第六章細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性與耐藥性

1、微生物學(xué)檢驗(yàn)微生物學(xué)檢驗(yàn)微生物學(xué)檢驗(yàn)微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)規(guī)劃教材國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)規(guī)劃教材 第六章 細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性與耐藥性本 章 內(nèi) 容第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物1第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)2第三節(jié) 分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)3第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查4學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)： 1掌握 抗菌藥物敏感試驗(yàn)常用方法，紙片擴(kuò)散法（K-B法）的操作方法、結(jié)果判斷及實(shí)驗(yàn)質(zhì)量影響因素2熟悉 耐藥表型檢測(cè)；-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法；超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測(cè)方法3了解 臨床常用抗菌藥物種類(lèi)；藥敏試驗(yàn)中藥物選擇原則本章重點(diǎn)：紙片擴(kuò)散法（K-B法）的操作方法及結(jié)果判斷 藥敏試驗(yàn)的臨床意義第一節(jié)

2、臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類(lèi)1.-內(nèi)酰胺類(lèi)：抑制轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶、D-羧肽酶、內(nèi)肽酶，從而細(xì)菌細(xì)胞壁合成。2.氨基糖苷類(lèi)：抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。 3.喹諾酮類(lèi)：作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾細(xì)菌DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。4.大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)：結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大亞基，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和肽鏈延伸。5.糖肽類(lèi)：阻斷肽聚糖合成，阻阻礙細(xì)胞壁合成。第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類(lèi)6.磺胺類(lèi)：競(jìng)爭(zhēng)性與二氫葉酸合成酶結(jié)合，使核酸合成抑制。7.四環(huán)素類(lèi)：結(jié)合細(xì)菌30S核糖體亞基，抑制蛋白質(zhì)合成。8.氯霉素類(lèi)：作用細(xì)菌70S核糖體的50S亞基，抑制蛋白合成。9.林可酰胺類(lèi)：結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大

3、亞基，抑制蛋白質(zhì)合。10.其他抗菌藥物：硝基膚喃類(lèi)、硝基咪唑類(lèi)、鏈陽(yáng)霉素類(lèi)、噁唑烷酮類(lèi)等。二、常規(guī)藥敏試驗(yàn)藥物選擇原則我國(guó)主要遵循美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物返回章內(nèi)容返回章內(nèi)容U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物。C組：在A、B組藥物過(guò)敏或耐藥時(shí)選用；B組：只在A組藥物耐藥、過(guò)敏、無(wú)效時(shí)選擇性報(bào)告;A組：包括對(duì)特定菌群的常規(guī)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的藥物；第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)一、概述測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感試驗(yàn)（AST）抗菌藥物敏感試驗(yàn)方法紙片擴(kuò)散法稀釋法E-test法 菌株被推薦劑量治療感染部位可

4、達(dá)到的抗菌藥物濃度抑制藥物在生理濃集部位有臨床效果，還代表敏感與耐藥之間緩沖區(qū) 菌株不能被常規(guī)劑量抗菌藥物可到達(dá)的濃度所抑制敏感（S）耐藥（R）中介（I）抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)二、紙片擴(kuò)散法含有定量抗菌藥物紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含藥物吸收瓊脂中水分溶解后向紙片周?chē)鷧^(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)二、紙片擴(kuò)散法1.水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.27.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑

5、90mm的平板2.挑取孵育1624小時(shí)已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)二、紙片擴(kuò)散法3.用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液4.在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周5.平板在室溫下干燥35min，用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)二、紙片擴(kuò)散法6.平板置352孵育箱，1618小時(shí)后判讀結(jié)果。苛養(yǎng)菌應(yīng)在含5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)2024小時(shí)7.用游標(biāo)卡尺或直尺量取抑菌圈直徑。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報(bào)告敏

6、感、中介、耐藥第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法圖解抑菌圈細(xì)菌生長(zhǎng)藥敏紙片細(xì)菌菌落抗生素濃度 耐藥敏感第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)三、稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋?zhuān)?jīng)培養(yǎng)后觀察被試菌株的最低抑菌濃度，根據(jù)CLSI提供的MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感程度。稀釋法中使用肉湯培養(yǎng)基為肉湯稀釋法，使用瓊脂培養(yǎng)基為瓊脂稀釋法第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)三、稀釋法1. 肉湯稀釋法濃度 4 8 16 32 64 128 256 g/ml 混 清抗菌藥物素倍比稀釋?zhuān)臃N菌105CFU/ml ， 孵育溫度35，1620h，判讀結(jié)果。第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)三、稀釋法2.瓊脂稀釋法 濃

