分子生物學方法鑒定微生物(1)

1、.1微生物分子生物學鑒定微生物分子生物學鑒定微生物分類學定義：微生物分類學定義：按微生物的親緣關(guān)系和進化規(guī)律按微生物的親緣關(guān)系和進化規(guī)律把它們安排成條理清楚的各種分類單元把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群的科學?；蚍诸惾旱目茖W。.2微生物的鑒定微生物的鑒定主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找權(quán)威性鑒定手冊權(quán)威性鑒定手冊鑒定方法分四個水平鑒定方法分四個水平：細胞的形態(tài)和習性水平：形態(tài)特征、運動、酶反應(yīng)、營細胞的形態(tài)和習性水平：形態(tài)特征、運動、酶反應(yīng)、營養(yǎng)要求及生長條件等養(yǎng)要求及生長條件等細胞組分水平：細胞壁成分、氨基酸庫、脂類、醌類、細胞組

2、分水平：細胞壁成分、氨基酸庫、脂類、醌類、光合色素等的分析光合色素等的分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學反應(yīng)蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學反應(yīng)等等1. 基因或基因或DNA水平：核酸分子雜交水平：核酸分子雜交、（、（G+C）mol%、轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導、化和轉(zhuǎn)導、16SrRNA寡核苷酸族分分析、寡核苷酸族分分析、DNA或或RNA核苷酸序列分析等核苷酸序列分析等.3類別類別DNADNA堿基比例的測定堿基比例的測定 全基因組序列的測定全基因組序列的測定隨著分子生物學的迅速發(fā)展，細菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進入到各種基因型分類水平 核酸分子雜交核酸分子雜交.4 一、

3、一、DNADNA的堿基組成的堿基組成(G+C)mol%(G+C)mol% (G+C)mol%= A+T+G+CG+CX100% 1)DNA堿基比例的測定 是指是指（G + CG + C）mol%mol%值值，簡稱，簡稱“GCGC比比”，表示表示DNADNA分子中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的摩爾百分比值。分子中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的摩爾百分比值。AT間僅形成間僅形成2個個氫鍵，氫鍵，GC間可形成間可形成3個個氫鍵。氫鍵。GC值根據(jù)樣品的值根據(jù)樣品的Tm值值計算。計算。.5通過核酸分析鑒定微生物遺傳型生物生物GCGC比的特點比的特點親緣關(guān)系親緣關(guān)系相近的相近的種，其種，其GCGC比比也相近也相近；反之，；反

4、之，GCGC比相近的兩比相近的兩個種，它們的親緣關(guān)系則個種，它們的親緣關(guān)系則不一定不一定都很接近。都很接近。GCGC比比差距很大的差距很大的兩個種，其親緣關(guān)系必然兩個種，其親緣關(guān)系必然較遠較遠。GCGC比是建立新比是建立新分類單元分類單元時的可靠指標時的可靠指標 GCGC比相差比相差2%5%5%時，為不同種；時，為不同種； GCGC比相差比相差10%10%時，為不同屬時，為不同屬。.6 測定測定DNA堿基組成的方法：堿基組成的方法： 由于熱變性溫度法操作簡單、重復性好而最為常用。由于熱變性溫度法操作簡單、重復性好而最為常用。 基本原理：將基本原理：將DNA加熱，兩條單鏈逐漸被打開，從而加熱，兩

5、條單鏈逐漸被打開，從而使使DNA溶液溶液260nm紫外吸收明顯增加，稱紫外吸收明顯增加，稱DNA的增色的增色效應(yīng)。效應(yīng)。G+C增加，所需溫度也較高，當溫度高達一定增加，所需溫度也較高，當溫度高達一定值時，值時，DNA完全分離成單鏈，此后紫外吸收不再增加。完全分離成單鏈，此后紫外吸收不再增加。 DNA的熱變性過程的熱變性過程(即增色效應(yīng)的出現(xiàn)即增色效應(yīng)的出現(xiàn))是在一個狹窄的是在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，紫外吸收增加的中點值所對應(yīng)的溫溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，紫外吸收增加的中點值所對應(yīng)的溫度稱為該度稱為該DNA的熱變性溫度的熱變性溫度(Tm)。在一定條件下，。在一定條件下，DNA的的Tm值與值與DNA的

