離子通道課件

1、植物細(xì)胞離子通道 植物根系不僅從土壤中吸收水分，還要吸收各種礦質(zhì)元素，以維持正常的生命活動(dòng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育目的獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì) 如：小麥、水稻、玉米、煙草、蔬菜、水果等植物吸收礦質(zhì)元素首先細(xì)胞從環(huán)境中吸收，這個(gè)環(huán)境可以是植物的生存外部環(huán)境，如土壤，也以是植物本身的內(nèi)部環(huán)境肥料離子吸附交換細(xì)胞被動(dòng)吸收：外液濃度細(xì)胞濃度 吸收主動(dòng)吸收：外液濃度細(xì)胞濃度 吸收 積累離子 被動(dòng)吸收：擴(kuò)散作用：指分子或離子沿著化學(xué)勢(shì)梯度或電化學(xué)勢(shì)梯度轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象 楞思特方程式： 協(xié)助擴(kuò)散：指小分子物資經(jīng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白順濃度梯度或電化學(xué)勢(shì)梯度的轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：膜上具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì)又稱傳遞蛋白分為二類：載體蛋白 通道蛋白載體蛋

2、白：是一類內(nèi)部蛋白，由載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)首先與載體蛋白的活性部位結(jié)合，結(jié)合后載體蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，被轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)釋放到細(xì)胞內(nèi)。載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)具有飽和現(xiàn)象。通道蛋白：由細(xì)胞膜中一類內(nèi)部蛋白構(gòu)成的孔道，或有的稱膜中由大分子組成的孔道又叫離子通道。可被化學(xué)方式或電化學(xué)方式激活，控制離子順勢(shì)流過細(xì)胞膜，在形成維持跨膜離子梯度和信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程起重要作用。檢測(cè)：膜片鉗技術(shù)取幾平方微米細(xì)胞膜或者全細(xì)胞膜，測(cè)定跨膜離子電流的大小，即在保持跨膜電壓恒定的條件下，測(cè)定通過膜上離子通道的離子流大小。其原理，歐姆定律 ： 分析膜上的離子通道，細(xì)胞間的離子運(yùn)輸，氣孔運(yùn)動(dòng)，光受體，激素受體，及信號(hào)傳導(dǎo)，廣泛應(yīng)用。細(xì)胞

3、壁 液泡 葉綠體 植物細(xì)胞膜系統(tǒng)質(zhì)膜葉綠體、線粒體等其他細(xì)胞器膜液泡膜植物吸收離子涉及到質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為兩類：載體蛋白也稱載體或轉(zhuǎn)運(yùn)體。它與特定的離子結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象變化，把離子轉(zhuǎn)運(yùn)過膜。通道蛋白也稱離子通道是由膜中大分子組成的孔道或是由膜中一類內(nèi)在蛋白組成的孔道。當(dāng)這些通道打開時(shí)，準(zhǔn)許特定的離子跨膜通過。植物離子通道的概念植物離子通道的概念1. 離子轉(zhuǎn)運(yùn)的被動(dòng)性2. 離子的選擇性和導(dǎo)度(離子導(dǎo)度：離子跨暯的能力，電阻的倒數(shù)，反應(yīng)通過離子通道通過離子多少。 )3. 通道門控特性4. 離子轉(zhuǎn)運(yùn)的高效性5. 飽和現(xiàn)象 （離子跨膜運(yùn)輸可 分 為被動(dòng)運(yùn)輸和主動(dòng)運(yùn)輸兩類。由 擴(kuò)散作用或物理

