生物芯片診斷系統(tǒng)應用指南(系統(tǒng)篇)

1、生物芯片診斷系統(tǒng)應用指南(系統(tǒng)篇)深圳欣康基因數碼科技有限公司 生物芯片技術的應用是醫(yī)學發(fā)展的必然趨勢從生物信息角度看傳統(tǒng)醫(yī)學是在下游信息即機體表型（癥狀、病理、生理）上獲得診斷信息的，而未來醫(yī)學是從DNA、RNA、蛋白質這些上游信息中獲得診斷結果的，更具有確定性和預見性。未來的醫(yī)學是以生物信息為核心的分子醫(yī)學，DNA、RNA、蛋白質稱為生物信息大分子，其質和量的異常變化與疾病直接相關，是一切疾病的根本原因。然而生物信息所包含的信息量十分巨大，根本無法用傳統(tǒng)的方法處理，為此, 生物芯片，一項將計算機芯片制作技術與生命科學研究相結合的新興技術應運而生了！生物芯片是指采用光導原位合成或微量點樣等方

2、法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、生物膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機（CCD）對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量。生物芯片技術是九十年代初應人類基因組計劃而在美國率先發(fā)展起來的一項高新技術。經過十年的發(fā)展，該技術已顯示出極其廣闊的應用前景。作為新一代生物技術，將從根本上改變目前生物學和生物技術的觀念和效率，它將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學技術革命，它將改變生命科學的研究方式

3、，革新醫(yī)學診斷和治療。可以相信，生物芯片技術應用于臨床診斷是診斷技術的一次革命性進步、是未來醫(yī)學發(fā)展的必然趨勢。欣康生物芯片診斷系統(tǒng)是深圳欣康公司依托第四軍醫(yī)大學開發(fā)，國內首批具有國家批準資質和自主知識產權的醫(yī)學臨床生物芯片檢測技術，其整合了生物技術、芯片技術、光機電技術、軟件和網絡技術等諸多高新技術，相當于一個“流動的臨床檢測中心”，可以覆蓋大多數臨床常見病、多發(fā)病、極大地提高醫(yī)院的診斷水平，為患者提供集成化、網絡化臨床分子診斷整體解決方案。應用生物芯片診斷系統(tǒng)結構和功能欣康生物芯片診斷系統(tǒng)由生物芯片、生物芯片閱讀儀（XK-2100型）和生物芯片在線等三部分組成。欣康生物芯片目前主要為蛋白芯

4、片，采用基因工程表達、天然提純和人工合成待測微生物（或目標蛋白）的特異性抗原（抗體），將抗原或抗體以微矩陣形式固定于硝酸纖維素膜（NC膜）上，待檢標本中的特異性抗體（抗原）與之發(fā)生特異性免疫結合反應，并在NC膜上形成抗原-抗體免疫復合物，再用金標記或酶標記的二抗與該復合物特異性結合，直接顯色或者催化相關底物顯色，最終產生生物芯片閱讀儀可捕捉和分析的信號。XK-2100型生物芯片閱讀儀集光學、機電、生物醫(yī)學、計算機、影像學等多學科技術于一體，配備MARA生物芯片分析軟件，將生物芯片產生的信號通過圖像采集、光電模數轉換和量化后形成數字化的圖像文件，從而實現對生物信號定性和定量的分析。閱讀儀一次能讀

5、取6張芯片數據，自動一鍵式取樣分析和出具檢測報告，大大縮短檢測時間；同時該軟件還具有芯片圖像儲存、分析、報告、統(tǒng)計和日常管理等多種功能，靈活的管理系統(tǒng)可幫助您建立一個豐富的芯片檢測結果和病歷資料數據庫。生物芯片在線作為生物芯片技術在線服務網絡，隨著生物芯片的推廣應用，將成為一個具備芯片技術推廣與產品銷售、健康咨詢與教育、遠程診斷與分析等多功能的大型醫(yī)學數據庫和健康服務網絡。 生物芯片診斷芯片的應用整體系統(tǒng)應用流程圖解見下圖1，幽門螺桿菌(Hp)微矩陣抗體檢測試劑盒操作說明書（舉例，部分）見圖2，閱讀儀和軟件操作（主要界面）見圖3樣品準備和處理（膜片、血清）加血清反應洗滌加標記抗體或二抗洗滌顯色