6、的G+Cmol%成正比。成正比。 Tm69.30.41（G+Cmol）.7.8二、核酸分子雜交二、核酸分子雜交DNA-DNA DNA-DNA 雜交法雜交法DNA-rRNA DNA-rRNA 雜交法雜交法rRNA-rRNA rRNA-rRNA 雜交法雜交法雜交同源性雜交同源性: : 60%, 60%, 同種同種 70%, 70%, 同一亞種同一亞種 20%-60%, 20%-60%, 同一屬同一屬按堿基的互補配對原理，用按堿基的互補配對原理，用人工方法對兩條人工方法對兩條不同來源的不同來源的單鏈核酸進行單鏈核酸進行復性（退火）復性（退火），以構(gòu)建新的雜合雙鏈核酸的以構(gòu)建新的雜合雙鏈核酸的技術(shù)技術(shù)

7、.9 核酸的分子雜交核酸的分子雜交 DNA-DNA雜交 基本原理：雙鏈基本原理：雙鏈DNA分子加熱可變性，冷卻處理時，又可復性。分子加熱可變性，冷卻處理時，又可復性。不僅同一菌株的不僅同一菌株的DNA單鏈可以復性結(jié)合成雙鏈，來自不同菌株單鏈可以復性結(jié)合成雙鏈，來自不同菌株的的DNA單鏈，只要二者具有同源互補的堿基序列，它們也會在單鏈，只要二者具有同源互補的堿基序列，它們也會在同源序列之間互補結(jié)合形成雙鏈，這就稱之為同源序列之間互補結(jié)合形成雙鏈，這就稱之為DNA-DNA分子雜分子雜交。不同微生物之間，交。不同微生物之間，DNA同源程度越高，其雜交率就越高，同源程度越高，其雜交率就越高，若兩個菌株

8、若兩個菌株DNA分子序列完全相同，則應(yīng)分子序列完全相同，則應(yīng)100%地雜交結(jié)合。地雜交結(jié)合。 具體測定方法很多，按雜交反應(yīng)的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜具體測定方法很多，按雜交反應(yīng)的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜交兩大類。在這些方法中，有的需要交兩大類。在這些方法中，有的需要用同位素標記用同位素標記DNA，有的，有的則用非同位素標記，而則用非同位素標記，而復性速率法復性速率法則是通過測定單鏈則是通過測定單鏈DNA分子分子復性結(jié)合的速率來計算復性結(jié)合的速率來計算DNA的同源性而不需要對的同源性而不需要對DNA分子進行分子進行標記。標記。 .10細菌常用固相雜交法： （參照菌株）（參照菌株）A菌菌 B菌

9、（待測）菌（待測） DNA DNA （ 同位素標記、酶切并解鏈）同位素標記、酶切并解鏈）單鏈單鏈 單鏈（固定于濾膜上，未標記）單鏈（固定于濾膜上，未標記） 最適溫度復性雜交最適溫度復性雜交 洗滌洗滌 測定放射強度測定放射強度 雜交率雜交率（以參照菌株自身復性的放射性值為百分之百（以參照菌株自身復性的放射性值為百分之百 ） 60%同一個種；同一個種；70%同一亞種；同一亞種；2060%同屬不同種同屬不同種 對于許多有爭議的對于許多有爭議的種種的界定和建立的界定和建立新種新種起了重要作用起了重要作用 .11.12 DNA-rRNA雜交雜交 rRNA是是DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在生物進化過程中，其堿基轉(zhuǎn)錄

