醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-上課用-7.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析方法

1、第七章 基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析方法第一節(jié) DNA序列分析一、雙脫氧末端終止法二、化學(xué)降解法三、DNA自動化序列分析四、新一代DNA測序分析一、雙脫氧末端終止法DNA合成反應(yīng)ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)1. 雙脫氧末端終止法原理 DNA合成反應(yīng)中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5-P端形成3,5-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP.7DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)能分離長度為300-500bp，差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸片段8ddCTPddATPdd

2、TTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5 T4711G A A T G A 3ACG CT2. DNA測序主要步驟 單鏈DNA模板的制備 DNA模板與測序引物退火 摻入法標(biāo)記反應(yīng)（如：-35S） 延伸-終止反應(yīng) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 放射自顯影 閱讀測序結(jié)果二、化學(xué)降解法 將待測DNA片段3或5端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA片段分成四個反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。13ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACG CT三、DNA自動化序列分析 利

3、用雙脫氧末端終止法的原理 用熒光化合物分別標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA測序自動化的基礎(chǔ)。DNA自動測序步驟4種有不同熒光燃料標(biāo)記的ddNTPsSanger測序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光熒光信號采集，計算機分析與DNA自動排序Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 四、新一代DNA測序技術(shù) 基于循環(huán)芯片測序法 高通量、測序成本低 焦磷酸測序法 SOLiD分析系統(tǒng)：準(zhǔn)確度最高 Illumina測序儀第二節(jié) 核酸分子雜交（Nucle

4、ic Acid Hybridization）一、核酸分子雜交原理二、Southern印跡雜交三、Northern印跡雜交四、斑點雜交五、原位分子雜交六、液相雜交一、核酸分子雜交原理 指兩條互補單鏈核酸在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。 雜交雙方是探針與待測核酸序列。探針探針 + 待測核酸待測核酸 雜交雙鏈雜交雙鏈（一）印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍膜、化學(xué)活化膜、濾紙等各種膜上，使之成為固化分子。（二）探針標(biāo)記技術(shù) 用放射性同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記序列已知的多聚核苷酸鏈稱為探針。二、Southern印跡雜交（Southern blo

5、tting） 將電泳分離的待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。 用于DNA定性定量分析，基因突變分析，及RFLP分析等提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southern印跡雜交 檢測靶分子為DNA, 檢測靶分子是否含有目的基因。 預(yù)雜交三、Northern印跡雜交（Northern blotting） 將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及大小。 用于mRNA定性和定量分析，即基因表達(dá)分析。優(yōu)點：簡單、迅速 可在同一張膜上進(jìn)

6、行多個樣品的檢測 核酸粗提樣品的檢測效果也較好四、斑點雜交五、原位雜交in situ hybridization用于核酸定性、定位分析。 菌落原位雜交 熒光原位雜交核 酸 雜 交 分 類 表雜交方法適 用 范 圍Southern 印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern 印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點印跡雜交檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子 與固相雜交的區(qū)別：直接在液體中雜交，不用純化或固定靶分子，雜交步驟更簡化，雜交速度有所提高，反應(yīng)的敏感性和特異性更強。 1核酸酶S1保護(hù)分析法 2RNA

7、酶保護(hù)分析法六、液相雜交技術(shù) 利用M13噬菌體合成放射性的ssDNA探針。 探針與待測RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能專一 性地降解未形成雜交的DNA和RNA單鏈，不降解DNA/RNA雙鏈。 還可用于基因轉(zhuǎn)錄起始點分析、內(nèi)含子剪切位點分析。 1核酸酶S1保護(hù)分析法（nuclease S1 protection assay）目的：檢測RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern雜交靈敏度更高。原理：探針為ssRNA，雜交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1專一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。2RNA酶保護(hù)分析法（RPA)第三節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Po

8、lymerase Chain Reaction，PCR）一、PCR技術(shù)原理二、耐熱DNA聚合酶三、PCR引物設(shè)計原則四、PCR條件的優(yōu)化五、PCR改進(jìn)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) :一、PCR技術(shù)原理 Mullis K. 1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴增技術(shù)。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 1. PCR循環(huán)由三步組成： 變性（denaturation）：9398 退火(annealing)：3765 延伸(extension)：7075 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Te

9、mplate DNA5 5 5 5 5 5 5 5 反應(yīng)步驟反應(yīng)步驟示意圖示意圖Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。2. PCR擴增終產(chǎn)物大小: 介于兩條退火引物5末端之間的雙鏈DNA片段。循環(huán)一循環(huán)二循環(huán)三一對引物：正向和反向限制了PCR擴增的片段的范圍 5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCG

10、GATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGC3GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT 3. 引物設(shè)計實例 Y=A（1+E）n Y: 擴增產(chǎn)物的量 A: 最初靶DNA分子

11、數(shù) E: PCR擴增效率 n: 循環(huán)次數(shù) 4. PCR產(chǎn)量 當(dāng)E100, A=1時 Y=2n 2n(引物延伸產(chǎn)物的量）PCR thermal cyclerPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR產(chǎn)物產(chǎn)物5. 平臺期與平臺效應(yīng) PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入線性增長期或靜止期，即平臺效應(yīng)。影響因素： 引物及dNTP底物濃度降低。 酶與模板比例下降。PCR平臺效應(yīng)平臺效應(yīng)實際應(yīng)用提示： 定量PCR應(yīng)考慮平臺期效應(yīng)，選擇最適循環(huán)次數(shù)。二、耐熱DNA聚合酶1. Taq D

