實(shí)驗(yàn)十一 植物的組織培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)十一 植物的組織培養(yǎng)交大附中 冀朝輝植物組織培養(yǎng)在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使其長成完整的植株。植物組織培養(yǎng)的理論根底植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性：植物細(xì)胞具有植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。原理：生物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性?？茖W(xué)研究說明：處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這

2、一過程，就是植物組織培養(yǎng)。 植物細(xì)胞全能性的表達(dá)脫分化：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體局部的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。再分化：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。離體的植物器官、組織、細(xì)胞脫分化愈傷組織再分化根芽植物體植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)條件含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的pH、適時光照等。愈傷組織:在人工培養(yǎng)基上,由外植體形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。愈傷組織應(yīng)用領(lǐng)域 1、快速繁殖 運(yùn)用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖

3、到400萬株。2、種苗脫毒 針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、遠(yuǎn)緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。比方遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。4、突變育種 采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。象中國林科院用逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。5、基因工程 基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。 6、生物制品 有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物紫杉

4、醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞來直接生產(chǎn)。近年國內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得生長量很高的細(xì)胞系，每升細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)。 植物組織培養(yǎng)的分類廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為：器官培養(yǎng)、莖尖分生組織培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。外植體：由活體植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等。配制培養(yǎng)基外植體的消毒接種培養(yǎng)移栽栽培 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟 培養(yǎng)基及其配制 一、培養(yǎng)基的成分 二、培養(yǎng)基的配制三、常用培養(yǎng)基配方及其特點(diǎn) 一、培養(yǎng)基的成分 無機(jī)鹽碳源和能源 維生素類 氨基酸及有機(jī)附加物 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 瓊脂 無機(jī)鹽 無機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳

5、、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca(NO3)2的硝態(tài)氮形式來滿足培養(yǎng)物對氮素的需求，或?qū)煞N混合使用。磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。鉀是主要的陽離子，近年來在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢。鈣、鈉、鎂的用量較少。微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-510-7mol/L，稍多那么產(chǎn)生毒害。 碳源和能源 植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水

6、化合物作為生長發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。大多數(shù)植物細(xì)胞對蔗糖的需求范圍是1%5%，但個別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達(dá)7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花藥培養(yǎng)。糖類在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。一般來說，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3132，即約有1/42/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。 維生素類 維生素類與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)。維生素的種類很多，在植物組織培養(yǎng)中通常以Bmg/L，其中以鹽酸硫胺素B1、鹽酸吡哆素B6、維生素B12、煙酸、生物素和維生素C最為常用。在各種維生素中，1可能是必需的

7、。其它可能只對外植體的生長起促進(jìn)作用。肌醇本身不促進(jìn)外植體的生長，但可能有助于活性物質(zhì)發(fā)揮作用，從而促進(jìn)外植體生長、胚狀體及芽的形成。培養(yǎng)基中肌醇的用量為50100mg/L。 氨基酸及有機(jī)附加物 在一些培養(yǎng)基中可參加一些氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，它們是培養(yǎng)基中重要的有機(jī)氮源。水解酪蛋白CH和水解乳蛋白LH也是多種氨基酸的混合物，對胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用，常用量為500mg/L。 在某些植物組織培養(yǎng)中還參加一些天然的有機(jī)物，例如椰子乳1020%，酵母提取物0.5%，香蕉泥100200mg/L，其作用是提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長

8、激素等。如培養(yǎng)基中參加100200mg/L的香蕉泥，具有較大的pH緩沖作用，主要用于蘭花的組織培養(yǎng)，對幼苗的發(fā)育有較大的促進(jìn)作用。 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其用量雖極少，但它們對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用，其中以生長素類和細(xì)胞分裂素最為常用。 生長素 主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長、分裂和分化；誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生。 生長素常用的是2,4-D2,4-二氯苯氧乙酸、NAA萘乙酸、IAA吲哚乙酸、IBA吲哚丁酸，它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?2,4-DNAAIBA

9、IAA 2,4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，NAA、IBA、IAA10mg/L。細(xì)胞分裂素 主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、促進(jìn)芽的生長。 常用的細(xì)胞分裂素類有：沖動素KT、6-芐基腺嘌呤6-BA、玉米素ZT、2-異戊烯腺嘌呤2-iP、吡效隆4PU，CPPU和噻重氮苯基脲TDZ。 它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)門DZ 4PU ZT 2-iP 6-BA KT。但在組織培養(yǎng)中通常使用人工合成的、性能穩(wěn)定的而價格適中的KT和6-BA，二者的最適濃度為1-10mg/L。植物組織培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑的使用 瓊脂瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫

10、下凝固，同時不參與代謝，所以在組織培養(yǎng)中一直被作為首選的培養(yǎng)基質(zhì)而廣泛應(yīng)用。 二、培養(yǎng)基的配制水和藥品 母液的配制和保存 培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序 水和藥品 用于配制培養(yǎng)基的水最好是蒸餾水；化學(xué)藥品應(yīng)盡可能采用分析純或化學(xué)純級別的試劑；藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。 配制MS培養(yǎng)基母液成分表母液種類成分規(guī)定量（mg/l）擴(kuò)大倍數(shù)稱取量（g）母液定容體積（ml）配1L MS培養(yǎng)基吸取量（ml）大量元素母液1NH4NO316505082.5100020KNO3190095.0MgSO4.7H2O37018.52Cacl2.2H2O44010022.0500103KH2PO41701008.5500

11、10微量元素5H3BO36.2500.31100020MnSO4.4H2O22.31.115ZnSO4.7H2O8.60.43KI0.830.0415Na2MoO4.2H2O0.250.0125CuSO4.5H2O0.0250.00125Cocl2.6H2O0.0250.00125鐵鹽4Na2-EDTA37.31001.86550010FeSO4.7H2O27.81.390有機(jī)成分6肌醇1002005.02505甘氨酸20.1煙酸0.50.025VB60.50.025VB10.10.025三、常用培養(yǎng)基及其特點(diǎn)MS培養(yǎng)基是1962年Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草材料而設(shè)計的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽的濃度高，有加速愈傷組織生長的作用，能滿足植物組織對礦質(zhì)營養(yǎng)的要求。銨鹽和硝酸鹽含量高，比例也較為適宜，也不需要添加更多的有機(jī)附加物，這是目前應(yīng)用的最廣泛的一種培養(yǎng)基。與MS較為接近的還有LS、RM等培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基是1974年由我國的朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的，其KNO3和NH42SO4濃度高且不含鉬。目前在國內(nèi)已廣泛用于小麥、水稻及其它植物的花粉和花藥的培養(yǎng)和其它的組織培養(yǎng)。 B5培養(yǎng)基它的主要特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，該營養(yǎng)成分可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作