺傳標(biāo)記，如具有原始親本還應(yīng)該具有野生型遺傳標(biāo)記，如具有一定的孢子顏色、可溶性色素或抗性標(biāo)記等明一定的孢子顏色、可溶性色素或抗性標(biāo)記等明顯不同的性狀。顯不同的性狀。n在雜交育種中具有遺傳標(biāo)記和親和能力而直在雜交育種中具有遺傳標(biāo)記和親和能力而直接用于雜交配對的菌株，稱為接用于雜交配對的菌株，稱為直接親本直接親本。n它是由原始親本菌株經(jīng)誘變劑處理后選出的它

42、是由原始親本菌株經(jīng)誘變劑處理后選出的具營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其他遺傳標(biāo)記，又通過具營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其他遺傳標(biāo)記，又通過親和力測定的直接用于雜交的菌株。親和力測定的直接用于雜交的菌株。n同時兩親株間遺傳特性差異要大，這樣遺傳物質(zhì)重同時兩親株間遺傳特性差異要大，這樣遺傳物質(zhì)重組后相應(yīng)變異也大，有利于達到菌種選育的目的。組后相應(yīng)變異也大，有利于達到菌種選育的目的。n根據(jù)一些學(xué)者的研究，如要獲得高產(chǎn)的重組體，最根據(jù)一些學(xué)者的研究，如要獲得高產(chǎn)的重組體，最好采用具有明顯遺傳性狀差異的好采用具有明顯遺傳性狀差異的近親菌株近親菌株為直接親為直接親本。遠緣親株間雜交雖然同樣也能得到二倍體和重本。遠緣親株間雜交雖然同

43、樣也能得到二倍體和重組體，但它們的后代產(chǎn)生嚴(yán)重的遺傳分離現(xiàn)象，篩組體，但它們的后代產(chǎn)生嚴(yán)重的遺傳分離現(xiàn)象，篩選高產(chǎn)、穩(wěn)定的新變種難度較大。選高產(chǎn)、穩(wěn)定的新變種難度較大。 (2) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基雜交過程中常用的培養(yǎng)基有：雜交過程中常用的培養(yǎng)基有：n完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基(CM)n基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM)n有限培養(yǎng)基有限培養(yǎng)基(LM)n補充培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基(SM)：營養(yǎng)成分復(fù)雜而豐富，主要原材料都：營養(yǎng)成分復(fù)雜而豐富，主要原材料都來自于天然有機物。氮源有蛋白胨、牛肉膏、麥芽來自于天然有機物。氮源有蛋白胨、牛肉膏、麥芽浸汁等；碳源有淀粉水解液、葡萄糖、甘油等。完浸汁等；碳源有淀粉水解液、葡萄糖、甘油

44、等。完全培養(yǎng)基含有各種氨基酸、糖類、維生素、核酸及全培養(yǎng)基含有各種氨基酸、糖類、維生素、核酸及其他一些成分。它除有天然有機物之外，也有一定其他一些成分。它除有天然有機物之外，也有一定比例的無機鹽。比例的無機鹽。n由于營養(yǎng)全面，由于營養(yǎng)全面，野生型野生型的原始親本和的原始親本和缺陷型缺陷型的直接的直接親本都能利用它，以供生長需求。完全培養(yǎng)基是各親本都能利用它，以供生長需求。完全培養(yǎng)基是各種菌株正常生長繁不可缺少的培養(yǎng)基，在雜交育種種菌株正常生長繁不可缺少的培養(yǎng)基，在雜交育種過程中利用它和基本培養(yǎng)基配合來檢出重組體。過程中利用它和基本培養(yǎng)基配合來檢出重組體。：營養(yǎng)成分簡單而貧乏，原材料基本上：營養(yǎng)

