第七章微生物藥物的分離、精制和鑒別

1、第七章第七章 微生物藥物的分微生物藥物的分 離、精制和鑒別離、精制和鑒別7.1 提取的過程、原則和方法提取的過程、原則和方法7.2 微生物藥物的鑒別微生物藥物的鑒別 7.1 提取的過程、原則和方法提取的過程、原則和方法發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離提取（分離濃縮）提?。ǚ蛛x濃縮）精制（純化）精制（純化）微生物藥物分離純化的重要原則微生物藥物分離純化的重要原則 考慮使用高選擇性的分離純化方法，保考慮使用高選擇性的分離純化方法，保證產(chǎn)品要求的純度；證產(chǎn)品要求的純度； 考慮不影響產(chǎn)品的生物活性；考慮不影響產(chǎn)品的生物活性； 獲得的最終產(chǎn)品必須達(dá)到或超過國家藥獲得的最終產(chǎn)品必須達(dá)到或超

2、過國家藥典（或出口國）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。典（或出口國）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離由于所需的產(chǎn)品在培養(yǎng)液和菌體中濃度很低，并與由于所需的產(chǎn)品在培養(yǎng)液和菌體中濃度很低，并與許多雜質(zhì)夾雜在一起，同時(shí)發(fā)酵液或生物溶液又屬許多雜質(zhì)夾雜在一起，同時(shí)發(fā)酵液或生物溶液又屬于非牛頓型流體，所以必須進(jìn)行預(yù)處理。于非牛頓型流體，所以必須進(jìn)行預(yù)處理。v 目的：達(dá)到固液分離目的：達(dá)到固液分離發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離v 根據(jù)活性物質(zhì)的許可范圍，可以采取酸根據(jù)活性物質(zhì)的許可范圍，可以采取酸化、加熱、過濾、絮凝、離心等方法?；⒓訜?、過濾、絮凝、離心等方法。發(fā)酵液的預(yù)處理和

3、固液分離發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離 分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒（細(xì)胞分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒（細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物）碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物） 除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。以利于后繼各步操作。 雜蛋白的存在會(huì)降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂雜蛋白的存在會(huì)降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量的吸附量 萃取，會(huì)發(fā)生乳化，影響兩相分離萃取，會(huì)發(fā)生乳化，影響兩相分離 在常規(guī)過濾和膜過濾時(shí)，還會(huì)使濾速下降，使膜在常規(guī)過濾和膜過濾時(shí)，還會(huì)使濾速下降，使膜受到污染。受到污染。1、發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的去除、發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的去除1）沉淀法）

4、沉淀法 調(diào)等電點(diǎn)調(diào)等電點(diǎn) 因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍都在酸性范圍(pH4.0-5.5) 但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物陰離子物質(zhì)質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽等形成沉淀；在堿性如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些溶液中，能與一些陽離子陽離子如如Ag+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 3+、等、等 形成沉淀形成沉淀2）變性法）變性法 變性蛋白溶解度較小變

5、性蛋白溶解度較小 最常用加熱法最常用加熱法 加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率； 其他方法：其他方法： 大幅度調(diào)節(jié)大幅度調(diào)節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑 變性法存在一定的局限變性法存在一定的局限 如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿。的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿。3）吸附法）吸附法 加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去 如

6、四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞如四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白； 在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去包裹在其中而除去鎂離子的去除：鎂離子的去除： 常用草酸常用草酸 與鈣離子生成草酸鈣沉淀與鈣離子生成草酸鈣沉淀 草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有

7、利于提高濾液的過濾速度；還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過濾速度； 草酸的溶解度較小，需大用量時(shí)，可用草酸鈉取代；草酸的溶解度較小，需大用量時(shí)，可用草酸鈉取代；草酸價(jià)格較高，生產(chǎn)上一般需回收草酸價(jià)格較高，生產(chǎn)上一般需回收鈣離子的去除：鈣離子的去除：鐵離子的去除：鐵離子的去除： 常用三聚磷酸鈉常用三聚磷酸鈉 與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物 Na5P3O10 + Mg 2+ = MgNa3P3O10 + 2Na+常用黃血鹽常用黃血鹽 與鐵離子形成普魯氏藍(lán)沉淀與鐵離子形成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6 + 4Fe 3+ = Fe4Fe(CN)63 + 12K+2、發(fā)酵液中高價(jià)