10、的產(chǎn)物，在生物進化過程中，其堿基序列的變化比基因組要慢得多，保守得多，它甚至保留序列的變化比基因組要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些堿基序列。因此，當兩個菌株的了古老祖先的一些堿基序列。因此，當兩個菌株的DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時，用雜交率很低或不能雜交時，用DNA-rRNA雜雜交仍可能出現(xiàn)較高的雜交率，因而可以用來進一步比較交仍可能出現(xiàn)較高的雜交率，因而可以用來進一步比較關(guān)系更遠的菌株之間的關(guān)系，進行屬和屬以上等級分類關(guān)系更遠的菌株之間的關(guān)系，進行屬和屬以上等級分類單元的分類。單元的分類。 DNA-DNA雜交和雜交和DNA-rRNA雜交的原理和方法基本相雜交的原理和方法

11、基本相同，只是在技術(shù)細節(jié)上有些差異，如同，只是在技術(shù)細節(jié)上有些差異，如DNA-rRNA雜交中，雜交中，用同位素標記的是用同位素標記的是rRNA而不是而不是DNA等等。等等。.13 核酸探針核酸探針 廣泛用于微生物鑒定、傳染病診斷、流行病調(diào)查、食品衛(wèi)生微生廣泛用于微生物鑒定、傳染病診斷、流行病調(diào)查、食品衛(wèi)生微生物檢測以及分子生物學許多領(lǐng)域。物檢測以及分子生物學許多領(lǐng)域。 所謂核酸探針所謂核酸探針(probe)是指能識別特異核苷酸序列的、帶標記的是指能識別特異核苷酸序列的、帶標記的一段單鏈一段單鏈DNA或或RNA分子。因此，一種核苷酸片斷能否作為探分子。因此，一種核苷酸片斷能否作為探針用于微生物鑒

12、定，最根本的條件是它的特異性，即它能與所檢針用于微生物鑒定，最根本的條件是它的特異性，即它能與所檢測的微生物的核酸雜交而不能與其他微生物的核酸雜交。測的微生物的核酸雜交而不能與其他微生物的核酸雜交。 根據(jù)特異性的不同，在微生物鑒定與檢測中的作用也不同，有的根據(jù)特異性的不同，在微生物鑒定與檢測中的作用也不同，有的探針只用于某一菌型的檢測，有的可能用于某一種、屬、科甚至探針只用于某一菌型的檢測，有的可能用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定。更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定。 例如，從一株淋病奈瑟氏菌例如，從一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隱蔽性質(zhì)隱蔽

13、性質(zhì)粒制備的粒制備的DNA探針，它具有種的特異性，可用來檢測和鑒定這探針，它具有種的特異性，可用來檢測和鑒定這種引起人類性行為傳播疾病的細菌。種引起人類性行為傳播疾病的細菌。.14 使用核酸探針來鑒定或檢測微生物的方法，是將探針與所檢測的使用核酸探針來鑒定或檢測微生物的方法，是將探針與所檢測的細菌進行雜交。在細菌鑒定或檢測臨床標本中的細菌時，常用菌細菌進行雜交。在細菌鑒定或檢測臨床標本中的細菌時，常用菌落原位雜交法，大致步驟是：將細菌落原位雜交法，大致步驟是：將細菌點種點種于硝酸纖維素膜上進行于硝酸纖維素膜上進行培養(yǎng)培養(yǎng)；加溶菌劑使細胞；加溶菌劑使細胞釋放出釋放出DNA分子分子；加變性劑使；加

14、變性劑使DNA離解離解成成單鏈單鏈并并固定固定于膜上；加入帶于膜上；加入帶標記標記的核酸探針進行的核酸探針進行雜交雜交；洗膜洗膜后后進行顯色或顯影進行顯色或顯影鑒定鑒定。 用核酸探針來鑒定或檢測微生物，具有準確、快速等優(yōu)點，特別用核酸探針來鑒定或檢測微生物，具有準確、快速等優(yōu)點，特別是當用常規(guī)方法難于鑒定和檢測時，往往更顯示其優(yōu)越性。是當用常規(guī)方法難于鑒定和檢測時，往往更顯示其優(yōu)越性。.15三、三、rRNArRNA寡核苷酸編目分析寡核苷酸編目分析利用利用16SrRNA16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家建立分子進化樹的美國科學家 Carl WoeseCarl Woese 60年代末年代末W