45、成分簡單而貧乏，原材料基本上都是無機化合物。氮源主要是無機鹽，不含氨基酸、都是無機化合物。氮源主要是無機鹽，不含氨基酸、維生素和核酸等有機物，碳源是葡萄糖或蔗糖等，維生素和核酸等有機物，碳源是葡萄糖或蔗糖等，也含有一些無機鹽。也含有一些無機鹽。n由于營養(yǎng)成分不全面，只能允許由于營養(yǎng)成分不全面，只能允許野生型野生型的原始親本的原始親本及其他及其他原養(yǎng)型原養(yǎng)型菌株生長，而營養(yǎng)缺陷型的直接親本菌株生長，而營養(yǎng)缺陷型的直接親本菌株則不能生長?；九囵B(yǎng)基在雜交育種過程中相菌株則不能生長?；九囵B(yǎng)基在雜交育種過程中相當(dāng)重要，不論是營養(yǎng)缺陷型的篩選，還是重組體的當(dāng)重要，不論是營養(yǎng)缺陷型的篩選，還是重組體的檢

46、出、鑒別都是不可缺少的一類培養(yǎng)基。檢出、鑒別都是不可缺少的一類培養(yǎng)基。：專供：專供異核體異核體菌株生長使用的培養(yǎng)基。菌株生長使用的培養(yǎng)基。通常在基本培養(yǎng)基或蒸餾水中加入適量通常在基本培養(yǎng)基或蒸餾水中加入適量(10-20%)的的完全培養(yǎng)基，加入的量只限兩直接親本菌株稍許生完全培養(yǎng)基，加入的量只限兩直接親本菌株稍許生長，以提供相互接觸、吻合的菌絲體需要。加量過長，以提供相互接觸、吻合的菌絲體需要。加量過多，菌絲體也隨之增多，會影響異核體的檢出。多，菌絲體也隨之增多，會影響異核體的檢出。：又稱鑒別培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基，是供：又稱鑒別培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基，是供鑒別重組體類型鑒別重組體類型的培養(yǎng)基。通常在基

47、本培養(yǎng)基中加的培養(yǎng)基。通常在基本培養(yǎng)基中加入已知成分的各種氨基酸、維生素和核酸類物質(zhì)，入已知成分的各種氨基酸、維生素和核酸類物質(zhì)，配制成不同類型的補充培養(yǎng)基。配制成不同類型的補充培養(yǎng)基。n上述各種上述各種培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制時除完全培養(yǎng)基外都有特殊的時除完全培養(yǎng)基外都有特殊的要求，對要求，對原材料品質(zhì)、器皿清潔度原材料品質(zhì)、器皿清潔度要求尤其高，制要求尤其高，制備培養(yǎng)基所用的藥品采用化學(xué)純以上，葡萄糖和蔗備培養(yǎng)基所用的藥品采用化學(xué)純以上，葡萄糖和蔗糖等有機物也要純凈；瓊脂須事先處理，以除去有糖等有機物也要純凈；瓊脂須事先處理，以除去有機物或可溶性物質(zhì)。機物或可溶性物質(zhì)。n瓊脂處理方法瓊脂處理方

48、法是稱取瓊脂放入桶內(nèi)，用自來水是稱取瓊脂放入桶內(nèi)，用自來水清洗幾次，然后置自來水龍頭下流水沖洗清洗幾次，然后置自來水龍頭下流水沖洗24h，雙手?jǐn)D壓，反復(fù)沖洗擠壓幾次，最后用蒸餾水雙手?jǐn)D壓，反復(fù)沖洗擠壓幾次，最后用蒸餾水清洗清洗2-3遍，于遍，于37下晾干，裝入潔凈塑料袋下晾干，裝入潔凈塑料袋中保存?zhèn)溆谩Ｖ斜４鎮(zhèn)溆?。n凡是配制上述培養(yǎng)基和試驗過程中所需的器皿，都凡是配制上述培養(yǎng)基和試驗過程中所需的器皿，都要非常潔凈，不能有任何有機物，包括氨基酸、維要非常潔凈，不能有任何有機物，包括氨基酸、維生素和核酸類物質(zhì)，否則會使試驗遭到失敗，通常生素和核酸類物質(zhì)，否則會使試驗遭到失敗，通常有關(guān)器皿專一使用有