8、離子的去除、發(fā)酵液中高價(jià)離子的去除 3、發(fā)酵液的過濾、發(fā)酵液的過濾v 影響過濾速度的因素影響過濾速度的因素菌種、發(fā)酵培養(yǎng)菌種、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵周期長短等；基的組成、發(fā)酵周期長短等；v 改善過濾性能改善過濾性能常用助濾劑硅藻土；常用助濾劑硅藻土；v 過濾設(shè)備過濾設(shè)備鼓式真空過濾器，板框壓濾機(jī)鼓式真空過濾器，板框壓濾機(jī)1、常用過濾設(shè)備、常用過濾設(shè)備1）板框）板框(plate and frame)壓濾機(jī)壓濾機(jī)板框過濾機(jī)結(jié)構(gòu)圖板框過濾機(jī)結(jié)構(gòu)圖 （曹軍衛(wèi)（曹軍衛(wèi) 320頁）頁）1-尾板尾板 2-濾框?yàn)V框 3-濾板濾板 4-主梁主梁 5-頭板頭板 6-緊壓裝置緊壓裝置2）帶式壓濾機(jī)）帶式壓濾機(jī)3、發(fā)

9、酵液的過濾、發(fā)酵液的過濾 發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)行補(bǔ)料，防止消泡劑和發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)行補(bǔ)料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度；未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度； 菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物增加發(fā)酵液黏度增加發(fā)酵液黏度2、影響發(fā)酵液過濾的因素、影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細(xì)胞體積）菌體細(xì)胞體積 真菌菌絲體較粗大，質(zhì)量比阻小，發(fā)酵液不需經(jīng)特殊真菌菌絲體較粗大，質(zhì)量比阻小，發(fā)酵液不需經(jīng)特殊處理就很容易過濾；處理就很容易過濾； 放線菌菌絲細(xì)而分支，交織成網(wǎng)格狀，質(zhì)量比阻力大，放線菌菌絲細(xì)而分支，交織成網(wǎng)格狀，質(zhì)量比阻力大，

10、較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處理，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處理，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，提高過濾速度；提高過濾速度； 細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處理，很難用細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處理，很難用常規(guī)過濾設(shè)備進(jìn)行過濾操作。常規(guī)過濾設(shè)備進(jìn)行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會(huì)增加過濾難度黃豆餅粉、花生餅粉等會(huì)增加過濾難度3）放罐時(shí)機(jī)）放罐時(shí)機(jī)當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時(shí)，會(huì)使發(fā)酵液的黏度增大而影響當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時(shí)，會(huì)使發(fā)酵液的黏度增大而影響過濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。過濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。3、提高過

11、濾性能的方法、提高過濾性能的方法1）加助濾劑）加助濾劑 助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；而增加濾速； 常用硅藻土、珍珠巖等；常用硅藻土、珍珠巖等； 加入方法有兩種：加入方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的厚的助濾劑；助濾劑； b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加填充凝固劑）添加填充凝固劑如如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固和懸浮物凝固3）酶解法）酶解法 目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)

12、胞目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)胞內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)形成的包含體是不分泌內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)形成的包含體是不分泌的，故需進(jìn)行細(xì)胞破碎。的，故需進(jìn)行細(xì)胞破碎。4、細(xì)胞破碎、細(xì)胞破碎 大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法；大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法； 利用高壓使細(xì)胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高利用高壓使細(xì)胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)，造成細(xì)胞破碎。速?zèng)_擊撞擊環(huán)，造成細(xì)胞破碎。 影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法1）高壓勻漿法）高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥高壓勻漿器排出閥2）高速球磨法）高速球

