第三章細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

1、LOGO細(xì)細(xì)胞生物胞生物學(xué)學(xué)研研究方法究方法Company Logo學(xué)習(xí)要求學(xué)習(xí)要求 熟練掌握觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本方法；熟熟練掌握觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本方法；熟練掌握進(jìn)行細(xì)胞組分分析的一些基本方法；熟練練掌握進(jìn)行細(xì)胞組分分析的一些基本方法；熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)。掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)。Company Logo第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。Company Logo一、光學(xué)顯微技術(shù)一、光學(xué)顯微技術(shù)（一

2、）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù) 1 1、構(gòu)成：、構(gòu)成：照明系統(tǒng)：照明系統(tǒng)：光源、折光鏡和聚光鏡，有時附光源、折光鏡和聚光鏡，有時附加濾光片控制光的波長。加濾光片控制光的波長。光學(xué)放大系統(tǒng)：光學(xué)放大系統(tǒng)：目鏡和物鏡組成目鏡和物鏡組成。機(jī)械裝置機(jī)械裝置 Company Logo目鏡目鏡物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡物鏡載物臺載物臺鏡座鏡座載物臺轉(zhuǎn)動桿載物臺轉(zhuǎn)動桿鏡臂鏡臂電源開關(guān)電源開關(guān)光強(qiáng)調(diào)節(jié)鈕光強(qiáng)調(diào)節(jié)鈕聚光器聚光器粗粗/微調(diào)螺旋微調(diào)螺旋視場光闌視場光闌Company Logo2 2、原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放、原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。大成像。Comp

3、any Logo3 3、分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。、分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 D=0.61/ D=0.61/N NA Al其中其中為入射光線波長；為入射光線波長；lN NA A 為鏡口率（數(shù)值孔徑）為鏡口率（數(shù)值孔徑）Nsin/2Nsin/2。lN=N=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；l=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）。Company Logo介質(zhì)介質(zhì)空氣空氣水水香柏油香柏油 溴萘溴萘 折射率折射率1 11.331.33 1.5151.515 1.661.66幾種介質(zhì)的折射率幾種介質(zhì)的折射率Company Logo顯微鏡的幾個光學(xué)特點(diǎn)：顯微鏡的幾個光學(xué)特

4、點(diǎn)：制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65-1.781.65-1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好（所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好（1.71.7）。）。最大值可達(dá)最大值可達(dá)14001400，空氣中，空氣中N=1N=1，最短的可見光，最短的可見光波長波長為為450nm450nm，此時，此時D=292nmD=292nm，約，約0.30.3m m。在。在油鏡下，油鏡下，N N可提高到可提高到1.51.5，此時，此時D D可達(dá)可達(dá)0.20.2m m。普通光線的波長為普通光線的波長為400-700nm400-700nm，分辨力數(shù)值約為，分辨力數(shù)值約為0.2m0.2m

5、，人眼的分辨力為，人眼的分辨力為0.2mm,0.2mm,因此顯微鏡的因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X1000X。Company Logo 在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。根成正比。Company Logo石蠟

6、切片的一般步驟：石蠟切片的一般步驟：1 1取材取材切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透。切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透。 2 2固定固定中性福爾馬林固定液，固定中性福爾馬林固定液，固定1010小時以上。小時以上。 3. 3. 洗滌洗滌材料經(jīng)固定后材料經(jīng)固定后, ,流水沖洗，數(shù)小時或過夜。流水沖洗，數(shù)小時或過夜。4. 4. 脫水脫水 材料依次經(jīng)材料依次經(jīng)50%50%、70%70%、80%80%、90%90%、 95%95%各級乙醇各級乙醇溶液脫水，各溶液脫水，各30min30min，再放入，再放入100%2100%2次，每次次，每次20min20min。 Company Logo5 5

7、透明透明 材料依次經(jīng)材料依次經(jīng)1/31/3二甲苯二甲苯+2/3+2/3乙醇混合液乙醇混合液1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液2/32/3二甲苯二甲苯+1/3+1/3乙醇混乙醇混合液合液30-45min,30-45min,二甲苯二甲苯15min15min、15min15min（至透（至透明為止）。明為止）。 6 6透蠟透蠟 放入二甲苯和石蠟各半的混合液放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,15min,再放再放入石蠟入石蠟、石蠟、石蠟透蠟各透蠟各50-6050-60分鐘分鐘( (在在60 60 恒溫恒溫箱中進(jìn)行箱中進(jìn)行) )。7. 7. 包埋包埋Company Logo

