第五章PCRPPT

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第五章一、基因擴(kuò)增 概念：指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式： 1. 環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增 2. 基因的程序性擴(kuò)增 3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增 4. 基因工程擴(kuò)增 5. PCR擴(kuò)增1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增 在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。2. 基因的程序性擴(kuò)增 在發(fā)育的某個(gè)階段，某些基因的大量擴(kuò)增。如非洲爪蟾卵子形成過(guò)程中rRNA基因的擴(kuò)增。3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增 生物進(jìn)化過(guò)程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇。4. 基因工程擴(kuò)增 載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。5. PCR擴(kuò)增 應(yīng)用聚合酶

2、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。二、PCR技術(shù)Polymerase Chain Reaction1. PCR的發(fā)明（1）1971年Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。當(dāng)時(shí)由于引物和DNA聚合酶及DNA測(cè)序技術(shù)都沒(méi)有解決，設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。（2）1985年Cetus公司的科學(xué)家K.B. Mullis發(fā)明了PCR，使這一設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。（3）Taq DNA 聚合酶 1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中。使 PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。（4）PCR

3、儀 1988年 Cetus公司發(fā)明自動(dòng)熱循環(huán)儀。1986年 H.A. Erilish從嗜熱 水生菌分離出耐高溫的Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37 )，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。2. PCR技術(shù)的原理：（1）DNA模板變性 雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為單鏈。（2）DNA模板與引物復(fù)性 引物（primer）:人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5端相同。40-65（3）DNA鏈的延伸 DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。72（4）1個(gè)循環(huán)的結(jié)果 （5）新一輪循環(huán)開(kāi)始：變性復(fù)性延伸。理論上

4、30次循環(huán)3. PCR的過(guò)程（1）第一步：變性（denature） 94-95下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步：復(fù)性（anneal） 50-60 下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。 引物的濃度高， 引物的鏈短。（3）第三步：延伸（extend） 72 下1-2分鐘，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。（4）第四步：變性（denature） 94 下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（5）第五步：重復(fù)（repeat）30-35個(gè)溫度循環(huán)4. PCR的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng) PCR使用專門(mén)合成的DNA引物。 延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。這就避免了一般DNA聚合酶污染和非

5、引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。（2）敏感性高：需要模板量極低，理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109（3）快速：整個(gè)PCR過(guò)程約2-3小時(shí)即可完成。（4）簡(jiǎn)便：對(duì)模板的純度要求低。不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。（5）可以擴(kuò)增mRNA （RT-PCR） 先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。5. 影響 PCR的因素（1）Taq DNA聚合酶自從H.A. Erilish分離出耐高溫的Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37 )，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。 熱穩(wěn)定性Taq DNA

6、聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。 最適溫度高最適溫度： 75-80 延伸速度： 約35-150nt/s.酶分子 最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kb Taq酶的功能缺點(diǎn) 具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但沒(méi)有35外切酶活性。 因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。 Taq DNA聚合酶的激活劑 金屬離子敏感（尤其是Mg2+ ）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。（2

7、）其它耐熱的 DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 無(wú)3 5DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴(kuò)增DNA。VENT DNA聚合酶 有35外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受100高溫。 Pfu DNA Polymerase 有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯(cuò)率最低的。但PCR產(chǎn)物為平端！ Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。 Taq的PCR產(chǎn)物3端往往帶有一個(gè)A。 （3）引物（primer)位置：與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3端序列互補(bǔ)（ 5端相同）的短DNA。引物的長(zhǎng)度 理論

8、計(jì)算：419=2.751011。即2.751011 bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)1530bp。引物的堿基序列 3端必須與模板正確配對(duì)，5端可以不配對(duì)。5端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。 引物的堿基組成1）盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力2）避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列.3）避免形成引物二聚體（dimer） 兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。引物的Tm值 手工計(jì)算：Tm=（G+C)4 + (A+T)2 一般估計(jì)：當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時(shí)，復(fù)

9、性溫度低于55。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。引物的濃度 一般使用終濃度各0.5mol/L。簡(jiǎn)并引物 如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。套嵌引物（nested primers) 設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件如Primer5.0等（4）模板（template) 純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+

10、的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。 模板的量：不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。（5）dNTPs dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱。一般反應(yīng)體系中dNTP混合液濃度2.5mM each。濃度過(guò)高會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率。（6）Mg 2+ 的濃度 Taq DNA聚合酶要求有游離的Mg2+ 。所以Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2終濃度。6. PCR技術(shù)的擴(kuò)展（1）熒光實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR（或TaqMan PCR ）) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種較新的

11、DNA定量方法，其定量的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如SYBR GREEN I）或特異性的熒光探針（如Taqman探針），實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定熒光信號(hào)（閾值）時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)CT值（Cycle Thresholg）:通過(guò)將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與其濃度的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量被測(cè)樣品的濃度。Ct值：樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 熒光探針和熒光染料熒光探針和熒光染料 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。

12、前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。 SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。 SYBR Green I 在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是 DNA 定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，我們可以

13、對(duì) DNA、RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們還可以對(duì) PCR 產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析：例如 利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析。 目前 實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。 （2）反向PCR 擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列 技術(shù)關(guān)鍵：把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。使引物的外側(cè)序列 “轉(zhuǎn)變” 成內(nèi)側(cè)序列。（3）不對(duì)稱PCR 用于擴(kuò)增單鏈DNA，

14、單鏈DNA更適于測(cè)序。 技術(shù)關(guān)鍵：兩個(gè)引物的濃度相差100倍。低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA。最后產(chǎn)物中99%是單鏈DNA。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR) 擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。7. PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA 從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；微量殘留DNA擴(kuò)增；分析模板序列；（2）基因的體外誘變 在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。 技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)

15、引入突變序列。（3）基因組的比較研究 比較不同物種之間的基因組特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 利用6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。 類似于限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則 1.引物長(zhǎng)度： 一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物，但最多不超過(guò)50個(gè)核苷酸。2.堿基分布的均衡性： 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過(guò)5個(gè)，GC含量一般40-60

16、%，GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性，GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。 3.引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 4.引物之間 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。同一引物之間也避免互補(bǔ)，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 5.引物Tm值一般要求：55-65。 計(jì)算：對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，

17、Tm值可根據(jù)Tm=4(G C) 2(A T)來(lái)粗略估算，對(duì)于較長(zhǎng)引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。Tm = H/( S R * ln (C/4) 16.6 log (K /(1 0.7 K ) - 273.156.引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3端有有較多堿基互補(bǔ)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。7.引物3端 引物的延伸從3端開(kāi)始，因此3端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性，引物3端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。8.引物5端 引物5端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基，在5端引入一段非模板依賴性序列。5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。5端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。 9. 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過(guò)去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3端最好