13、磨法高速球磨機(jī)高速球磨機(jī)1-物料進(jìn)口物料進(jìn)口 2-物料出口物料出口 3、4-冷卻水進(jìn)、出口冷卻水進(jìn)、出口 5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細(xì)胞得以破碎。細(xì)胞得以破碎。3）超聲波法）超聲波法 常用超聲波頻率常用超聲波頻率15-25kHz； 細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，由于這種空穴泡又細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，由于這種空穴泡又受到超聲波的迅速?zèng)_擊而閉合，從而產(chǎn)生極為強(qiáng)烈的沖擊波受到超聲波的迅速?zèng)_擊而閉合，從

14、而產(chǎn)生極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由此引起的黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上造成了剪切壓力，由此引起的黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，造成細(xì)胞破碎；應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，造成細(xì)胞破碎； 超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作是需冷卻；超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作是需冷卻； 通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4）酶解法）酶解法 專一性強(qiáng)，條件溫和；但費(fèi)用較高專一性強(qiáng)，條件溫和；但費(fèi)用較高 酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用 即溶胞的酶是微生物自身產(chǎn)生的；大多數(shù)微生物都能產(chǎn)即溶胞

15、的酶是微生物自身產(chǎn)生的；大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解自身細(xì)胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶；當(dāng)改變一定生一種可以水解自身細(xì)胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶；當(dāng)改變一定的環(huán)境條件時(shí)，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶的環(huán)境條件時(shí)，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶現(xiàn)象。酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶現(xiàn)象。5）滲透壓沖擊法）滲透壓沖擊法 將細(xì)胞先放入高滲透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或?qū)⒓?xì)胞先放入高滲透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在達(dá)到平衡后，介質(zhì)突然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入蔗糖液，在達(dá)到平衡后，介質(zhì)突然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，水就會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，水或緩沖液中，水就會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，

16、致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂；引起細(xì)胞壁的破裂； 此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理的，或細(xì)胞壁合成受到抑制的微生物；理的，或細(xì)胞壁合成受到抑制的微生物；6）反復(fù)凍結(jié)）反復(fù)凍結(jié)-融化法融化法 將細(xì)胞反復(fù)在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起將細(xì)胞反復(fù)在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。細(xì)胞內(nèi)外溶液

17、濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。 該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞v 主要用于離子交換法提取抗生素，如鏈霉素；主要用于離子交換法提取抗生素，如鏈霉素；v 一般采用反吸附，將經(jīng)稀釋后黏度降低的發(fā)酵液自一般采用反吸附，將經(jīng)稀釋后黏度降低的發(fā)酵液自下而上的流經(jīng)樹脂床，樹脂呈下而上的流經(jīng)樹脂床，樹脂呈“沸騰狀沸騰狀”，吸附后的，吸附后的廢液（包括發(fā)酵液中的懸浮顆粒）一起流出離子交換廢液（包括發(fā)酵液中的懸浮顆粒）一起流出離子交換罐外。罐外。4、不過濾提取、不過濾提取 v 對活性物質(zhì)的濃縮對活性物質(zhì)的濃縮v 方法：化學(xué)萃取，樹脂吸附，沉淀等方法：化學(xué)萃取，樹脂吸附，沉淀等提取

18、（分離濃縮）提?。ǚ蛛x濃縮）溶劑萃取法溶劑萃取法 (Solvent extraction)手工洗衣服為例手工洗衣服為例 打完肥皂、揉搓后，如何將肥皂沫打完肥皂、揉搓后，如何將肥皂沫去除呢？去除呢？ 用清水多次漂洗用清水多次漂洗 經(jīng)驗(yàn)表明：每盆水揉搓的時(shí)間越長（即萃取越接近平經(jīng)驗(yàn)表明：每盆水揉搓的時(shí)間越長（即萃取越接近平衡），擰得越干（即萃取與萃余相相分離越徹底），所衡），擰得越干（即萃取與萃余相相分離越徹底），所用漂洗次數(shù)越少（即錯(cuò)流級數(shù)越少）。用漂洗次數(shù)越少（即錯(cuò)流級數(shù)越少）。 溶劑萃取原理溶劑萃取原理分配定律分配定律 溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的，即利用各種物質(zhì)在不溶劑萃取法是以分配定律

