第一節(jié)基因工程的操作工具

1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”運(yùn)載體運(yùn)載體“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶( (限制酶限制酶) )1.1.來源來源: :原核生物原核生物2.2.作用作用: :3.3.特點(diǎn)特點(diǎn): :特異性特異性（1）、識別特定核苷酸序列；）、識別特定核苷酸序列；（2）、切開特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的）、切開特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。4.4.結(jié)果：結(jié)果：產(chǎn)生產(chǎn)生黏性末端黏性末端 或或平末端平末端一種一種限制酶限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列只能識別一種特定的核苷酸序列并在特

2、定的切點(diǎn)上切割并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。分子。下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是 A、 B、 C、 D、T C GA G C T T A AA GG T T C C AA G C T T C A G A A T T C GADNA連接酶連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割用同種限制酶切割“分子縫合針分子縫合針”DNADNA連接酶連接酶 2

3、、分類、分類E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶T T4 4DNADNA連接酶連接酶想一想想一想:DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎聚合酶是一回事嗎?(1)(1)、來源：大腸桿菌、來源：大腸桿菌(2)(2)、作用：、作用：“縫合縫合”黏性末端黏性末端(1)(1)、來源：、來源：T4T4噬菌體噬菌體(2)(2)、作用：、作用：“縫合縫合”黏性末端和平末端黏性末端和平末端1 1、作用：恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之、作用：恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之 間的間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別區(qū)別1 1區(qū)別區(qū)別2 2相同點(diǎn)相同點(diǎn)只能將只能將單個(gè)核苷酸單個(gè)核苷

4、酸連接連接到已有的核酸片段上，到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵形成形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵在在兩個(gè)兩個(gè)DNADNA片段之間片段之間形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵以以一條一條DNADNA鏈為模板鏈為模板。連接成一條互補(bǔ)連接成一條互補(bǔ)的的DNADNA鏈鏈不需要模板。不需要模板。將將DNADNA雙鏈上的雙鏈上的兩個(gè)兩個(gè)缺口同時(shí)連接缺口同時(shí)連接起來。起來?；虻倪\(yùn)輸工具基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體運(yùn)載體 質(zhì)粒存在于許多質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌和酵母菌等生物細(xì)菌和酵母菌等生物中中, ,是細(xì)菌擬核是細(xì)菌擬核DNADNA之之外能夠自主復(fù)制的外能夠自主復(fù)制的很很小的雙鏈環(huán)狀小的雙鏈環(huán)狀DNADNA分分子。子。

5、常用的運(yùn)載體：常用的運(yùn)載體： 質(zhì)粒質(zhì)粒、噬菌體的衍噬菌體的衍生物生物和和動植物病毒動植物病毒等。等。作為載體的必要條件：作為載體的必要條件：1 1、能自我復(fù)制或整合到受體染色體能自我復(fù)制或整合到受體染色體DNADNA上上 隨染色體隨染色體DNADNA的復(fù)制而同步復(fù)制的復(fù)制而同步復(fù)制；2 2、有一或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)有一或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)；3 3、必須帶有標(biāo)記基因必須帶有標(biāo)記基因，供重組供重組DNADNA的鑒定和選擇的鑒定和選擇4 4、對受體細(xì)胞無毒害對受體細(xì)胞無毒害5 5、大小應(yīng)合適，便于提取和體外操作大小應(yīng)合適，便于提取和體外操作。基因的運(yùn)輸工具基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體運(yùn)載體1 1、下列不

6、屬于基因工程的運(yùn)載體的是（、下列不屬于基因工程的運(yùn)載體的是（ ） A A、質(zhì)粒、質(zhì)粒 B B、噬菌體、噬菌體 C C、細(xì)菌、細(xì)菌 D D、病毒、病毒C2、判斷：、判斷： A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列堿基序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶、重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶、 運(yùn)載體運(yùn)載體3 3、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的 基因的基因的DNADNA片段，需使用（片段，需使用（ ） A A、同種限制酶、同種限制酶 B B、兩種限制酶、兩種限制酶

7、 C C、同種連接酶、同種連接酶 D D、兩種連接酶、兩種連接酶原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)( (補(bǔ)充內(nèi)容）補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子啟動子終止子終止子不編碼蛋白質(zhì)。不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì)：編碼蛋白質(zhì) , ,連續(xù)不間斷連續(xù)不間斷編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá)調(diào)控遺傳信息表達(dá), ,上上 游有啟動子，下游有終止子游有啟動子，下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)

8、非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用有調(diào)控作用, ,上游有啟動子，下上游有啟動子，下游有終止子游有終止子非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但是，生物的入侵，但是，生物在長期的進(jìn)化過

9、程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源具，當(dāng)外源DNADNA侵入時(shí)，會利用限制酶將外源侵入時(shí)，會利用限制酶將外源DNADNA切割掉，切割掉，以保證自身的安全。所以，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起限制酶在原核生物中主要起到切割外源到切割外源DNADNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。 含有某種限制酶的細(xì)胞，含有某種限制酶的細(xì)胞，其其DNADNA分子中或者不具備這種分子中或者不具備這種限制酶的識別