4、 過程所決定的運(yùn)輸屬于被動(dòng)運(yùn)輸；逆濃度梯度或電位梯度 運(yùn)輸 ，需要消耗能量屬于主動(dòng)運(yùn)輸。離子通道 與載體蛋白都能準(zhǔn)許離子沿濃度梯度或電勢(shì)梯度擴(kuò)散，但二者的轉(zhuǎn)運(yùn)離子的速度有明顯差異。載體蛋白每秒可轉(zhuǎn)運(yùn)104-105個(gè)離子，轉(zhuǎn)運(yùn)效率低，而離子通道秒可轉(zhuǎn)運(yùn)106-107個(gè)離子，高出1001000倍，轉(zhuǎn)運(yùn)效率高。原因：經(jīng)載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)離子需要與特定的離子結(jié)合，結(jié)合的部位數(shù)量有限，具有飽和現(xiàn)象，而離子通道則沒有。）植物離子通道的特點(diǎn)植物離子通道的特點(diǎn)根據(jù)影響離子通道開放的條件可將離子通道分為三大類:( 1) 電壓依賴性: 這種離子通道的開啟和關(guān)閉狀態(tài)取決于膜電位的電壓。細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀、鈣、氯通道都屬于電壓依

5、賴性通道。( 2) 配體門控性: 這種離子通道的開啟和關(guān)閉取決于各種遞質(zhì)與通道上受體的結(jié)合狀態(tài)。例如神經(jīng)細(xì)胞膜上的乙酰膽堿受體通道, 該通道的遞質(zhì)為乙酰膽堿, 其與特異性受體結(jié)合時(shí)則通道開放, 解離時(shí)則關(guān)閉。( 3) 機(jī)械敏感性: 由細(xì)胞膜表面的應(yīng)力變化控制通道的開放與關(guān)閉狀態(tài)。 其中以電壓依賴性通道最常見根據(jù)生物學(xué)功能的特性將離子通道分為三類: ( 1) 電壓門控的離子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等; ( 2) 受體激活的離子通道, 包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等外源性化學(xué)物質(zhì)以及機(jī)械和滲透壓力刺激所激活的離子通道; ( 3) 第二信使激活的離子通道, 包括由細(xì)胞內(nèi)Ca2+、IP3、G 蛋白

6、及蛋白激酶激活的離子通道。自從在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)植物離子通道以來，人們對(duì)植物細(xì)胞乃至作為細(xì)胞器的液泡膜上離子通道的認(rèn)識(shí)迅速深入,到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞及其內(nèi)膜上存在多種離子通道。陰離子通道陽離子通道植物細(xì)胞離子通道質(zhì)膜上的離子通道其他細(xì)胞器膜上的離子通道液泡膜上的離子通道陰離子通道K+通道內(nèi)向整流通道通道 : K+in外向整流通道通道 ：K+outCa2+通道道Cl- , NO3-1.慢流動(dòng)型通道(SV型)對(duì)陽離子具有選擇性,許多一價(jià)陽離子( K+ , Na+ , Cs+ ) 和二價(jià)陽離子(Ca2 + , Mg2 + , Ba2+ ) 都可通過此通道，而且Cl - 也能極少量的通過。

7、2.快流動(dòng)型通道(FV型) 具有電壓依賴性,對(duì)陽離子具有選擇性。3.鉀離子通道(VK) 與FV型通道類似,VK通道是一種不連續(xù)的瞬間激活的通道。它不具有電壓依賴性,這是該通道與FV 通道的最大區(qū)別。5. 陰離子通道電壓激活的液泡鈣(VVCa) 通道肌醇1 ,4 ,5-三磷酸( IP3) 門控的鈣通道cADPR 門控的液泡通道4. 鈣離子(VCa) 通道 蘋果酸(VMAL) 通道氯離子(VCl) 通道 內(nèi)向型K+通道AKT1結(jié)構(gòu)模型示意圖 具有6個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中S4結(jié)構(gòu)域具有電壓感應(yīng)作用，S5與S6之間有一個(gè)形狀如發(fā)卡的疏水區(qū)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成離子通道的孔道部分，具有結(jié)合離子的位點(diǎn)。鈣

8、離子通道調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)的模型1.離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn) 研究K離子吸收有二 種途徑：高親和性 K離子吸收途徑,一般濃度為1200molL-1范圍內(nèi)起作用 低親和性K離子吸收途，一般濃度為110molL-1范圍 內(nèi)起作用徑2.滲透和代謝調(diào)節(jié), 例如，氣孔運(yùn)動(dòng) 3.信號(hào)傳導(dǎo)， 例如，鈣離子是細(xì)胞中重要的第二信使之一4.調(diào)節(jié)膜電位，例如，植物細(xì)胞的動(dòng)作電位 5.決定細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)方向，鈣離子通道能調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)。植物體內(nèi)的離子通道參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育衰老死亡的全過程。保衛(wèi)細(xì)胞離子通道參與了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程離子通道分子水平的研究概況離子通道分子水平的研究概況 KATI：從擬南芥中鑒定出來的鉀離子運(yùn)輸