19、為基礎(chǔ)的，即利用各種物質(zhì)在不同溶劑中具有不同的溶解度的原理，達(dá)到將不同物質(zhì)分離純同溶劑中具有不同的溶解度的原理，達(dá)到將不同物質(zhì)分離純化的目的?；哪康?。分配定律（分配定律（distribution law; Nester, 1891）在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩不相溶的溶劑中，在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩不相溶的溶劑中，達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相的濃度之比為一常數(shù)。達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相的濃度之比為一常數(shù)。 K = CL/CR = 萃取液濃度萃取液濃度/萃余液濃度萃余液濃度K為分配常數(shù)（分配系數(shù)、分配比），其大小反映出溶質(zhì)在為分配常數(shù)（分配系數(shù)、分配比），其大小反映出溶質(zhì)在不同溶劑中溶解度

20、的差異，及在此系統(tǒng)中的選擇性不同溶劑中溶解度的差異，及在此系統(tǒng)中的選擇性 在溶劑萃取中，含有溶質(zhì)的未被提取過的溶液稱為料液；在溶劑萃取中，含有溶質(zhì)的未被提取過的溶液稱為料液；用于進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑；經(jīng)萃取后含有溶質(zhì)的萃取用于進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑；經(jīng)萃取后含有溶質(zhì)的萃取劑稱為萃取液；被萃取過失去溶質(zhì)的料液稱為萃余液。劑稱為萃取液；被萃取過失去溶質(zhì)的料液稱為萃余液。分離因素（分離系數(shù)）分離因素（分離系數(shù)） 若在同一體系中有兩種溶質(zhì)若在同一體系中有兩種溶質(zhì)A和和B，它們在相同條件下的分，它們在相同條件下的分配常數(shù)分別為配常數(shù)分別為KA、KB，則分離系數(shù)，則分離系數(shù) 的定義為：的定義為： =

21、 KA/KB = (CLA/CLB)/(CRA/CRB)K = CL/CR有機(jī)溶劑的選擇有機(jī)溶劑的選擇1）選擇萃取用的溶劑應(yīng)考慮對產(chǎn)物有較大的溶解度和較）選擇萃取用的溶劑應(yīng)考慮對產(chǎn)物有較大的溶解度和較好的選擇性。好的選擇性。 分離因素可以表征溶劑的選擇性如何，溶解度則由相分離因素可以表征溶劑的選擇性如何，溶解度則由相似相溶的分子極性所決定。似相溶的分子極性所決定。 介電常數(shù)是一個(gè)化合物摩爾極化程度的量度；通過這介電常數(shù)是一個(gè)化合物摩爾極化程度的量度；通過這一數(shù)值，可預(yù)知一個(gè)化合物是極性化合物還是非極性化一數(shù)值，可預(yù)知一個(gè)化合物是極性化合物還是非極性化合物。合物。4）價(jià)格低廉，安全）價(jià)格低廉，安

22、全常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇2）溶劑與被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面張力適中，）溶劑與被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面張力適中，對相的分散和相的分離有利；對相的分散和相的分離有利；3）溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性高，回收和再生容易；）溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性高，回收和再生容易；萃取方式萃取方式1、單級萃取、單級萃取 多級逆流萃取包括若干萃取級，在第一級中加入料液，并多級逆流萃取包括若干萃取級，在第一級中加入料液，并逐漸向下一級移動(dòng)，而在最后一級中加入萃取劑，并逐漸向逐漸向下一級移動(dòng)，而在最后一級中加入萃取劑，并逐漸向前一級移動(dòng)。前一級移動(dòng)。 料液移動(dòng)的方向和萃取劑移動(dòng)的