15、oese 開始采用寡開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細類，他通過比較各類生物細胞的核糖體胞的核糖體RNA(rRNA)特征特征序列，認為序列，認為16SrRNA及其類及其類似的似的rRNA基因序列作為生物基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。.16三、三、rRNArRNA寡核苷酸編目分析寡核苷酸編目分析 一種通過分析原核或真核細胞中最穩(wěn)一種通過分析原核或真核細胞中最穩(wěn)定的定的rRNArRNA寡核苷酸序列同源性程度，以寡核苷酸序列同源性程度，以確定不同生物間的親緣關(guān)系和進化譜系確定不同生物間的親緣關(guān)系和進化譜系的方法。的方法。是

16、是“三域?qū)W說三域?qū)W說”提出的科學根提出的科學根據(jù)。據(jù)。 .17選用選用rRNArRNA做生物進化和系統(tǒng)分類的原因做生物進化和系統(tǒng)分類的原因rRNArRNA普遍存在普遍存在, ,易于提取易于提取; ; rRNArRNA重要恒定的生理功能重要恒定的生理功能; ;在細胞中含量高，易于提取；在細胞中含量高，易于提??；編碼編碼rRNArRNA的基因在細胞中不像質(zhì)粒的基因在細胞中不像質(zhì)粒DNADNA那樣會轉(zhuǎn)移，而是十那樣會轉(zhuǎn)移，而是十分穩(wěn)定的分穩(wěn)定的 ；rRNArRNA某些核苷酸序列非常保守，歷經(jīng)進化仍能保持原初某些核苷酸序列非常保守，歷經(jīng)進化仍能保持原初相對分子量適中相對分子量適中原核生物原核生物rRN

17、ArRNA：23S23S（29002900）、）、16S16S（15401540）和和5S5S（120120） 真核生物真核生物rRNArRNA：28S28S（40004000）、）、18S18S（23002300）和和5.8S5.8S（160160）.18核糖體構(gòu)造和組分模式圖原核生物原核生物小亞基小亞基(30S)大亞基大亞基(50S)16S rRNA21種種核糖體蛋白核糖體蛋白23S rRNA34種種核糖體蛋白核糖體蛋白5S rRNA真核生物真核生物小亞基小亞基(40S)大亞基大亞基(60S)18S rRNA33種種核糖體蛋白核糖體蛋白28S rRNA51種種核糖體蛋白核糖體蛋白5.8S

18、rRNA.19 原理原理： 用一種用一種RNARNA水解酶水解水解酶水解rRNArRNA后，產(chǎn)生一系列長后，產(chǎn)生一系列長短不一的寡核苷酸片段，電泳分離，放射自顯影技短不一的寡核苷酸片段，電泳分離，放射自顯影技術(shù)獲得指紋圖譜，確定不同長度寡核苷酸斑點在電術(shù)獲得指紋圖譜，確定不同長度寡核苷酸斑點在電泳譜上的位置，泳譜上的位置，找出圖譜中鏈長在找出圖譜中鏈長在6 6個核苷酸以上個核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析的寡核苷酸片段作序列分析，獲得的結(jié)果進行按不，獲得的結(jié)果進行按不同長度進行編目、列表。通過比較、分析、計算，同長度進行編目、列表。通過比較、分析、計算，就可知道各菌株間的親緣關(guān)系大小。就可知