9、蛋白，是電壓依賴型內(nèi)向性通道，在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞和莖根的維管組織中表達(dá)，參與氣孔開發(fā)，并向維管組織中轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子，不能從土壤中吸收鉀離子。擬南芥中的KATI可編碼667個(gè)AA, 分子量為79KD. AKTI：從效母突變體中采用互補(bǔ)法篩選出來。在根組織中表達(dá)，能從土壤 中吸收鉀離子，可編碼856個(gè)AA, 分子量為97KD. 這兩個(gè)基因已導(dǎo)入水稻和煙草,具有較強(qiáng)吸收鉀離子能力. KCOI：從擬南芥數(shù)據(jù)庫中篩選出來的外向型鉀離子通道，轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子時(shí)依賴胞質(zhì)中鈣離子，在植物各個(gè)部位均有表達(dá)，在亞細(xì)胞水平上在液泡暯上。 LKTI：從西紅柿根毛特化的cDNA 庫克隆出來，LKTI 的 m RNA 在 根中表達(dá)。

10、 ZMK1 和 ZMK2：從玉米胚芽鞘中分離的鉀離子通道基因，ZMK1在外部酸性化時(shí)激活 Kin通道，ZMK2電壓依賴型。 TaAKTI：從小麥根中分離的，具有與擬南芥KATI氨基酸順序76%，屬于Kin通道。AtKUPI： 該基因是通過校母突變體 互補(bǔ)性分析得到的，呈現(xiàn) “兩相”形式，從高親和相Km 為44M性到低親合相Km值為11mM性的轉(zhuǎn)變范圍在100200M外界鉀離子濃度.高低和 親系統(tǒng)受到5mM 和更高濃度的抑制.也受到鉀離子通道阻斷劑的抑制,在根中表達(dá),不同鉀含量的土壤中吸收鉀.木質(zhì)部壁細(xì)胞含有3個(gè)陽離子通道： KORC： 為外向型鉀離子通道, 調(diào)節(jié)鉀從木質(zhì)部壁細(xì)胞釋放到導(dǎo)管中.

11、KIRC：為內(nèi)向型鉀離子通道,調(diào)節(jié)鉀從木質(zhì)部轉(zhuǎn)移到周圍壁細(xì)胞重新吸收 NORC： 非選擇性外向整流陽離子通道，能把鹽分釋放到木質(zhì)部的導(dǎo)管，還負(fù)責(zé)電信號(hào)和水力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)。 離子通道問題和展望離子通道問題和展望 生理作用調(diào)控的分子機(jī)理基因的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用電壓鉗技術(shù)示意圖電壓鉗技術(shù)是通過向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流, 抵消離子通道開放時(shí)所產(chǎn)生的離子流, 從而使細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值. 由于注射的電流與離子流大小相等、方向相反, 因此它可以反映離子流的大小和方向. 電壓鉗技術(shù)是一種研究可興奮細(xì)胞電生理特征的基本手段和方法, 但在應(yīng)用上具有其局限性: 1) 雙微電極鉗位法只適用于巨大的神經(jīng)軸突、肌肉纖維和卵母

12、細(xì)胞等較大的細(xì)胞, 對(duì)于直徑小于10 微米的細(xì)胞, 胞內(nèi)插入兩根電極就很困難, 雖然此時(shí)可用單根吸附電極進(jìn)行電壓鉗位, 但是對(duì)細(xì)胞膜的損傷也不可避免; 2) 只能采用全細(xì)胞記錄模式, 記錄到的是整個(gè)細(xì)胞膜上所有開放通道的電流總和, 無法了解單通道電流的情況; 3) 由于電壓鉗微電極尖端很細(xì)( 電阻大) , 會(huì)影響記錄電流的能力。膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極膜片電極或膜片吸管接觸細(xì)胞膜, 以千兆歐姆以上的阻抗使之封接, 使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域膜片與其周圍在電學(xué)上分隔, 在此基礎(chǔ)上固定電位, 對(duì)此膜片上的離子通道的離子電流（pA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法.單通道記錄法（Single chan