23、方向相反，故得名。料液移動(dòng)的方向和萃取劑移動(dòng)的方向相反，故得名。2、多級錯(cuò)流萃取、多級錯(cuò)流萃取(multistage cross-flow extraction)由幾個(gè)萃取器串聯(lián)組成，料液經(jīng)第一級萃取后分離成兩個(gè)由幾個(gè)萃取器串聯(lián)組成，料液經(jīng)第一級萃取后分離成兩個(gè)相；萃余相流入下一個(gè)萃取器，再加入新鮮萃取劑繼續(xù)萃相；萃余相流入下一個(gè)萃取器，再加入新鮮萃取劑繼續(xù)萃??；萃取相則分別由各級排出，混合在一起，再進(jìn)入回收??；萃取相則分別由各級排出，混合在一起，再進(jìn)入回收器回收溶劑，回收得到的溶劑仍作萃取劑循環(huán)使用。器回收溶劑，回收得到的溶劑仍作萃取劑循環(huán)使用。3、多級逆流萃?。ā⒍嗉壞媪鬏腿。╩ultis

24、tage counter-current extraction）單級萃取流程單級萃取流程多級錯(cuò)流萃取流程多級錯(cuò)流萃取流程離子交換法離子交換法 (Ion exchange)(Ion exchange)一）離子交換樹脂的分類一）離子交換樹脂的分類 其活性基團(tuán)一般是磺酸基其活性基團(tuán)一般是磺酸基(-SO3H); 由于是強(qiáng)酸性基團(tuán)，電離程度不受外界由于是強(qiáng)酸性基團(tuán)，電離程度不受外界pH的影響，在的影響，在pH1-14范圍內(nèi)均能起交換作用，一般沒有使用范圍內(nèi)均能起交換作用，一般沒有使用pH的限制。的限制。 以與以與NaCl的交換為例：的交換為例： R-SO3H + NaCl R-SO3Na + HCl 其

25、再生是用其再生是用NaOH處理并水洗至處理并水洗至pH8-9。再用。再用HCl處理并處理并用水洗至用水洗至pH51、強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂2、弱酸性陽離子樹脂、弱酸性陽離子樹脂 以羧基以羧基(-COOH )、酚羥基、酚羥基(-OH)等為活性基團(tuán)；等為活性基團(tuán)； 其交換性能與溶液的其交換性能與溶液的pH有很大關(guān)系，因?yàn)檫@種樹脂的電離有很大關(guān)系，因?yàn)檫@種樹脂的電離度很小。度很小。例如：例如：羧基樹脂交換羧基樹脂交換pH7，酚羥基樹脂交換，酚羥基樹脂交換pH9。在酸性在酸性溶液中，這類樹脂幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨溶液溶液中，這類樹脂幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨溶液pH

26、增高而增高。增高而增高。 典型交換反應(yīng)：典型交換反應(yīng)：R-COOH + NaOH RCOONa + H2O 反應(yīng)生成的鹽反應(yīng)生成的鹽RCOONa很容易水解并使溶液呈堿性，故鈉很容易水解并使溶液呈堿性，故鈉型樹脂不可能水洗到中性，一般只能水洗到型樹脂不可能水洗到中性，一般只能水洗到pH8-9。3、強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 有兩種：有兩種： 強(qiáng)堿強(qiáng)堿型型 含有三甲胺基含有三甲胺基 強(qiáng)堿強(qiáng)堿型型 含有二甲基含有二甲基- -羥基羥基-乙基胺乙基胺 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂與強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂一樣，沒強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂與強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂一樣，沒有使用有使用pH的限制；的限制； 典型

27、交換反應(yīng)：典型交換反應(yīng)： RN(CH3)3Cl + NaOH RN(CH3)3OH + NaCl4、弱堿性陰離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂 活性基團(tuán)有伯胺基活性基團(tuán)有伯胺基-NH2、仲胺基、仲胺基NH、叔胺基、叔胺基NH和吡和吡啶基等；啶基等； 與弱酸性陽離子樹脂情況類似，交換能力隨與弱酸性陽離子樹脂情況類似，交換能力隨pH的變化而的變化而變化，變化， pH越低，交換能力越大；越低，交換能力越大； 典型交換反應(yīng)：典型交換反應(yīng)：RNH3OH + HCl RNH3Cl + H2O 生成的鹽生成的鹽RNH3Cl很容易水解；這類樹脂與很容易水解；這類樹脂與OH的結(jié)合的結(jié)合 能力較強(qiáng)，容易再生成羥型