8、8. 8. 切片切片9. 9. 展片、貼片展片、貼片1010染色染色Company Logo 把透過標(biāo)本的可見光的把透過標(biāo)本的可見光的光程差光程差變成變成振幅差振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。變得清晰可見。可用于可用于觀察活細(xì)胞觀察活細(xì)胞。1 1、相差顯微鏡、相差顯微鏡 由澤爾尼克（由澤爾尼克（P PZernikeZernike）于）于19321932年發(fā)明，年發(fā)明，并因此獲并因此獲19531953年諾貝爾物理獎。年諾貝爾物理獎。（二）相差和微分干涉顯微技術(shù)（二）相差和微分干涉顯微技術(shù)Company Logo 在構(gòu)造上，相差

9、顯微鏡在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌：環(huán)形光闌：使照明光線使照明光線從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光器，再斜射到標(biāo)本上。光器，再斜射到標(biāo)本上。相位板：物鏡中加了涂相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相將直射光或衍射光的相位推遲位推遲1/41/4。相位板相位板環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌Company Logo用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本 相差顯微鏡下的細(xì)胞有絲分裂相差顯微鏡下的細(xì)胞有絲分裂相差顯微鏡下的線蟲 相差顯微鏡下的細(xì)菌芽孢相差顯微鏡下的細(xì)菌芽孢Com

10、pany Logo2 2、微分干涉顯微鏡、微分干涉顯微鏡 干涉：兩列頻率相同的光干涉：兩列頻率相同的光波在空中相遇時發(fā)生疊波在空中相遇時發(fā)生疊加，在某些區(qū)域總加強(qiáng)，加，在某些區(qū)域總加強(qiáng)，在另外一些區(qū)域總減弱，在另外一些區(qū)域總減弱，出現(xiàn)明暗相間的條紋或出現(xiàn)明暗相間的條紋或者是彩色條紋的現(xiàn)象叫者是彩色條紋的現(xiàn)象叫做光的干涉。做光的干涉。Company Logo 1952 1952年，年，NomarskiNomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉顯微鏡（明了微分干涉顯微鏡（differential differential interference contra

11、st microscopeinterference contrast microscope），是以平），是以平面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后經(jīng)過另一在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造差別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。雕。Company Logo微分干涉顯微鏡下的硅藻（偽彩色）微分干

12、涉顯微鏡下的硅藻（偽彩色） 微分干涉顯微鏡適于研究微分干涉顯微鏡適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等。如果接如核、線粒體等。如果接上錄像裝置可以記錄活細(xì)上錄像裝置可以記錄活細(xì)胞中的顆粒以及細(xì)胞器的胞中的顆粒以及細(xì)胞器的運(yùn)動。運(yùn)動。 目前像基因注入、核移植、目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。這種顯微鏡下進(jìn)行。Company Logo特點(diǎn)：特點(diǎn)：光源為光源為紫外線紫外線，波長較短，波長較短 分辨力高于普通顯微鏡；分辨力高于普通顯微鏡；有兩個有兩個特殊的濾光片特殊的濾光片。光。光源前的用以濾除可見光；源前的用以濾除可見光

13、；目鏡和物鏡之間的用于濾目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人眼。除紫外線，用以保護(hù)人眼。 照明方式通常為照明方式通常為落射式落射式。 即光源通過物鏡投射于樣即光源通過物鏡投射于樣品上品上 。（三）熒光顯微鏡技術(shù)（三）熒光顯微鏡技術(shù) Company LCompany Logo用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。疾病診斷。Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in Company Logo（四）激光掃描共聚

14、焦顯微境技術(shù)（四）激光掃描共聚焦顯微境技術(shù) 激光掃描共聚焦顯微鏡是近代最先進(jìn)的細(xì)胞生物激光掃描共聚焦顯微鏡是近代最先進(jìn)的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器之一。是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)分析儀器之一。是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可觀熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行分子、離子進(jìn)行實(shí)時動態(tài)地觀察和檢測實(shí)時動態(tài)地觀察和檢測。 Company Logo特點(diǎn)：特點(diǎn)： 用用激光激光作光源，逐

