第六章重組體的篩選與鑒定2008-1

1、轉(zhuǎn)化子和重組子轉(zhuǎn)化子：將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子成為重組子。如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽(yáng)性克隆子或期望克隆子選擇 (selection) 篩選 (screening)選擇：通過(guò)外來(lái)附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。篩選：通過(guò)特定的方法，例如核酸雜交以及免疫測(cè)定，從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中，鑒定出真正是所需重組DNA分子的特定克隆過(guò)程由于被篩選的大量的菌落和噬菌斑當(dāng)中，僅有很少的比例含有期望的重組DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特異的篩選方法。 根據(jù)所使用克隆載體的特性不同

2、，重組克隆的篩選方法根據(jù)所使用克隆載體的特性不同，重組克隆的篩選方法也多種多樣。比如，用噬菌體也多種多樣。比如，用噬菌體DNA作為載體時(shí)就不需要篩作為載體時(shí)就不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當(dāng)使用選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當(dāng)使用pUC系列載體系列載體時(shí)，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質(zhì)粒并不具備時(shí)，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質(zhì)粒并不具備明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用DNA的酶切分析進(jìn)的酶切分析進(jìn)行直接鑒定。比如，從平板上隨機(jī)挑選行直接鑒定。比如，從平板上隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，然后提個(gè)菌落，然后提取其中的質(zhì)粒取其中的質(zhì)粒DNA分子，并

3、對(duì)其進(jìn)行酶切分析，同樣可以分子，并對(duì)其進(jìn)行酶切分析，同樣可以準(zhǔn)確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時(shí)可以鑒定外源準(zhǔn)確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時(shí)可以鑒定外源片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。 有時(shí)，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道有時(shí)，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道重組體克隆中哪些是含有某個(gè)基因的克?。ū热缭谥亟M體克隆中哪些是含有某個(gè)基因的克?。ū热缭赾DNA文文庫(kù)的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克?。＿@庫(kù)的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克?。?。這時(shí)我們可以用比較復(fù)雜的核酸雜交或免疫化學(xué)的方法。時(shí)我們可以用比

4、較復(fù)雜的核酸雜交或免疫化學(xué)的方法。轉(zhuǎn)化率的影像因素1. 載體DNA及DNA重組方面載體自身性質(zhì)，不同載體的轉(zhuǎn)化效率不同載體分子的空間構(gòu)象（超螺旋與線性）2. 受體細(xì)胞受體細(xì)胞除了具備限制重組缺陷性狀外，還與所轉(zhuǎn)化載體DNA性質(zhì)相匹配3. 轉(zhuǎn)化操作方面受體細(xì)胞的預(yù)處理感受態(tài)細(xì)胞的制備如：Ca2+誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與菌齡、氯化鈣處理時(shí)間（1224h）感受態(tài)的保存期、熱脈沖時(shí)間等4. 轉(zhuǎn)化后重組子的整合與表達(dá)遺傳學(xué)選擇法（genetic selection）：主要是根據(jù)受體細(xì)胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生的遺傳表型變化直接選擇重組體的方法。 抗藥性、顯色、營(yíng)養(yǎng)缺陷等2. 物理篩選方法：3. 核酸雜交法4

5、. 表達(dá)產(chǎn)物分析法篩選的兩層含義：將攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來(lái)，將攜帶有外源插入片段的重組體挑選出來(lái)PCR方法建立以后，很快應(yīng)用于基因靶位操作中轉(zhuǎn)化子的篩選。通過(guò)在目的突變基因中引人特定的PCR引物順序，利用PCR方法直接檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞組份或細(xì)胞克隆的DNA結(jié)構(gòu)，以特定擴(kuò)增DNA片段的有無(wú)，鑒別同源重組細(xì)胞克隆。Kim和Smithes首先應(yīng)用PCR方法成功篩選出ES細(xì)胞Hprt基因的定點(diǎn)突變克隆。隨后，Joyner等應(yīng)用同樣的方法，對(duì)小鼠ES細(xì)胞的en-2基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變；Zimmer等用PCR方法篩選出同源異型盒基因hoxl.l定 點(diǎn)突變的ES細(xì)胞克隆，并得到含該突變的嵌合體小鼠

6、一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位點(diǎn)上有插入位點(diǎn)BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)上有插入位點(diǎn)Pst I。1. 原理：原理：（1）四環(huán)素：）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：）氨芐青霉素抗性基因：含含bla基因的菌體產(chǎn)生基因的菌體產(chǎn)生 -內(nèi)酰胺酶，使氨芐青內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟饷顾剞D(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)