28、，耗堿量也少。能力較強(qiáng)，容易再生成羥型，耗堿量也少。另有一些特殊的樹脂，如鰲合樹脂、兩性樹脂、氧另有一些特殊的樹脂，如鰲合樹脂、兩性樹脂、氧化還原樹脂；大孔樹脂化還原樹脂；大孔樹脂二）離子交換樹脂的命名法二）離子交換樹脂的命名法 交聯(lián)度交聯(lián)度連接符號連接符號順序號順序號骨架號骨架號分類號分類號大孔樹脂在前面加大孔樹脂在前面加“D”例如：例如：0017： 強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，交聯(lián)度為強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，交聯(lián)度為7 D301 ：弱堿性苯乙烯系大孔陰離子交換樹脂：弱堿性苯乙烯系大孔陰離子交換樹脂 樹脂性質(zhì)分類 骨架分類分類號 樹脂種類 骨架號 骨架材料 0 0 強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性 0

29、0 苯乙烯系苯乙烯系 1 1 弱酸性弱酸性 1 1 丙烯酸系丙烯酸系 2 2 強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性 2 2 酚醛系酚醛系 3 3 弱堿性弱堿性 3 3 環(huán)氧系環(huán)氧系 4 4 鰲合性鰲合性 4 4 乙烯吡啶系乙烯吡啶系 5 5 兩性兩性 5 5 尿醛系尿醛系 6 6 氧化還原氧化還原 6 6 氧乙烯系氧乙烯系三）離子交換樹脂理化指標(biāo)三）離子交換樹脂理化指標(biāo) 合成樹脂時(shí)單體中交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的含量百分?jǐn)?shù)合成樹脂時(shí)單體中交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的含量百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度。稱為交聯(lián)度。 通常通常8%-12%； 一般交聯(lián)度越大，樹脂越堅(jiān)固，機(jī)械強(qiáng)度越好，在水中一般交聯(lián)度越大，樹脂越堅(jiān)固，機(jī)械強(qiáng)度越好，在水中不易膨脹

30、；交聯(lián)度越低，樹脂越柔軟，越容易膨脹，越能不易膨脹；交聯(lián)度越低，樹脂越柔軟，越容易膨脹，越能很好地吸附較大的離子，達(dá)到交換平衡的速度越大；但機(jī)很好地吸附較大的離子，達(dá)到交換平衡的速度越大；但機(jī)械強(qiáng)度差，吸附的選擇性小；械強(qiáng)度差，吸附的選擇性小；1、交聯(lián)度、交聯(lián)度2、膨脹度、膨脹度 樹脂不溶于水，但親水性強(qiáng)，具有親水膠體性質(zhì)，一般樹脂不溶于水，但親水性強(qiáng)，具有親水膠體性質(zhì)，一般吸水膨脹，脫水收縮；吸水膨脹，脫水收縮； 測定方法：將測定方法：將10-15ml風(fēng)干樹脂放入量筒，加入欲實(shí)驗(yàn)的風(fēng)干樹脂放入量筒，加入欲實(shí)驗(yàn)的溶劑（多為水），然后不時(shí)搖動(dòng)，溶劑（多為水），然后不時(shí)搖動(dòng)，24h后，測定樹脂的體

31、積。后，測定樹脂的體積。前后體積之比稱為膨脹系數(shù)；前后體積之比稱為膨脹系數(shù)； 膨脹系數(shù)與交聯(lián)度有一定關(guān)系，交聯(lián)度大的樹脂膨脹系膨脹系數(shù)與交聯(lián)度有一定關(guān)系，交聯(lián)度大的樹脂膨脹系數(shù)小；數(shù)??；3、交換容量、交換容量 指一定量樹脂中可交換基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)，是表征樹脂指一定量樹脂中可交換基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)，是表征樹脂性能的重要指標(biāo)。性能的重要指標(biāo)。 若將樹脂裝柱進(jìn)行操作，流出液中產(chǎn)物離子達(dá)到某一濃若將樹脂裝柱進(jìn)行操作，流出液中產(chǎn)物離子達(dá)到某一濃度時(shí)，操作即應(yīng)停止，樹脂進(jìn)行再生后再使用。這一濃度稱度時(shí)，操作即應(yīng)停止，樹脂進(jìn)行再生后再使用。這一濃度稱為漏出點(diǎn)。為漏出點(diǎn)。 在漏出點(diǎn)時(shí)樹脂所吸附的量叫做工作交換容