49、關(guān)器皿專一使用。n測定營養(yǎng)缺陷型的營養(yǎng)特征，要用各種氨基酸、維測定營養(yǎng)缺陷型的營養(yǎng)特征，要用各種氨基酸、維生素和核酸堿基來配制鑒別培養(yǎng)基。這幾類物質(zhì)，生素和核酸堿基來配制鑒別培養(yǎng)基。這幾類物質(zhì)，總計有數(shù)十種，配制時要特別注意總計有數(shù)十種，配制時要特別注意相互間不能污染相互間不能污染，以免由于它們之間的混雜而造成實驗誤差和不必要以免由于它們之間的混雜而造成實驗誤差和不必要的返工。的返工。(3) 雜交育種的遺傳標(biāo)記雜交育種的遺傳標(biāo)記n為了提高效率，加快重組體篩選和檢出，需要讓為了提高效率，加快重組體篩選和檢出，需要讓雜交親本帶上不同的遺傳標(biāo)記。雜交親本帶上不同的遺傳標(biāo)記。n一般雜交親本用一般雜交親

50、本用或或等遺等遺傳標(biāo)記，作為選擇重組體的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。除此，傳標(biāo)記，作為選擇重組體的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。除此，還要利用親本菌株本身具有的某些特殊遺傳性狀還要利用親本菌株本身具有的某些特殊遺傳性狀作為作為。n遺傳標(biāo)記菌株的獲得，要通過誘變劑處理，按常遺傳標(biāo)記菌株的獲得，要通過誘變劑處理，按常規(guī)篩選方法進行。規(guī)篩選方法進行。n營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可選擇單缺、雙缺或多缺，但為了可選擇單缺、雙缺或多缺，但為了避免回復(fù)突變干擾，通常采用避免回復(fù)突變干擾，通常采用。多缺。多缺型通常對菌株活力和代謝產(chǎn)物合成會產(chǎn)生不利影響。型通常對菌株活力和代謝產(chǎn)物合成會產(chǎn)生不利影響。應(yīng)用應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇重組體存在一些營

51、養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇重組體存在一些不足不足：n因為它一般由誘變獲得，操作過程較復(fù)雜，需要花因為它一般由誘變獲得，操作過程較復(fù)雜，需要花費大量人力、物力和時間；費大量人力、物力和時間；n多數(shù)缺陷型標(biāo)記會影響重組菌株產(chǎn)量和孢子形成，多數(shù)缺陷型標(biāo)記會影響重組菌株產(chǎn)量和孢子形成，甚至造成一些優(yōu)良性狀丟失；甚至造成一些優(yōu)良性狀丟失；n此外，標(biāo)記基因所在的此外，標(biāo)記基因所在的DNA片斷可能遠離優(yōu)良的有片斷可能遠離優(yōu)良的有益性狀基因，導(dǎo)致許多有益重組體漏篩。據(jù)抗生素益性狀基因，導(dǎo)致許多有益重組體漏篩。據(jù)抗生素育種資料分析，大多數(shù)放線菌的抗生素合成基因在育種資料分析，大多數(shù)放線菌的抗生素合成基因在染色體上位于遺傳

52、圖譜的下半?yún)^(qū)，而營養(yǎng)缺陷有關(guān)染色體上位于遺傳圖譜的下半?yún)^(qū)，而營養(yǎng)缺陷有關(guān)基因卻在遺傳圖譜的上半?yún)^(qū)?；騾s在遺傳圖譜的上半?yún)^(qū)。n所以有時必須結(jié)合其他方法來消除這些不利影響。所以有時必須結(jié)合其他方法來消除這些不利影響?？剐詷?biāo)記抗性標(biāo)記n利用不同微生物的抗性差異及其他菌株特性選擇重利用不同微生物的抗性差異及其他菌株特性選擇重組體。組體。n這類標(biāo)記比較多，如抗逆性這類標(biāo)記比較多，如抗逆性(高溫、高鹽、高高溫、高鹽、高pH)和和抗藥性等，其中抗藥性等，其中。不同微生物。不同微生物對某一藥物的抗性程度不一，這是其遺傳物質(zhì)決定對某一藥物的抗性程度不一，這是其遺傳物質(zhì)決定的。利用這種差異能在相應(yīng)藥物的選擇性培

