實(shí)驗(yàn) 紙層析法分離氨基酸

1、紙層析法分離氨基酸紙層析法分離氨基酸 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操、掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)作技術(shù) (包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量量)。2、學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分、學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及鑒定水解、層析及鑒定)分分析的方法。析的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 1、紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖、紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物

2、質(zhì)在兩機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。相間不斷分配而得到分離。 2、溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值、溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值Rf值表示：值表示： 3、Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距原點(diǎn)到溶劑前沿的距離離 4、在一定的條件下某種物質(zhì)的、在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。值是常數(shù)。Rf值的大值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。基酸。 實(shí)驗(yàn)材料與試劑實(shí)

3、驗(yàn)材料與試劑 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑1、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。2、80%甲醇甲醇3、0.1%茚三酮丙酮溶液茚三酮丙酮溶液 4、氨基酸混合液、氨基酸混合液(每種氨基酸每種氨基酸500mg/mL) 5、正丁醇、正丁醇實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材1、新華濾紙、新華濾紙2、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿3、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱4、吹風(fēng)機(jī)、吹風(fēng)機(jī)5、毛細(xì)管、毛細(xì)管 6、針、線、尺。、針、線、尺。7、鐘罩鐘罩(高約高約430mm,直徑約直徑約290mm，具磨口塞，具磨口塞)實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析單向上行單向上行層析層析

4、氨基酸氨基酸Rf值的測(cè)定值的測(cè)定A、濾紙濾紙：選用國(guó)產(chǎn)新華：選用國(guó)產(chǎn)新華 1號(hào)濾紙，號(hào)濾紙， 6cm7cm。在距濾紙。在距濾紙2cm處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出縫線空間）。縫線空間）。B、點(diǎn)樣點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長(zhǎng)，：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長(zhǎng)，以致分離不清。用以致分離不清。用毛細(xì)管毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在直徑控制在0.5cm之內(nèi)，

5、點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品之內(nèi)，點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品干干后后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注意溫度不可過(guò)高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果。意溫度不可過(guò)高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果。 將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的注意縫線處紙的兩邊不要接觸兩邊不要接觸。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。值。 C、展層展層：將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi)：

6、將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi) (注意注意濾紙不要碰皿壁濾紙不要碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙的，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位置置酸溶劑系統(tǒng)酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：正丁醇： 80%甲酸：水甲酸：水=15:3:2(體積體積比比)，茚三酮，茚三酮1ml。溫度。溫度25，時(shí)間，時(shí)間1h。注意注意：使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。D、顯色顯色：待展層基本結(jié)：待展層基本結(jié)束后束后, 置置65鼓風(fēng)箱中鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色濾紙上即顯出紫紅色/黃色

7、斑點(diǎn)。黃色斑點(diǎn)。E、Rf值的計(jì)算值的計(jì)算：用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)：用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)(點(diǎn)樣中心點(diǎn)樣中心)之之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸的的Rf值。值。 計(jì)算出計(jì)算出 3種氨基酸在酸系統(tǒng)中的種氨基酸在酸系統(tǒng)中的Rf值，判斷待測(cè)樣組成值，判斷待測(cè)樣組成。亮氨酸亮氨酸 甘氨酸甘氨酸 脯氨酸脯氨酸 待測(cè)氨基酸待測(cè)氨基酸 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離中心的距離 原點(diǎn)到溶劑前沿原點(diǎn)到溶劑前沿的距離的距離 RfRf 判斷待測(cè)氨基酸判斷待測(cè)氨基酸 注意注意 使用茚三酮顯色法，必須在整個(gè)層析操作中避免手直使用茚三酮顯色法，必須在整個(gè)層析操作中避免手直接接觸層析紙，因?yàn)槭稚铣３Ｓ猩倭亢镔|(zhì)。顯色時(shí)它也接接觸層析紙，因?yàn)槭稚铣３Ｓ猩倭亢镔|(zhì)。顯色時(shí)它也呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污染了層析結(jié)果，因此操作時(shí)應(yīng)戴橡皮手套呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污染了層析結(jié)果，因此操作時(shí)應(yīng)戴橡皮手套或指套。同時(shí)也要防止空氣中的氨?；蛑柑?。同時(shí)也要防止空氣中的氨。 思考題思考題 1、為什么在展層時(shí)有時(shí)用一種溶劑系統(tǒng)，而有時(shí)用兩種溶、為什么在展層時(shí)有時(shí)用一種溶劑系統(tǒng)，而有時(shí)用兩種溶劑系統(tǒng)劑系統(tǒng)?2、酸性溶劑系統(tǒng)、酸性溶劑系統(tǒng)(或堿性溶劑系統(tǒng)或堿性溶劑系統(tǒng))對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解