32、量。在漏出點(diǎn)時(shí)樹脂所吸附的量叫做工作交換容量。四）離子交換工作原理四）離子交換工作原理 根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子不同，電荷不同的物質(zhì)對層析柱上的離子交換劑有不同的親不同，電荷不同的物質(zhì)對層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或和力，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，不同物質(zhì)就能依次從層，不同物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。析柱中分離出來。 在離子交換過程中，離子首先擴(kuò)散到樹脂表面，通過樹脂在離子交換過程中，離子首先擴(kuò)散到樹脂表面，通過樹脂擴(kuò)散到交換位置，在交換位置進(jìn)行離子交換。被交換的分子擴(kuò)散到交換位置，在

33、交換位置進(jìn)行離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹脂的結(jié)合越緊密，也就越不容易被其所帶電荷越多，它與樹脂的結(jié)合越緊密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子擴(kuò)散到樹脂表面，洗脫液通過，它離子所取代。被交換的離子擴(kuò)散到樹脂表面，洗脫液通過，被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中。被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中。 大分子物質(zhì)要選擇交聯(lián)度低些的樹脂，小分子物質(zhì)則選大分子物質(zhì)要選擇交聯(lián)度低些的樹脂，小分子物質(zhì)則選用交聯(lián)度高的樹脂；用交聯(lián)度高的樹脂； 由于交聯(lián)度低樹脂強(qiáng)度差、易破碎，因此，交聯(lián)度選擇由于交聯(lián)度低樹脂強(qiáng)度差、易破碎，因此，交聯(lián)度選擇的原則是在不影響交換容量的條件下，盡可能提高交聯(lián)度。的原則是在

34、不影響交換容量的條件下，盡可能提高交聯(lián)度。五）離子交換樹脂的選擇1、首先要考慮的是產(chǎn)物的酸堿性質(zhì)、首先要考慮的是產(chǎn)物的酸堿性質(zhì) 如強(qiáng)酸性物質(zhì)應(yīng)該選用弱堿性陰離子交換樹脂，這主要如強(qiáng)酸性物質(zhì)應(yīng)該選用弱堿性陰離子交換樹脂，這主要是從是否容易解吸的角度考慮的；因?yàn)閺?qiáng)堿性陰離子交換是從是否容易解吸的角度考慮的；因?yàn)閺?qiáng)堿性陰離子交換樹脂固然也能吸附強(qiáng)酸性物質(zhì)，但洗脫困難；樹脂固然也能吸附強(qiáng)酸性物質(zhì)，但洗脫困難； 若產(chǎn)物為弱酸性物質(zhì)則應(yīng)選擇強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，若產(chǎn)物為弱酸性物質(zhì)則應(yīng)選擇強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，如用弱堿性陰離子樹脂則不易吸附。如用弱堿性陰離子樹脂則不易吸附。 同理，強(qiáng)堿性產(chǎn)物則應(yīng)選用弱酸性陽

35、離子交換樹脂；弱同理，強(qiáng)堿性產(chǎn)物則應(yīng)選用弱酸性陽離子交換樹脂；弱堿性產(chǎn)物則選用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。堿性產(chǎn)物則選用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。2、其次要考慮交聯(lián)度、其次要考慮交聯(lián)度如：當(dāng)產(chǎn)物分子是低價(jià)離子時(shí)，增加濃度有利于交換上柱；如：當(dāng)產(chǎn)物分子是低價(jià)離子時(shí)，增加濃度有利于交換上柱；高價(jià)離子則在較低濃度下易被吸附。高價(jià)離子則在較低濃度下易被吸附。六）操作條件的控制六）操作條件的控制1、交換條件控制、交換條件控制1）最重要的是控制交換時(shí)的）最重要的是控制交換時(shí)的pH合適的合適的pH應(yīng)該考慮三方面：應(yīng)該考慮三方面： 應(yīng)在被吸附物質(zhì)穩(wěn)定的應(yīng)在被吸附物質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)；范圍內(nèi)； 能夠使被吸附物質(zhì)離子化；能