13、nel mode）:細(xì)胞吸附式(Cell-attached mode)、膜內(nèi)面向外 Inside -out）、膜外面向外(Outside-out)、開放的細(xì)胞吸附式膜內(nèi)面向外(Open cell-attached inside-out mode)和穿孔囊泡膜外面向外（Perforated-vesicle outside-out mode）;全細(xì)胞模式記錄法（Whole-cell mode）:孔細(xì)胞模式(Hole cell mode)、穿孔膜片模式(Perforated patch mode)或制真菌素膜片模(Nystatin patch mode)，也稱緩慢全細(xì)胞模式（Slow whole-c

14、ell mode ）。全細(xì)胞鉀離子通道電流單通道記錄鈣離子通道電流拋光儀拉制儀顯微鏡操作系統(tǒng)及可見光源膜片鉗放大器、操作系統(tǒng)冷光源低溫水浴搖床要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩碓耘嗖牧?。根?xì)胞：通常根長(zhǎng)度在2厘米左右，但突變體要根據(jù)該基因起作用的發(fā)育階段來確定；保衛(wèi)細(xì)胞：通常在土壤中生長(zhǎng)4-6周，但絕不能抽苔；葉肉細(xì)胞對(duì)光照要求較高，因?yàn)楣庹罩苯佑绊懭~綠體的活動(dòng)。蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞鉀通道實(shí)驗(yàn)溶液蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞鉀通道實(shí)驗(yàn)溶液（1）基本緩沖液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH)（2）基本介質(zhì)：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L

15、、抗壞血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。（3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白（BSA）0.25%，溶于45%的基本介質(zhì)中。（4）第二酶液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗壞血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介質(zhì)中。（5）細(xì)胞外液：谷氨酸鉀 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓

16、為460mOmol/Kg。（6）電極溶液：谷氨酸鉀 100mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓為510mOmol/Kg。 （1）在28、60轉(zhuǎn)/分的搖床上用酶解液解離0.5-2小時(shí)左右，根據(jù)不同消化時(shí)間的細(xì)胞狀態(tài)判斷消化程度，在顯微鏡下清晰地看到游離 細(xì)胞。（2）用200目尼龍網(wǎng)過濾，基本介質(zhì)沖洗后60g離心7-10分鐘，棄去上清液，再用50基本介質(zhì)洗滌2-3次，最后將原生質(zhì)懸浮于溶液中，04靜置恢復(fù)。原生質(zhì)體的制備（1）玻璃微

17、電極使用硬質(zhì)有芯玻璃毛細(xì)管在拉制儀（PC-10,Narishige）上拉制，實(shí)驗(yàn)前用拋光儀（MF-900，Narishige）進(jìn)行拋光。（2）通過顯微操作系統(tǒng)將電極在加正壓情況下輕微壓在細(xì)胞上，再加以負(fù)壓使電極尖端與細(xì)胞膜形成高阻封接。一般情況下，高阻封接在1-3G之間，刺激電壓從-190mV逐級(jí)去極化到+110mV，每級(jí)為+20mV，維持時(shí)間3秒，頻率為0.2Hz。全細(xì)胞封接形成10分鐘后采集數(shù)據(jù)。膜片鉗實(shí)驗(yàn)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5-200-160-120-80-4004080120+90mV-170mV-190mVAVoltage(mV)Time(min)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5-1000-800-600-400-2000200400600BCurrent(pA)Time(min)0.00.51.01.52.02.53.03.54.0-1200-1000-800-600-400-2000200400BCurrent(pA)Time(min)膜電流：膜電流：指流過細(xì)胞膜上所有活動(dòng)性離子通道的復(fù)合電流。濃度梯度：濃度梯度：膜兩側(cè)離子的濃度差，即化學(xué)勢(shì)梯度。電位差：電位差：即電勢(shì)差，跨過膜的電位差。平衡電位：平衡電位：離子跨膜