6、（金標或酶標）送入生物閱讀儀輸入患者資料軟件計算分析檢測報告輸出（主要過程自動完成）圖1：生物芯片診斷系統(tǒng)操作流程圖解幽門螺桿菌(Hp)微矩陣抗體檢測試劑盒說明書。【使用目的】幽門螺桿菌Hp是引起慢性活動性胃炎的主要病原菌，是消化性潰瘍病的主要致病因子，也是胃癌發(fā)生的一個重要協(xié)同因子。Hp微矩陣抗體檢測試劑盒可同時一次檢測Hp的多種血清學標志（抗CagA、抗VacA、抗Ure、抗RdxA、抗Hsp60等抗體）。用于Hp感染的流行病學調查和臨床的輔助診斷?！驹囼炘怼坑拈T螺桿菌微矩陣采用基因工程技術表達Hp特異性抗原(CagA、VacA、Ure、RdxA、Hsp60)，將具有抗原性的蛋白以方陣形

7、式固定于硝酸纖維素膜(NC膜)上，待檢標本中的特異性抗體與之發(fā)生特異性免疫結合反應，并在NC膜上形成抗原抗體免疫復合物，再用膠體金標記的葡萄球菌A蛋白(作為二抗)與該免疫復合物特異性結合，最終出現肉眼可見的紅色斑點?！局饕M成成份】Hp微矩陣 10片 洗滌液(8ml瓶) 1瓶標記物(2.5ml) 1瓶 使用說明書 1份【適用儀器】 XK-2100生物芯片閱讀儀（注冊號：粵藥管械（試）字2003第2050009號）【樣本要求】采集靜脈血1ml盛于干燥管中，離心分離血清。血清可以立刻進行檢測試驗；如不立刻作試驗，可將分離的血清放置4保存(可放置3天)，或放置-20長期保存。【試驗方法】在微矩陣窗口

8、內加洗滌液(約150l)，均勻濕潤所有膜面；取待檢血清100ul，用移樣器均勻加入微矩陣檢測窗口內所有膜面，待血清滲入后，再加洗滌液(300l)，洗去殘留的血清。將標記物(200l)，均勻加入窗口內所有膜面，待滲入后，再加洗滌液，洗去窗口膜面上殘留的標記物。顯色后的微矩陣應在30分鐘內用閱讀儀進行結果判定。圖2：幽門螺桿菌(Hp)微矩陣抗體檢測試劑盒操作說明書（部分）資料輸入界面檢測界面報告界面圖3：閱讀儀和軟件運行（主要界面）生物芯片操作要點：1、 根據臨床檢測需要選擇不同的生物芯片種類，芯片的分類和具體應用請見生物芯片應用指南。2、 目前芯片檢測的樣本為血清，但隨著芯片研發(fā)的深入和品種的需

9、求，樣本的種類也將會不斷拓展。為保證反應的特異性和免受過多干擾，建議使用新鮮血清，并在使用前離心，離心轉速5000rpm；如使用較長時間存放的血清，離心轉速應大于8000rpm。3、 為保證芯片上反應的順暢進行和減少非特異性反應，在芯片操作過程中需要反復洗滌芯片數次。4、 目前大部分芯片會在10分鐘內反應完成并顯色，部分芯片需要時間在20分鐘左右。5、 欣康公司產品工程師將負責生物芯片閱讀儀及分析軟件的安裝、調試和培訓工作，確保系統(tǒng)正常和正確使用。具體見生物芯片閱讀儀和軟件操作使用說明書（隨機安裝于電腦中）。6、 軟件操作時需要輸入患者資料和檢測參數，患者資料包括姓名、年齡等；檢測參數將隨生物