36、夠使被吸附物質(zhì)離子化； 同時(shí)能使樹脂離子化同時(shí)能使樹脂離子化2）在使用之前，樹脂還必須處理成一定的型式）在使用之前，樹脂還必須處理成一定的型式 對于弱酸性和弱堿性樹脂，為了使其能離子化，應(yīng)采用鈉對于弱酸性和弱堿性樹脂，為了使其能離子化，應(yīng)采用鈉型或氯型；型或氯型； 而強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性樹脂可采用任何型式，但若產(chǎn)物在酸性而強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性樹脂可采用任何型式，但若產(chǎn)物在酸性或堿性條件下易破壞的，則不能采用氫型或羥型；對于偶極或堿性條件下易破壞的，則不能采用氫型或羥型；對于偶極離子的有機(jī)物，應(yīng)該采用氫型樹脂。離子的有機(jī)物，應(yīng)該采用氫型樹脂。3）要考慮到產(chǎn)物濃度對交換有影響）要考慮到產(chǎn)物濃度對交換有影響2、

37、洗脫條件的控制、洗脫條件的控制洗脫條件正好與上柱條件相反洗脫條件正好與上柱條件相反 如對如對pH范圍的選擇，若酸性上柱，則應(yīng)在堿性條件下范圍的選擇，若酸性上柱，則應(yīng)在堿性條件下洗脫；若堿性上柱，就采用酸性條件洗脫；洗脫；若堿性上柱，就采用酸性條件洗脫；v 獲得活性物質(zhì)的純品獲得活性物質(zhì)的純品v 方法：沉淀，吸附，結(jié)晶，脫色，色譜層方法：沉淀，吸附，結(jié)晶，脫色，色譜層析等。析等。精制（純化）精制（純化）l操作時(shí)間應(yīng)盡可能的短；操作時(shí)間應(yīng)盡可能的短；l操作溫度一般要低；操作溫度一般要低；l分離純化操作應(yīng)在藥物性質(zhì)許可的分離純化操作應(yīng)在藥物性質(zhì)許可的pH pH 范范圍內(nèi)；圍內(nèi)；l經(jīng)常清洗消毒，避免雜

38、菌的污染；經(jīng)常清洗消毒，避免雜菌的污染；l如果是注射用藥物，精制和成品階段應(yīng)保如果是注射用藥物，精制和成品階段應(yīng)保證無菌操作。證無菌操作。 分離提取的原則分離提取的原則第七章第七章 微生物藥物的分微生物藥物的分 離、精制和鑒別離、精制和鑒別7.1 提取的過程和原則提取的過程和原則7.2 微生物藥物的鑒別微生物藥物的鑒別pH2.5，濾液，濾液醋酸丁酯醋酸丁酯pH7.0，緩沖液，緩沖液pH2.5，醋酸丁酯，醋酸丁酯丁酯提取液冷凍脫水，加入醋酸鉀丁酯提取液冷凍脫水，加入醋酸鉀-乙醇溶液乙醇溶液青霉素鉀鹽結(jié)晶青霉素鉀鹽結(jié)晶反萃取反萃取v 青霉素的提取及精制青霉素的提取及精制青霉素：酸性化合物，酸性時(shí)為游離酸，易溶青霉素：酸性化合物，酸性時(shí)為游離酸，易溶于有機(jī)溶劑。在于有機(jī)溶劑。在pH7以上以鹽狀態(tài)存在，易溶以上以鹽狀態(tài)存在，易溶于水。于水。v 紅霉素的提