19、道各菌株間的親緣關(guān)系大小。 若兩種或兩株微生物的親緣關(guān)系越近，則其產(chǎn)若兩種或兩株微生物的親緣關(guān)系越近，則其產(chǎn)生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。rRNArRNA寡核苷酸寡核苷酸編目分析編目分析.20實驗過程：實驗過程： 將事先用將事先用3232P P標記的標記的被測菌株被測菌株rRNArRNA提純提純，用可專一水解，用可專一水解G G上上33端端磷酸酯鍵的磷酸酯鍵的T1RNAT1RNA酶酶進行水解，于是產(chǎn)生一系列以進行水解，于是產(chǎn)生一系列以G G為末端為末端的長的長度不一的度不一的寡核苷酸片段寡核苷酸片段，接著把它們進行雙向電泳分離，再用，接著把

20、它們進行雙向電泳分離，再用放射自顯影放射自顯影技術(shù)獲得技術(shù)獲得rRNArRNA寡核苷酸群的寡核苷酸群的指紋圖譜指紋圖譜，然后將圖譜，然后將圖譜中鏈長在中鏈長在6 6個核苷酸以上的個核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析，把獲得的結(jié)果寡核苷酸作序列分析，把獲得的結(jié)果按不同長度進行編目、列表。通過比較計算和分析，就可定量按不同長度進行編目、列表。通過比較計算和分析，就可定量地知道各被測菌株間的地知道各被測菌株間的親緣關(guān)系親緣關(guān)系。rRNArRNA寡核苷酸寡核苷酸編目分析編目分析.21培養(yǎng)微生物培養(yǎng)微生物提取基因組提取基因組DNADNArDNArDNA序列測定序列測定分析比較分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

21、微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系16S rDNA16S rDNA微生物鑒定流程微生物鑒定流程PCRPCR擴增擴增16S rDNA16S rDNA片段片段.22從樣品中分離提取總微生物從樣品中分離提取總微生物DNA 從樣品中提取微生物遺傳物質(zhì)DNA或RNA，這是進行PCR擴增16S rRNA的前提。 一種方法是直接提取總DNA，對易于培養(yǎng)的微生物可通過培養(yǎng)富集后再進行提取，另一種選擇是提取微生物細胞中的rRNA。RNA的提取技術(shù)相對于 DNA的提取較為復雜，一般多采用提取細胞總 DNA，但也可根據(jù)情況選擇提取 rRNA。.23PCRPCR擴增擴增16S rRNA16S rRNA基因片段基因片段 聚合酶鏈

22、式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)，又稱體外基因放大技術(shù)，是將，又稱體外基因放大技術(shù)，是將DNA樣本與寡樣本與寡核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷和耐熱的核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷和耐熱的TaqDNA聚合酶在一種適當?shù)木彌_聚合酶在一種適當?shù)木彌_液中混合，然后進行循環(huán)的擴增反應(yīng)。由于液中混合，然后進行循環(huán)的擴增反應(yīng)。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，現(xiàn)在技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，現(xiàn)在一般采用一般采用16S rRNA引物引物PCR擴增總擴增總DNA中的中的rRNA序列，或通過反轉(zhuǎn)錄序列，或通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得獲得cDNA序列后再進行分析。采用序列后再進行分析。采用PCR技術(shù)的優(yōu)點在于不僅一次性技術(shù)的優(yōu)點在于不僅一次性從混

23、合從混合DNA或或RNA樣品中擴增出樣品中擴增出16S rRNA序列，而且方便了后面的克隆序列，而且方便了后面的克隆和測序。但也同樣會出現(xiàn)和測序。但也同樣會出現(xiàn)PCR所固有的缺點，尤其是采用所固有的缺點，尤其是采用16S rRNA保守序保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進行擴增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物列的通用引物對多種微生物混合樣品進行擴增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(Chimeric product)和擴增偏嗜性現(xiàn)象，影響結(jié)果的分析。和擴增偏嗜性現(xiàn)象，影響結(jié)果的分析。 PCR擴增步驟如下：（擴增步驟如下：（1）雙鏈）雙鏈DNA（模板）加熱變性為單鏈；（模板）加熱變性為單鏈； （2）引物與模板）引物與模板