53、養(yǎng)基上的。利用這種差異能在相應(yīng)藥物的選擇性培養(yǎng)基上獲得重組體，其篩選原理和方法與缺陷型標(biāo)記相同。獲得重組體，其篩選原理和方法與缺陷型標(biāo)記相同。n有時也把抗性標(biāo)記與營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記結(jié)合使用，能有時也把抗性標(biāo)記與營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記結(jié)合使用，能提高育種效率和消除不利影響。提高育種效率和消除不利影響。溫度敏感性標(biāo)記溫度敏感性標(biāo)記n有人在制備耐鹽酵母時，親本之一選擇釀酒酵母有人在制備耐鹽酵母時，親本之一選擇釀酒酵母UCD522，它能在，它能在37生長，但不耐高滲；另一親生長，但不耐高滲；另一親本德巴利酵母本德巴利酵母(Debaryomyces sp.)可耐高滲，但對溫可耐高滲，但對溫度敏感，不能在度敏感，不能

54、在37下生長。利用高滲培養(yǎng)基在下生長。利用高滲培養(yǎng)基在37下就能檢出兩者雜交后的重組體。下就能檢出兩者雜交后的重組體。其他性狀標(biāo)記其他性狀標(biāo)記n如孢子顏色、菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、可溶性色素含量、代如孢子顏色、菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、可溶性色素含量、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高低、代謝速度快慢、利用的碳氮源種謝產(chǎn)物產(chǎn)量高低、代謝速度快慢、利用的碳氮源種類、殺傷力等其他性狀都可以作為重組體檢出的輔類、殺傷力等其他性狀都可以作為重組體檢出的輔助性標(biāo)記。助性標(biāo)記。n選擇確定雜交親本的遺傳標(biāo)記是十分重要的，其方選擇確定雜交親本的遺傳標(biāo)記是十分重要的，其方法多種多樣。法多種多樣。 總之，微生物種類不同，適用方法總之，微生物種類不同，適用

55、方法不一樣，標(biāo)記菌株的篩選在雜交育種中不一樣，標(biāo)記菌株的篩選在雜交育種中是重要的組成部分，工作量也很大，針是重要的組成部分，工作量也很大，針對不同菌種，快速、有效地選得標(biāo)記菌對不同菌種，快速、有效地選得標(biāo)記菌株，可以提高重組體篩選效率，加速整株，可以提高重組體篩選效率，加速整個雜交育種的進程。個雜交育種的進程。2. 原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)n原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合(protoplast fusion)：用用脫壁酶（蝸脫壁酶（蝸牛酶、溶菌酶）牛酶、溶菌酶）處理將微生物細胞壁出去，使菌處理將微生物細胞壁出去，使菌體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹的體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)

56、膜包裹的球狀體球狀體(原生質(zhì)體原生質(zhì)體)，再用，再用聚乙二醇聚乙二醇(PEG)促進促進（電擊促進）（電擊促進）原生質(zhì)體發(fā)生融合，兩親本基因組原生質(zhì)體發(fā)生融合，兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)基因重組，由接觸到交換，從而實現(xiàn)基因重組，這一技術(shù)叫這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合。在再生成細胞的菌落中就有可能獲得在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。具有理想性狀的重組子。n該技術(shù)首先應(yīng)用于動植物細胞，于該技術(shù)首先應(yīng)用于動植物細胞，于20世紀(jì)世紀(jì)70年年代后期引入微生物研究?，F(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)酵代后期引入微生物研究?，F(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)如抗生素、蛋白酶高產(chǎn)菌株選育、新抗生工業(yè)如抗生