7、菌。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：）環(huán)絲氨酸：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致四，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)四環(huán)素加環(huán)絲氨酸絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)；絲氨酸殺死，保留下來(lái)； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活）四環(huán)素抗性插入失活

8、無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液選擇。指示液選擇。 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán)+深藍(lán)色深藍(lán)色1. 原理：原理：載體載體上有一段上有一段假陽(yáng)性：假陽(yáng)性： 如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍數(shù)或沒(méi)有終的倍數(shù)或沒(méi)有終止密碼；（不破壞止密碼；（不破壞 肽）。肽）。Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。分解成蘭色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直特性進(jìn)行直

9、接選擇。（只在特定條件下）。接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。體菌株的突變型缺陷。一、原理：一、原理：1.彌補(bǔ)缺陷彌補(bǔ)缺陷his- -his+ +受體菌：受體菌：外源基因：外源基因：在不含組氨酸的在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)小鼠的二氫葉酸還原酶（小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶芐二氨嘧啶(抑制大腸桿菌生長(zhǎng)抑制大腸桿菌生長(zhǎng))有抗性。有抗性。DHFR載體載體連接連接轉(zhuǎn)化受轉(zhuǎn)化受體菌體菌三甲氧芐二氨嘧三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板啶培養(yǎng)基平板含含DHFR的克隆才能生長(zhǎng)的克隆才能生長(zhǎng)例：例：

10、使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。降解利用有插入片段的重組載體的分子量比利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測(cè)法一、直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。比較其分子量。分子量分子量 Marker載體載體重組克隆重組克隆1. 原理：原理：根據(jù)已知的外源根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）。帶數(shù)和長(zhǎng)度）。或用

11、合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片斷插入片斷載體載體ABA或或B用EcoRI和Hind分別切割同一來(lái)源的染色體DNA,并進(jìn)行克隆,在前者的克隆 中篩選到A基因,但在后者的克隆中未篩選到A基因,請(qǐng)說(shuō)明原因. 1. 原理原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。片斷。2. 過(guò)程過(guò)程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片斷引物作插入片斷引物作PCR

12、。（3）電泳）電泳PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。（4）檢查是否有）檢查是否有PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致。產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致。1. 核酸核酸雜交雜交一、原理：一、原理：重組克隆與探針雜交。重組克隆與探針雜交。3. 識(shí)別標(biāo)記識(shí)別標(biāo)記32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 檢測(cè)用的探針檢測(cè)用的探針與外源與外源DNA插入片斷互補(bǔ)的序列。插入片斷互補(bǔ)的序列。（2）非放射性標(biāo)記）非放射性標(biāo)記熒光素?zé)晒馑赜糜肈NA（或（或RNA）探針檢測(cè)）探針檢測(cè)DNA樣品。樣品。1. Southern blotting從宿主細(xì)胞中提取從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒（或

13、質(zhì)粒載體），再用探針雜交。載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。與探針雜交，在底片上曝光顯示。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片斷插入片斷載體載體特點(diǎn)：特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落?？梢灾苯诱页鲫?yáng)性菌落。DNA-RNA雜交。雜交。1）原理：）原理：2）選擇過(guò)程）選擇過(guò)程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)雙鏈變性，復(fù)性的時(shí)候，性的時(shí)候，DNA-RNA雜交分子比雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見(jiàn)一種雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見(jiàn)一種R-環(huán)環(huán)形結(jié)構(gòu)。形結(jié)構(gòu)

14、。用外源基因的用外源基因的mRNA與重組載體雜交。與重組載體雜交。缺點(diǎn)：需要電鏡！缺點(diǎn)：需要電鏡！用用DNA（或（或RNA）探針檢測(cè)探針檢測(cè)RNA樣樣品。品。主要檢測(cè)插入片主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提從宿主細(xì)胞中提取取RNA，再用探，再用探針雜交。針雜交。 在某些情況西下,如待測(cè)的重組克隆子既無(wú)任何可供選擇的基因表型特征,又無(wú)理想的核酸雜交探針時(shí),可以考慮采用免疫化學(xué)檢測(cè)法.抗體檢測(cè)法免疫沉淀檢測(cè)法利用抗體作為利用抗體作為“探針探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二

15、抗）根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：的性質(zhì)可分為幾種作用方式：1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白蛋白蛋白蛋白“雜交雜交” 待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 標(biāo)記的二標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白抗結(jié)合蛋白固相支固相支持濾膜持濾膜待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗固相支固相支持濾膜持濾膜待待測(cè)基因測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗固相支固相支持濾膜持濾膜固相支固相支持濾膜持濾膜待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗 結(jié)合