15、點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3 3倍倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次掃描不同層次，形，形成立體圖像。成立體圖像。Company LogoLCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)Company Logo( (五五) )熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 在生命科學(xué)領(lǐng)域，熒光共振能量轉(zhuǎn)移

16、在生命科學(xué)領(lǐng)域，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transferfluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RETFRET）技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距）技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用?；プ饔谩ompany Logo 供體蛋白供體蛋白CFPCFP的的發(fā)射發(fā)射光譜與受體蛋白光譜與受體蛋白YFPYFP的的吸吸收收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接

17、近時，用光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用CFPCFP的吸收波長激發(fā)的吸收波長激發(fā)CFPCFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至效率地共振轉(zhuǎn)移至YFPYFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFPCFP的的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFPYFP的熒的熒光。光。 Company Logo 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有高的當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有高的CaCa2+2+濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā)FRETFRET，使受體蛋白，使受體蛋白YFPYFP發(fā)出黃色熒光，因此細(xì)胞呈黃色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)出黃色熒光

18、，因此細(xì)胞呈黃色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)CaCa2+2+濃度低時，濃度低時，F(xiàn)RETFRET幾乎不發(fā)生，因此檢測時幾乎不發(fā)生，因此檢測時CFPCFP被被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈綠色激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈綠色 利用利用FRETFRET檢測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化，將檢測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化，將CFPCFP和和YFPYFP分別于鈣分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達(dá)于同一個細(xì)胞內(nèi)調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達(dá)于同一個細(xì)胞內(nèi) Company Logo應(yīng)用應(yīng)用: : 檢測酶活性變化檢測酶活性變化 關(guān)于膜蛋白的研究關(guān)于膜蛋白的研究 細(xì)胞膜受體之間相互作用細(xì)胞膜受體之間相互作用 細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用

19、Company Logo 光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)（光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)（fluorescence fluorescence recovery after recovery after photobleachingphotobleaching，F(xiàn)RAPFRAP）是是使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)測所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動及其遷移速率。動及其遷移速率。( (六六) )熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)Company Logo

20、FRAPFRAP技術(shù)的原理技術(shù)的原理 利用高能激光照射細(xì)胞的某一特定區(qū)域，使該利用高能激光照射細(xì)胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白（熒光漂白（photobleachingphotobleaching）區(qū)。隨后，由于細(xì)胞）區(qū)。隨后，由于細(xì)胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動，周圍非漂白質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移。結(jié)果使熒光漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移。結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強(qiáng)度逐漸地回復(fù)到原有水平。區(qū)的熒光強(qiáng)度逐漸地回復(fù)到原有水平。 Company Logo應(yīng)用：應(yīng)

21、用： 測量測量2-2-維或維或3-3-維分子運(yùn)動的力度。維分子運(yùn)動的力度。 分子運(yùn)動包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子分子運(yùn)動包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子 的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運(yùn)動。的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運(yùn)動。 Company Logo二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡細(xì)胞中直徑小于細(xì)胞中直徑小于0.2um0.2um的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為超微結(jié)超微結(jié)構(gòu)構(gòu)（submicroscopic structuresubmicroscopic structure）。）。超微結(jié)構(gòu)需用超微結(jié)構(gòu)需用電子顯微鏡電子顯微鏡（electron electron microscopemicroscope）進(jìn)行觀察。

22、）進(jìn)行觀察。電子顯微鏡分辨率一般為電子顯微鏡分辨率一般為0.2 nm0.2 nm，最高達(dá)，最高達(dá)0.08 nm0.08 nm。Company Logo1 1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別（一）電子顯微鏡的基本知識（一）電子顯微鏡的基本知識Company Logo電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)別電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)別顯微顯微鏡鏡分辨分辨本領(lǐng)本領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理LMLMTEMTEM200nm200nm100nm100nm0.1nm0.1nm可見光可見光（400-400-700700） 紫外光紫外光（約（約200nm)200nm

