PCR儀的原理和使用

1、12PCR原理原理 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、優(yōu)點(diǎn)：特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等易自動(dòng)化等 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀使肉眼能直接觀察和判斷；察和判斷； 可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出

2、足量的的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾星期才能供分析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑 3PCR技術(shù)簡(jiǎn)史技術(shù)簡(jiǎn)史 本世紀(jì)本世紀(jì)60年代末、年代末、70年代初人們致力于年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)研究基因的體外分離技術(shù) Korana于于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：的設(shè)想：“經(jīng)過經(jīng)過DNA變性，與合適的引變性，與合適的引物雜交，用物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)

3、該過程便可克隆斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因基因”。4發(fā)展發(fā)展 1985年美國(guó)年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究公司人類遺傳研究室的室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合的體外合成提供以致一種合適的條件成提供以致一種合適的條件-摸板摸板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩聚合酶，合適的緩沖體系，沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。與時(shí)間。5實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn) Mullis最初使用的最初使用的DNA

4、聚合酶是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的 Klenow片段，片段， 其缺點(diǎn)是：其缺點(diǎn)是： Klenow酶不耐高溫，酶不耐高溫，90會(huì)變性失活，每會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。次循環(huán)都要重新加。 引物鏈延伸反應(yīng)在引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之板和引物之 間的堿基錯(cuò)配，其間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異產(chǎn)物特異性較差，合成的性較差，合成的DNA片段不均一。片段不均一。 6改進(jìn)改進(jìn) 1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合聚合酶進(jìn)行酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種真實(shí)性

5、也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 7完善完善 1988年年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。聚合酶。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 耐高溫，在耐高溫，在70下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性大于后其殘留活性大于原來(lái)的原來(lái)的90%，在，在93下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性是后其殘留活性是原來(lái)的原來(lái)的 60%，在，在95下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性后其殘留活性是原來(lái)的是原來(lái)的40%。 在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反在熱變性

6、時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。應(yīng)后再加新酶。 大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效 率，增率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。8 由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。廣泛的被應(yīng)用。 9PCR技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于技術(shù)的基本原理類似于DNA

7、的天然的天然復(fù)制過程，復(fù)制過程， 其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。核苷酸引物。 PCR由變性由變性-退火退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成驟構(gòu)成 10基本步驟基本步驟 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經(jīng)加經(jīng)加 熱至熱至93左右一定時(shí)間后，使模板左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復(fù)性復(fù)性)：模板：模板DNA經(jīng)經(jīng)加熱變性成單

8、鏈后，溫度降至加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物左右，引物與模板與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 11 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物結(jié)合引物結(jié)合 物物在在TaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP為為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈12 重復(fù)循環(huán)變性重復(fù)循環(huán)變性-退火退火-延伸三過程，就可延伸三過程，就可獲得更多的獲得更多的“半保留復(fù)制鏈半保留復(fù)制鏈”，而且這，而且這種新鏈又可

9、成為下次循環(huán)的模板。種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個(gè)循環(huán)需每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，分鐘，23小時(shí)小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。模板的拷貝。 13PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。 DNA 擴(kuò)增量可用擴(kuò)增量可用Y(1X)n計(jì)算計(jì)算 Y代表代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表表示平示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)代表循環(huán)次

10、數(shù)。次數(shù)。 平均擴(kuò)增效率的理論值為平均擴(kuò)增效率的理論值為100% 14 反應(yīng)初期，靶序列反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指片段的增加呈指數(shù)形式數(shù)形式 隨著隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，進(jìn)入線性增產(chǎn)物的逐漸積累，進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”， 這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及擴(kuò)增效率及DNA聚合酶聚合酶PCR的種類和活性及非特異的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍４蠖鄶?shù)情況下，性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。 15PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR

11、反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物各引物各10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul 16PCR反應(yīng)五要素反應(yīng)五要素 引物、酶、引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+ 引物：引物是引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板任何一段模板DNA序列，就能按

12、其設(shè)序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。在體外大量擴(kuò)增。 17 Mg2+濃度：濃度：Mg2+對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反反應(yīng)中，各種應(yīng)中，各種dNTP濃度為濃度為200umol/L時(shí)，時(shí)，Mg2+濃度為濃度為1.52.0mmol/L為宜。為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。18

13、PCR反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇 溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù) 溫度與時(shí)間的設(shè)置：溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于基于PCR原理三原理三步驟而設(shè)置變性步驟而設(shè)置變性-退火退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，1. 雙鏈雙鏈DNA在在9095變性，變性，2. 再迅速冷卻至再迅速冷卻至40 60，引物退火并，引物退火并結(jié)合到靶序列上，結(jié)合到靶序列上，3. 然后快速升溫至然后快速升溫至7075，19循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。擴(kuò)增程度。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃的濃度。度。

14、 一般的循環(huán)次數(shù)選在一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，次之間， 循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。之增多。20PCR反應(yīng)特點(diǎn)反應(yīng)特點(diǎn) 1. 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 引物與模板引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。靶基因的特異性與保守性。 1. 靈敏度高靈敏度高 2. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低 21分析方法分析方法 凝膠電泳分析：凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EB溴乙溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的錠染色紫外儀

15、下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。這是起碼條件。 22 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用通常應(yīng)用12%的瓊的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。脂糖凝膠，供檢測(cè)用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。 23 酶切分析：根據(jù)酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測(cè)分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿產(chǎn)物堿基突變的有效方法?；蛔兊挠行Х椒ā?24 Southern印跡雜交：印跡雜交： 在兩引物之間另合在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記標(biāo)記后