16、蛋白結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗質(zhì)?；蛸|(zhì)粒基因A插入基因插入基因B表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白檢測(cè)融合蛋白。檢測(cè)融合蛋白。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體125I標(biāo)記的標(biāo)記的 抗抗B抗體抗體質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體發(fā)光，底片曝光發(fā)光，底片曝光1. 原理原理檢測(cè)目的基因相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體。檢測(cè)目的基因相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體

17、和抗原以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀的抗體免疫沉淀X，那么與那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白

18、質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。2. 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。對(duì)

19、于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。 靈敏度不高靈敏度不高, 實(shí)用性差實(shí)用性差Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 與一抗的特異性結(jié)合。與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩?/p>

20、的物質(zhì)（或發(fā)光），再色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗 二抗二抗無(wú)色的底物無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物有色的產(chǎn)物比色觀察比色觀察酶酶 19（1）固定樣品）固定樣品將待測(cè)樣品加入將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底?？椎卓椎准尤胍豢梗磻?yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。加入一抗，反應(yīng)后沖洗

21、掉未結(jié)合的抗體。一抗一抗加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗?？箾_洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。二抗二抗加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）?；磻?yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。在特殊的分光光度儀（在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀）上比色，打）上比色，打印出結(jié)果。印出結(jié)果。有效，但準(zhǔn)確性稍差（有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗主要取決于一抗的特異性的特異性）。）。 必須與其他方法一起

22、綜合考慮。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（最好用單克隆抗體（monoclonal antibody）1.1.原理：原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫轉(zhuǎn)膜和免疫的方的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷帶上負(fù)電荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在電場(chǎng)的作用下

23、線性在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)，移動(dòng)的速率主移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大要取決于其分子量大小（鏈的長(zhǎng)短）?。ㄦ湹拈L(zhǎng)短），從，從而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽鏈分開(kāi)。鏈分開(kāi)。電泳電泳buffer電泳電泳buffer點(diǎn)樣點(diǎn)樣電泳方向電泳方向已知分子量的蛋白質(zhì)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)商品化供應(yīng)Da道爾頓道爾頓( (質(zhì)量單位質(zhì)量單位, , 等于等于一氧原子質(zhì)量的十六分一氧原子質(zhì)量的十六分之一。之一。 一克約

24、為一克約為6 610102323道爾頓道爾頓DaltonSDS PAGE考馬斯亮藍(lán)：考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出靈敏度底、只能檢出0.3-1g/帶，但可帶，但可褪色回收。褪色回收。 硝酸銀：硝酸銀： 靈敏度高、可檢出靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色）直接染色電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、膜、中性尼龍膜等）。中性尼龍膜等）。 Western（轉(zhuǎn)膜）（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下場(chǎng)的作用下橫向橫向轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到正極一

25、側(cè)的膜上。到正極一側(cè)的膜上。膜膜膠膠蛋白蛋白原理與原理與ELISA相同。相同。待測(cè)蛋白待測(cè)蛋白硝酸纖硝酸纖 維素膜維素膜一抗一抗 二抗二抗辣根過(guò)氧辣根過(guò)氧 化物酶化物酶底物底物產(chǎn)物，產(chǎn)物， 并發(fā)出光并發(fā)出光PAGE膠膠待測(cè)蛋白待測(cè)蛋白底片曝光底片曝光辣根過(guò)氧化物酶：辣根過(guò)氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有二抗上帶有HRPO）。）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底

26、物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。）暗室里曝光，沖洗膠片。Immuno Blotting多克隆抗體多克隆抗體Blotting的的結(jié)果結(jié)果單抗單抗blotting結(jié)果結(jié)果轉(zhuǎn)譯篩選法有兩種:雜交選擇轉(zhuǎn)譯（hybrid selected translation,HART)雜交抑制轉(zhuǎn)譯(hybrid arreated translation,HRT)。轉(zhuǎn)譯篩選法的突出優(yōu)點(diǎn)是將克隆的DNA同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的關(guān)系對(duì)應(yīng)起來(lái)。借助無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體借助無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上外源基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。上外源基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)篩選其產(chǎn)物是