10、芯片使用說明書附上，主要包括cutoff值（用于界定陰陽性）、kb系統(tǒng)值（用于定量分析標準曲線設定）、critical值（用于定量分析中分段函數界定等），每批芯片的參數可能均有變化，使用前請注意。檢測參數的具體含義和使用見下文。7、 輸入完成后，按檢測鍵，所有操作將可以自動完成，包括自動取樣攝像、自動計算分析、自動保存和自動打印檢測報告。如不需自動或者對某部分不需自動操作，軟件提供了個性化設置界面，自行選擇。8、 軟件設有統(tǒng)計和數據庫功能，醫(yī)生可以使用統(tǒng)計功能根據所選擇的項目進行統(tǒng)計計算，數據庫中存儲了所有檢測過的資料，方便進行對檢測結果進行定性定量化數據查詢和調用關于檢測參數的制定、使用和檢

11、測的定性、定量分析1、 cutoff值（本節(jié)簡稱cf）cf主要用于定性和半定量分析，在抗體檢測中經常使用，通過比較檢測結果的數據和cf判斷檢測的陰陽性，大于cf為陽性，小于為陰性，在cf上下5范圍為臨界區(qū)域。見下圖示意cutoff臨界區(qū)域圖4：弓形蟲抗體檢測及cutoff（示意）Cf按照國家標準，通過大量陰性血清檢測并對數據進行統(tǒng)計處理獲得。Cf本質和檢測結果的敏感性和特異性相關，并具備一定的調節(jié)范圍。如需檢測獲得更高的敏感性，則可以考慮適當調低cf；如需嚴格控制檢測的特異性，則可以考慮適當調高cf。具體應用中一般不建議調節(jié)cf，如科研考慮或者特殊要求，請與公司客服部門和技術部門聯(lián)系。檢測項目

12、的檢測數據和cf的配合使用可以應用于抗體的半定量分析，設定一個Y值，YX（檢測數據）cf）/cf，反應抗體水平的相對高低，在檢測報表中的圖表上顯示，可以輔助醫(yī)生進行縱向比較患者一個階段的抗體水平變化和橫向比較同類患者的抗體水平，更好的判斷病情病程和治療預后方案。2、 kb系統(tǒng)值（本節(jié)簡稱kb）kb主要用于定量分析中標準曲線制定，在蛋白定量檢測中經常使用。定量分析蛋白水平，傳統(tǒng)上一般需要每次自行繪制標準曲線。使用本公司的蛋白芯片進行定量分析，標準曲線不需要每次自行繪制，而由本公司直接提供相關參數并存于電腦中，在檢測過程中自動分析并轉化為蛋白的絕對濃度指標顯示于檢測報告單中圖5：蛋白芯片定量檢測示

13、意為配套定量分析，本公司將使用國家或者國際標準品連續(xù)多次進行測試并計算，繪制標準曲線并取得kb，標準曲線一般均以直線模式提供，見示意圖。當然，標準曲線因檢測蛋白和方案不同可能有多種圖形，本公司將盡可能轉化為直線模型，轉化的程序也將內含于軟件中而不需要檢測人員特別輸入。如有個別或特殊的無法以直線模型提供標準曲線，公司提供的檢測參數將特別說明。3、 critical值critical主要用于標準曲線中分段函數或者分點計算的界定。使用蛋白芯片定量分析蛋白水平，將有可能比傳統(tǒng)方案更大的擴大檢測的范圍（幾倍、10倍、100倍），這種擴大的實現，可能是通過分段函數和分點計算的模式，critical提供了界

14、限值，程序將自動根據該值判斷計算。Critical的制定類似于kb的制定。4、 其他在檢測過程中，軟件將顯示蛋白的3維分析圖形（見圖1的軟件顯示），有利于醫(yī)生更全面的把握生物芯片反應和檢測結果。根據檢測項目的個性化原因還存在一些其他參數，如唐氏檢測過程中的默認中位值參數等，均已經內含于相關專用軟件之中，不需特別輸入。其他的檢測參數相信也會隨著蛋白研究的深入和生物芯片種類的增多逐步出現，一般而言會采取內含形式出現，從而幫助更為準確的分析和判斷。關于檢測報告單的解讀1區(qū)2區(qū)3區(qū)1區(qū)2區(qū)3區(qū)圖6：生物芯片診斷報告單（舉例）生物芯片診斷系統(tǒng)由軟件安排出具和打印檢驗報告單，格式根據檢測對象會略有變化，圖