12、NA聚合酶（實現(xiàn)了PCR自動化） 95的半衰期: 40 min 最適溫度: 72 80 催化反應(yīng)速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子Taq DNA聚合酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性；l 逆轉(zhuǎn)錄酶活性； 較弱的非模板依賴性； 缺乏35外切酶活性，無校正功能。2. 無機離子及抑制劑的影響 Taq DNA聚合酶的活性對Mg 2+ 濃度和單價離子（K+或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。 最適Mg 2+濃度：2 mmol/L K+濃度：50 mmol/L如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？（1）使用Taq DNA聚合酶時，摻入少量具有35外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，錯配率可降為原來

13、的1/10。（2）使四種dNTP底物濃度相等；（3）MgCl2濃度盡可能低；（4）減少循環(huán)數(shù)。3. 幾種高保真的耐熱DNA聚合酶u Tth DNA聚合酶u Vent DNA聚合酶u Pfu DNA聚合酶三、PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計是決定PCR特異性擴增的關(guān)鍵。PCR引物設(shè)計原則：1. 引物與模板的序列緊密互補2. 引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)3. 引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(錯配)5CACTGAACGTAGGCCT3 3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5特異擴增5CACTGAACGTAGGCCT33GGATCTACATGCGACTTA

14、ATCCGGAGATACC5錯誤引發(fā)p 引物與模板的序列要緊密互補p 引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反應(yīng)(錯配)（1）引物之間應(yīng)避免3端互補p 引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)（2）引物自身不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)PCR引物設(shè)計原則: 引物長度: 1030 nt 堿基分布: A、T、G、C 隨機分布 G+C含量：40 60%，Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物之間：避免3末端互補 引物自身：不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu) 引物3末端堿基：最好選T/C/G 5末端堿基：可不與模板DNA互補模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+退火退火變性變性延伸延伸PCR反應(yīng)體系：四、PCR條件的優(yōu)化1.

15、 Taq DNA聚合酶濃度： 1.02.5 U/100 l反應(yīng)液 2. dNTP濃度：20200 mol/L 3. Mg2+濃度：0.52.5 mmol/L 4. 引物濃度：0.10.5 mol/LPCR條件的優(yōu)化五、PCR改進(jìn)技術(shù)1. 反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR， RT-PCR) 以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最適溫度42 MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最適溫度37 2. 定量RT-PCR（

16、QRT-PCR）半定量RT-PCR 以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在不同引物對引導(dǎo)下共同PCR擴增“管家”基因和目的基因cDNA 。（1）選擇內(nèi)對照基因 組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。（2）半定量標(biāo)準(zhǔn) 計算PCR 產(chǎn)物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA（3）KPNA2在正常生理狀態(tài)東方田鼠和小鼠體內(nèi)表達(dá)分析3. 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR） PCR擴增指數(shù)期內(nèi)極小的擴增效率改變會極大地影響產(chǎn)量。 應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRN

17、A表達(dá)定量分析。 67（1）SYBR Green法q SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位q SYBR Green只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光q 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBR Green發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號pSYBR Green 69p與目標(biāo)序列互補與目標(biāo)序列互補（2）TaqMan法法TaqMan-水解型熒光標(biāo)記探針?biāo)庑蜔晒鈽?biāo)記探針v 探針完整，探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸基團(tuán)吸收收 ，無熒光，無熒光， R與與Q分開，發(fā)熒光分開，發(fā)熒光vTaq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探外切核酸酶活性，

18、可水解探針針。（3）分子信標(biāo)探針（Molecular Beacon, TM） 該探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。探針與靶序列雜交結(jié)合，報告熒光染料與淬滅染料分離，發(fā)出熒光。（4）實時熒光定量PCR計算原理PCR擴增效率的差異使相同的樣品最終產(chǎn)量有很大差異CT或或Tc或或Ct值：值： 臨界點循環(huán)（臨界點循環(huán)（Threshold cycle ），即從基線到），即從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù) 傳染病診斷、監(jiān)測與療效預(yù)后評估：傳染病診斷、監(jiān)測與療效預(yù)后評估： 揭示疾病發(fā)病機制揭示疾病發(fā)病機制熒光定量 PCR儀 帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)

19、的PCR儀，配有電腦系統(tǒng)及分析軟件。六、其它PCR技術(shù)1. 反向PCR(inverse PCR) 對已知片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴增和研究。2. Alu-PCR 利用Alu高度保守序列設(shè)計引物擴增哺乳動物未知DNA片段的方法。 3. 原位PCR(in-situ PCR) 是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。4. 巢式PCR（nested PCR） 兩對引物：內(nèi)引物、外引物 可檢出低拷貝原始模板。 5. 不對稱PCR（asymmetric PCR） 通過擴增可獲得特異單鏈DNA，用作雜交探針或DNA測序模板。6. PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-single strand conformation po