57、素、蛋白酶高產(chǎn)菌株選育、新抗生素產(chǎn)生菌的培育方面等。素產(chǎn)生菌的培育方面等。 2.1原生質(zhì)體融合技術(shù)的優(yōu)點原生質(zhì)體融合技術(shù)的優(yōu)點n去去除了細胞壁的障礙除了細胞壁的障礙，易于接受外來遺傳物質(zhì)，不同，易于接受外來遺傳物質(zhì)，不同種的微生物、甚至親緣關(guān)系更遠的微生物都可能融合在種的微生物、甚至親緣關(guān)系更遠的微生物都可能融合在一起；一起；原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生生多次交換多次交換，而且參與融合的親株數(shù)可以多至，而且參與融合的親株數(shù)可以多至3、4個，個，因而可以得到多種類型的重組子；因而可以得到多種類型的重組子；重組頻率特別高重組頻率特別高，例如天藍

58、色鏈霉菌的種內(nèi)重組頻率可達到例如天藍色鏈霉菌的種內(nèi)重組頻率可達到20%；可以可以使來自不同菌株的使來自不同菌株的多種優(yōu)良性狀組合多種優(yōu)良性狀組合到一個菌株里。到一個菌株里。n原生質(zhì)體融合技術(shù)用于菌種選育仍是一種原生質(zhì)體融合技術(shù)用于菌種選育仍是一種半理性化篩半理性化篩選選，因為所采用的兩個親株的特性是已知的，但他們基，因為所采用的兩個親株的特性是已知的，但他們基因組的交換、重組是非定向的。因組的交換、重組是非定向的。2.2 原生質(zhì)體融合的一般步驟原生質(zhì)體融合的一般步驟2.2 原生質(zhì)體融合的一般步驟原生質(zhì)體融合的一般步驟(1)篩選標(biāo)記菌株，篩選標(biāo)記菌株，采用的遺傳標(biāo)記一般為營養(yǎng)缺陷性和抗藥采用的遺

59、傳標(biāo)記一般為營養(yǎng)缺陷性和抗藥性等遺傳性狀性等遺傳性狀(2)原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備由于細胞壁成分不同由于細胞壁成分不同(細菌細胞壁的主要成分是肽聚糖，霉細菌細胞壁的主要成分是肽聚糖，霉菌的細胞壁主要由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，酵母的細胞壁主菌的細胞壁主要由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，酵母的細胞壁主要成分是葡聚糖要成分是葡聚糖)，對于細菌和防線菌主要用溶菌酶，對，對于細菌和防線菌主要用溶菌酶，對于酵母菌和霉菌一般用蝸牛酶和纖維素酶來脫壁制備原生于酵母菌和霉菌一般用蝸牛酶和纖維素酶來脫壁制備原生質(zhì)體。質(zhì)體。在脫壁酶處理前先用某些化合物對菌體預(yù)處理，有利于原在脫壁酶處理前先用某些化合物對菌體預(yù)處理，有利于原生質(zhì)體

60、制備。例如用生質(zhì)體制備。例如用EDTA、甘氨酸、青霉素或、甘氨酸、青霉素或D-環(huán)絲氨環(huán)絲氨酸等處理細菌，可使菌體的細胞壁對酶的敏感性增加。酸等處理細菌，可使菌體的細胞壁對酶的敏感性增加。2.2 原生質(zhì)體融合的一般步驟原生質(zhì)體融合的一般步驟選擇合適的菌體培養(yǎng)時間，一般選對數(shù)生長期后期的菌體選擇合適的菌體培養(yǎng)時間，一般選對數(shù)生長期后期的菌體進行酶處理進行酶處理選擇合適的酶濃度和酶解溫度選擇合適的酶濃度和酶解溫度酶解時間要適當(dāng)，過長會導(dǎo)致細胞再生率降低酶解時間要適當(dāng)，過長會導(dǎo)致細胞再生率降低滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑 原生質(zhì)體由于失去了細胞壁的保護，必須在高滲透原生質(zhì)體由于失去了細胞壁的保護，必須在高