15、4是報告單的典型格式的示意（性傳播疾病抗體檢測結果報告單和唐氏綜合征檢測結果報告單）。1區(qū)為信息區(qū)。如圖所示包括患者姓名、性別、年齡，檢測醫(yī)生和送檢醫(yī)生的姓名等信息，這些信息是由軟件中原輸入的資料所決定，不需重新輸入。2區(qū)為檢驗結果區(qū)，顯示所操作的生物芯片中各項目的檢驗結果。目前抗體的檢測結果采取定性方式顯示，包括“”（陽性）、“”（陰性）、“”（臨界）3種結果，各項指標均以該方式顯示，如上圖顯示梅毒抗體的檢測結果為陰性；定量分析中目標蛋白的檢測結果，一般采取定量方式顯示，直接給出檢測的絕對數值，單位根據情況有多種形式，如ng/ml、IU/ml、MOM等，如上圖顯示AFP的檢測結果為20.21

16、IU/ml。3區(qū)為定性定量分析圖表，以圖表形式更深入詮釋和分析檢驗結果。在抗體檢測的圖表中，以半定量結果分析為依據（具體模式見本文中cutoff一節(jié)），項目檢驗數據小于cutoff代表陰性，不顯示計算數據；大于cutoff為陽性，以半定量計算數據在曲線旁邊顯示，如上圖中CT半定量數據為0.5，UU半定量數據2.6。同時醫(yī)生也可以根據患者連續(xù)檢測中半定量數據的變化結合其他情況對病情綜合判斷。根據公司內部技術標準設定3處參考，臨界區(qū)代表檢測數據在cutoff上下5范圍內的樣本，為臨界血清（樣本），其檢測結果可能會因檢測的重復性影響在cutoff值附近波動，甚至引致重復檢測該樣本時，陰陽結果交替出現

17、的現象，需謹慎處理。弱陽線和強陽線參考為判斷抗體強弱的依據，高于強陽線為抗體數量高，反應強烈；低于弱陽線為抗體數量少，反應微弱，甚至反應可能為較強的非特異性反應，處理結果應帶有一定的謹慎性。這3處參考是公司根據大量的臨床檢測統(tǒng)計設定，作為醫(yī)生檢驗時的臨床判斷參考，但不能作為絕對標準。在目標蛋白的定量檢測中，直接在圖標曲線旁顯示該蛋白的絕對定量數據或者標識測試結果的計算結果，如上圖所示，HCG的MOM為1.98，唐氏綜合風險為1/1447；同時，也會在圖表上配置相關的標準參數，如唐氏風險的判斷閾值1/275即標識于圖表中。生物芯片有關性能指標的說明準確性芯片檢測的準確性指標是指標檢測的敏感性和特

18、異性指標的總稱。準確性的計算是隨機選擇血清標本通過與國家國際標準品的對照，或者通過已經審批通過的檢測試劑盒的對照，在此基礎上的測算。限于篇幅，僅舉例說明方法和過程。分別使用德國RECI的優(yōu)生優(yōu)育系列ELISA試劑盒、美國ZEUS的優(yōu)生優(yōu)育系列ELISA試劑盒對收集的血清標本進行IgG抗體檢測，選取其中兩者結果相一致的血清200人份，再次使用TORCH生物芯片實施檢測，最后以ZEUS試劑盒檢測結果為標準計算生物芯片檢測的準確性指標，結果數據見下表：微矩陣（CMV）ZEUS ELISA試劑盒小計陽性陰性陽性1620162陰性142438合計17624200巨細胞病毒準確性指標：敏感性= 92%；特