7、度 16 32 64 128 256 g/ml 制備含對(duì)倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104/每點(diǎn)，孵育35，1620h ，判讀結(jié)果第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)四、E-test法E-test法（epsilometer test）結(jié)合了擴(kuò)散法和稀釋法的原理和特點(diǎn)，對(duì)抗菌藥物直接測(cè)量MIC。E試條為寬5mm、長(zhǎng)50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的抗菌藥物，另一面有所含藥物濃度的刻度 細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)E test 塑料條橢圓形細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)256128 8016判讀抑菌濃度（MIC ug/ml)第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)四、 E-test法1.菌液制備及接種均同紙片擴(kuò)散法2.于9

8、0mm平板上可放E試驗(yàn)試條1 2條，140mm平板最多可放6條3. 孵育、溫度及時(shí)間同紙片擴(kuò)散法4.讀取橢圓形抑菌環(huán)與E試條的交界點(diǎn)值即為MIC第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)五、質(zhì)量控制1.影響紙片擴(kuò)散法的因素(1) 培養(yǎng)基厚度(2) 細(xì)菌濃度(3) 抗菌藥物含量、擴(kuò)散性(4) 溫度，預(yù)孵育時(shí)間(5) 判定標(biāo)準(zhǔn)(6) 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)五、質(zhì)量控制2.質(zhì)量控制的要求（1）質(zhì)控菌：標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源國(guó)家微生物菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)每周在MH瓊脂上傳代一次，4保存（2）質(zhì)控方法：在同一條件下，將新鮮傳代質(zhì)控菌株用與常規(guī)實(shí)驗(yàn)相同的測(cè)定藥物進(jìn)行相同的操作方法后，測(cè)定質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)，以便對(duì)照監(jiān)

9、測(cè)（3）抑菌圈質(zhì)控范圍：標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈應(yīng)落在規(guī)定范圍內(nèi)，范圍為95%的可信限返回章內(nèi)容返回章內(nèi)容第二節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)一、結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)指征 首次從患者標(biāo)本分離的分枝桿菌需做藥敏試驗(yàn)，有助于臨床合理用藥和監(jiān)測(cè)其藥物敏感性。經(jīng)過(guò)三個(gè)月正規(guī)抗結(jié)核治療，標(biāo)本中分枝桿菌分離培養(yǎng)仍為陽(yáng)性的患者或重癥患者，以及來(lái)自高耐藥結(jié)核分枝桿菌流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗(yàn)。 第三節(jié) 分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)二、 體外藥敏試驗(yàn)絕對(duì)濃度法1.藥物溶液配制 藥物先制成高濃度藥液，再按比例稀釋成低濃度藥液.含藥培養(yǎng)基 每100ml改良羅氏培養(yǎng)基加入1ml配制、稀釋好的抗結(jié)核藥液，無(wú)菌分裝7ml/管，85凝固。

10、.菌懸液 培養(yǎng)物以0.5%吐溫-80生理鹽水稀釋?zhuān)c標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁躈o.1比濁.接種 1mg/ml菌懸液10倍稀釋至102mg/ml，無(wú)菌吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基斜面。37培養(yǎng)，四周觀察結(jié)果 第三節(jié) 分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)二、 體外藥敏試驗(yàn)絕對(duì)濃度法.結(jié)果報(bào)告 按下列方式報(bào)告對(duì)照培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基菌落情況：返回章內(nèi)容返回章內(nèi)容 第三節(jié) 分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)一、細(xì)菌耐藥性與耐藥機(jī)制 1.產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶2.抗菌藥物作用靶位改變，包括青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)、DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變等3.抗菌藥物滲透障礙，包括細(xì)菌生物被膜形成和通道蛋白丟失4.

11、藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)亢進(jìn)上述四種耐藥機(jī)制中，第一、二種耐藥機(jī)制具有專(zhuān)一性，第三、四種耐藥機(jī)制不具有專(zhuān)一性。 第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測(cè) 1.-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（1）-內(nèi)酰胺酶是一類(lèi)水解青霉素、頭孢菌素類(lèi)抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽(yáng)性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中。（2）檢測(cè)方法有微生物培養(yǎng)法、碘淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因?yàn)楹?jiǎn)單、方便、快速，應(yīng)用于臨床檢測(cè)。 第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測(cè) 2超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè) l ESBL指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和單環(huán)內(nèi)酰胺類(lèi)氨曲南的一類(lèi)酶。l ESBLs不能水解頭霉素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)藥物，能被克拉維酸

12、、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。 第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測(cè) 2.超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（1）紙片擴(kuò)散法 表型初篩試驗(yàn)出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑菌株產(chǎn)生ESBL（篩選陽(yáng)性）：頭孢泊肟17mm頭孢他啶22mm頭孢噻肟27mm頭孢曲松25mm氨曲南 27mm 第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測(cè) 2.超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（紙片擴(kuò)散法）（1）紙片擴(kuò)散法表型確證試驗(yàn)頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復(fù)合藥物組的抑菌圈直徑與相應(yīng)單藥抑菌圈直徑相差5mm時(shí)，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL 第四節(jié) 細(xì)菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測(cè) 2.超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（）肉湯稀釋法表型初篩試驗(yàn)出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ES