24、DNA單鏈結(jié)合；單鏈結(jié)合； ( 3) 引物延伸（擴增）。引物延伸（擴增）。 .24通過通過 16S rRNA16S rRNA基因片段分析對微生物進行分類鑒定基因片段分析對微生物進行分類鑒定16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下4種：一是將 PCR擴增后微生物16SrDNA序列，提交到GeneBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。GenBank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應(yīng)的微生物種類。與16S rRNA數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，確定其在進化樹中的位置二是通過16S rRNA種屬特異性的探針與 PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。此

25、外,探針也可以直接與樣品進行原位雜交檢測，通過原位雜交不僅可以測定微生物的形態(tài)特征和豐度，而且能夠分析它們的空間分布。三是對 PCR產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性分析(PCRRFLP)，通過觀察酶切電泳圖譜、數(shù)值分析，確定微生物基因的核糖體型，再同核糖體庫中的數(shù)據(jù)進行比較分析樣品中微生物組成或不同微生物的種屬關(guān)系，用以揭示微生物RFLP的多樣性。四是對PCR擴增產(chǎn)物進行梯度凝膠電泳分析，直接觀察其多樣性.25 通過通過T1RNAT1RNA酶的水解，一般可使酶的水解，一般可使rRNArRNA形成含有形成含有1 12020個核苷酸個核苷酸單位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一個核苷酸的片段稱為單位的

26、寡核苷酸片段。如果形象地把只含一個核苷酸的片段稱為“字母字母”的話，則含兩個以上核苷酸的片段就成了的話，則含兩個以上核苷酸的片段就成了“單詞單詞”。將。將含有含有6 6個個“字母字母”以上的所有以上的所有“單詞單詞”一一測定其核苷酸序列，一一測定其核苷酸序列，最后可把它們編成一部最后可把它們編成一部“詞典詞典”。于是，兩個茵株。于是，兩個茵株rRNArRNA的相似性的相似性就可通過查閱就可通過查閱“詞典詞典”來作比較。比較的具體方法是計算它們間來作比較。比較的具體方法是計算它們間的締合系數(shù)（的締合系數(shù)（associatedcoefficientassociatedcoefficient）或相關(guān)

27、系數(shù)）或相關(guān)系數(shù)SABSAB值：值： .26 上式中，上式中，N NABAB是是A A、B B兩被測菌株所共同具有的兩被測菌株所共同具有的“單詞單詞”的的“字母字母”數(shù)，而數(shù)，而N NA A和和N NB B則是兩株菌分別具有的則是兩株菌分別具有的“單詞單詞”的的“字母字母”數(shù)。根數(shù)。根據(jù)據(jù)S SABAB值進行數(shù)值分析，就可推知它們之間的親緣關(guān)系。值進行數(shù)值分析，就可推知它們之間的親緣關(guān)系。 它的作用很大，至今它的作用很大，至今WoeseWoese及其同事已對及其同事已對400400多株細菌和放線菌多株細菌和放線菌進行過分析，并從其中發(fā)現(xiàn)了生命的第三種形式進行過分析，并從其中發(fā)現(xiàn)了生命的第三種形式古細菌，古細菌，提出了生物界級分類中的提出了生物界級分類中的“三域?qū)W說三域?qū)W說” .27三域?qū)W說及其發(fā)展三域?qū)W說及其發(fā)展 1980（Woese） 16sRNA16sRNA共同的祖先共同的祖先古細菌域：產(chǎn)甲烷細菌、極端嗜鹽菌、極端嗜酸熱菌古細菌域：產(chǎn)甲烷細菌、極端嗜鹽菌、極端嗜酸熱菌真細菌域：除古細菌原界以外的細菌真細菌域：除古細菌原界以外的細菌真核生物域：原生生物、真菌、動物、植物真核生物域：原生生物、真菌、動物、植物.28嗜熱菌嗜熱菌真細菌原界真細菌原界紫色細菌紫色細菌G+細菌細菌綠色非綠色非硫細菌硫細菌藍細菌藍細菌