27、否符合預(yù)期。一、無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)一、無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng) cell-free system 指保留蛋白質(zhì)生物合指保留蛋白質(zhì)生物合成能力的細(xì)胞抽取物。成能力的細(xì)胞抽取物。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)要包含以下成分：核糖體、各種tRNA、各種氨酰-tRNA合成酶、蛋白質(zhì)合成需要的起始因子和延伸因子以及終止釋放因子、GTP、ATP、20種基本的氨基酸。常見(jiàn)的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)有：大腸桿菌無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)、麥胚無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)和某些腫瘤細(xì)胞制備成的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。 適用于適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。mRNA無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的標(biāo)記的 甲硫

28、氨酸甲硫氨酸翻譯翻譯35S標(biāo)記的肽鏈標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳電泳放射自顯影放射自顯影比較放射性比較放射性 帶紋的位置帶紋的位置載體載體+外源外源DNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？分子量相符？mRNA一旦與一旦與DNA雜交成雜交成RNA-DNA雙鏈雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。抑制）。單鏈單鏈mRNA核糖體核糖體 小亞基小亞基核糖體核糖體 大亞基大亞基能翻譯能翻譯mRNADNA核糖體核糖體 小亞基小亞基核糖體核糖體 大亞基大亞基不能翻譯不能翻譯1. 原理原理1. 原理：原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的在高甲酰胺溶液中載體上克隆

29、的cDNA與它的與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對(duì)應(yīng)的放出與它對(duì)應(yīng)的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插 入的入的cDNA總總mRNAcDNA基因的基因的 mRNA雜交雜交洗脫洗脫cDNA基因的基因的 mRNA體外翻譯體外翻譯cDNA編編碼的蛋白碼的蛋白電泳電泳凝膠放射自顯影凝膠放射自顯影cDNA編編 碼的蛋白碼的蛋白硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插 入的入的cDN

30、A硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插 入的入的cDNA收集收集35S標(biāo)記的氨基酸標(biāo)記的氨基酸專門設(shè)計(jì)檢測(cè)能同專門設(shè)計(jì)檢測(cè)能同DNA特異結(jié)合的蛋特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。白質(zhì)因子。待測(cè)蛋白質(zhì)待測(cè)蛋白質(zhì)硝硝 酸酸 纖纖 維維 素素 濾濾 膜膜能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的合的DNA序列序列放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記待測(cè)蛋白質(zhì)待測(cè)蛋白質(zhì)硝硝 酸酸 纖纖 維維 素素 濾濾 膜膜能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的合的DNA序列序列放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。提供甲基。二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（dihyd

31、rofolate reductase，DHFR）1. 胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK選擇原理選擇原理四氫葉酸的必要性四氫葉酸的必要性DHFR氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷斷dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 TK+ +細(xì)胞細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黃嘌

32、呤次黃嘌呤的補(bǔ)救作用的補(bǔ)救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黃嘌呤次黃嘌呤 補(bǔ)救補(bǔ)救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 HAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：Tk- - 細(xì)胞株。細(xì)胞株。TK基因。基因。 宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞 載體標(biāo)記載體標(biāo)記含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入只有轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才能生存。基因的細(xì)胞才能生存。20真核細(xì)胞核苷酸的合成需要真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸四氫葉酸提提供甲基。供甲基。

33、（1） 選擇原理選擇原理二氫葉酸還原酶的必要性二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+ +細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。以能合成四氫葉酸。能在能在無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存的培養(yǎng)基中生存不需要補(bǔ)救！不需要補(bǔ)救！DHFR- - 細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。以不能合成四氫葉酸。需要補(bǔ)救！需要補(bǔ)救！不能在無(wú)不能在無(wú)

34、胸腺嘧啶和次黃嘌呤胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。的培養(yǎng)基中生存。dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤次黃嘌呤補(bǔ)救補(bǔ)救胸苷胸苷補(bǔ)救補(bǔ)救無(wú)四氫葉酸提供甲基，無(wú)四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻時(shí)，時(shí)，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:DHFR- -細(xì)胞株（不能在細(xì)胞株（不能在無(wú)核苷酸無(wú)核苷酸的培的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。 宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。免補(bǔ)救。 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基需要需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救！補(bǔ)救！ 氨甲喋呤氨甲喋呤“加壓加壓” 添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性內(nèi)源性DHFR的的補(bǔ)救作用，可提高選擇。補(bǔ)救作用，可提高選擇。DHFR+ +基因。基因。 載體標(biāo)記載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入只有轉(zhuǎn)入DHFR+ +基因的細(xì)胞才能生存?；虻募?xì)胞才能生存。DHFR- -DHFR- -DHFR+ +DHFR+ +livedie無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行