19、異度=100%；YI指數=敏感性+特異度-1=0.92。微矩陣（RV）ZEUS ELISA試劑盒小計陽性陰性陽性1647171陰性92029合計17327200風疹病毒準確性指標：敏感性= 94.8%；特異度=74.1%；YI指數=敏感性+特異度-1=0.689。微矩陣（TOX）ZEUS ELISA試劑盒小計陽性陰性陽性101陰性0199199合計1199200弓形蟲準確性指標：敏感性= 100%；特異度=100%；YI指數=敏感性+特異度-1=1。微矩陣（HSV-）ZEUS ELISA試劑盒小計陽性陰性陽性591473陰性9118127合計68132200單泡病毒準確性指標：敏感性= 86.

20、8%；特異度=89.4%；YI指數=敏感性+特異度-1=0.762。表1：TORCH檢測芯片準確性對照試驗重復性（精密度）重復性是針對一份相同標本血清同時多次檢測所得結果的差異而言，差異越小，重復性越好。定性檢測中可以使用陰性結果和陽性結果的比率，也可以使用總比率表示；定量檢測中一般使用差異系數CV表示，CVS/X（S：多次檢測的標準差，X：檢測平均值）。臨床檢測中重復性是和準確性同樣重要的指標。蛋白芯片的檢測重復性只與整體系統(tǒng)的性能相關，而與具體哪種芯片、哪種檢測項目沒有關系，是芯片平臺技術的直接體現。影響芯片重復性的因素包括生物芯片點樣、載體、標記、芯片組裝、反應和芯片閱讀儀圖像采集和數據

21、化性能。由于芯片系統(tǒng)具備數據化的突出能力，一般使用CV表示芯片的重復性。如上所述，我們采取一種蛋白抗體的檢測介紹芯片的重復性。選用幽門螺桿菌中的CagA抗體檢測指標，生產3批該芯片，然后挑取10份已知陽性血清，每份血清均從這3批芯片中每批隨機挑選6張芯片共18張芯片，同時檢測完成后使用芯片閱讀儀分析檢測結果，并分別計算每份血清的批間CV（3批綜合計算）和批內CV（每一批分別計算），結果見下圖表。 批次血號批內CV(%)批間CV(%)檢測平均值ABC13.24.64.35.4125.425.76.75.87.577.035.35.85.56.3106.547.43.88.48.762.654.5

22、5.14.45.7111.365.88.06.98.855.177.68.84.29.845.386.35.76.27.372.195.46.74.26.889.9107.67.46.28.350.4表2：Hp檢測芯片重復性試驗圖7：生物芯片檢測的重復性（CagA,陽性血清）經多次反復使用上述模式（檢測指標不同）測算，生物芯片平均CV<15，重復性強于大多數傳統(tǒng)檢測方法。同時可以看出：CV和批間批內相關，批間CV大于批內CV；CV和芯片讀值相關，讀值越高，CV越低。定量重復性的特點顯示，對于較明顯的陽性和陰性血清，定性檢測結果的重復性是100；但對于比較接近cutoff值的血清，在定性檢

23、測中是可能出現陰陽并存的，也是需要引起檢測人員特別注意和謹慎處理的。靈敏度主要用于項目的定量檢測。靈敏度是指抗體或者抗原蛋白的最低檢測量，一般使用質量濃度或者效價表示，如ng/ml，1：512等。靈敏度不僅和生物芯片平臺技術相關，也和具體檢測的抗體和蛋白指標相關。經多次定量方面的研究，目前生物芯片診斷系統(tǒng)可以達到1ng/ml的檢測靈敏度，和ELISA方法相當。產品設計中會根據檢測目標的情況和要求去調節(jié)設定靈敏度。如心梗聯(lián)檢中肌鈣蛋白I的靈敏度為1ng/ml，肌紅蛋白的靈敏度為100ng/ml。線性范圍（檢測范圍）在項目的定量檢測中可能出現該指標。因項目不同而不同。線性范圍是指檢測過程中對目標能夠準確定量的范圍，包括上限和下限。生物芯片由于實施多點組合和具備強大的數據分析計算能力，在某些項