23、)電子束電子束（0.01-0.01-0.90.9）玻璃透玻璃透鏡鏡玻璃透玻璃透鏡鏡電磁透電磁透鏡鏡不要求真不要求真空空不要求真不要求真空空要求真空要求真空1.33x101.33x10- -5 51.33x101.33x10- -3 3PaPa利用樣品對光的吸利用樣品對光的吸收形成明暗反差和收形成明暗反差和顏色變化顏色變化利用樣品對電子的利用樣品對電子的散射和透射形成明散射和透射形成明暗反差暗反差Company Logo、電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)和有效放大倍數(shù)、電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)和有效放大倍數(shù)分辨本領(lǐng)：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨分辨本領(lǐng)：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡分辨率受制樣技術(shù)的影響。

24、率電鏡分辨率受制樣技術(shù)的影響。、電子顯微鏡的基本構(gòu)造、電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)：電子槍、聚光鏡。電子束照明系統(tǒng)：電子槍、聚光鏡。成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡等。成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡等。真空系統(tǒng)：保持電子槍、鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空系統(tǒng)：保持電子槍、鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空，以利于電子的運(yùn)動。真空，以利于電子的運(yùn)動。記錄系統(tǒng)記錄系統(tǒng)Company Logo（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹1 1、超薄切片技術(shù)、超薄切片技術(shù) 取材：取材：必須要做到快、小、準(zhǔn)、冷等四大要點(diǎn)。必須要做到快、小、準(zhǔn)、冷等四大要點(diǎn)。 固定：通常以鋨酸和戊二醛固定樣品。固定：通常以鋨

25、酸和戊二醛固定樣品。 脫水：乙醇或丙酮梯度脫水，脫水：乙醇或丙酮梯度脫水，50507070808090909595( (每次每次5-15min)1005-15min)100(2-3(2-3次，每次次，每次15min)10015min)100環(huán)氧環(huán)氧丙烷。丙烷。 包埋：環(huán)氧樹脂包埋。包埋：環(huán)氧樹脂包埋。 切片：以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片。切片：以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片。 染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色形成明暗的黑白圖象。染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色形成明暗的黑白圖象。Company Logo 用重金屬鹽用重金屬鹽( (如磷鎢酸如磷鎢酸) )對鋪展在載網(wǎng)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥

26、后，樣上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)分辨力可達(dá)1.5nm1.5nm左右。左右。2 2、負(fù)染技術(shù)、負(fù)染技術(shù)負(fù)染色的肌動蛋白負(fù)染色的肌動蛋白Company Logo3 3、冰凍蝕刻、冰凍蝕刻 freeze-etchingfreeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽

27、碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)（和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)（replicareplica）。）。Company Logo、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)、電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 對樣品在不同的傾角拍照，得到圖片對樣品在不同的傾角拍照，得到圖片經(jīng)處理后而展現(xiàn)的電子密度圖。電鏡三維經(jīng)處理后而展現(xiàn)的電子密度圖。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與重構(gòu)技術(shù)與X-X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Structural BiologyStructural Biology）（主要研究生物）（主要研

28、究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系）的主要實(shí)大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系）的主要實(shí)驗(yàn)手段。驗(yàn)手段。Company Logo 透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（Transmission Electron Transmission Electron MicroscopeMicroscope，TEMTEM）是利用高能電子束充當(dāng)照明）是利用高能電子束充當(dāng)照明光源而進(jìn)行放大成像的大型顯微分析設(shè)備。光源而進(jìn)行放大成像的大型顯微分析設(shè)備。19331933年，德國科學(xué)家盧斯卡（年，德國科學(xué)家盧斯卡（RuskaRuska）和克諾爾）和克諾爾（KnollKnoll）研制出了世界上第一臺透射電鏡，并）研制出了世界上第一臺

29、透射電鏡，并在在19391939年由西門子公司以這臺電鏡為樣機(jī)，量產(chǎn)年由西門子公司以這臺電鏡為樣機(jī)，量產(chǎn)了第一批商品透射電鏡，約了第一批商品透射電鏡，約4040臺，分辨能力比光臺，分辨能力比光學(xué)顯微鏡提高了學(xué)顯微鏡提高了2020倍倍。 5 5、透射電鏡技術(shù)、透射電鏡技術(shù)Company Logo 總體設(shè)計(jì)與光鏡相似，但總體設(shè)計(jì)與光鏡相似，但要大得多，且上下顛倒。要大得多，且上下顛倒。l電鏡用電子流（電子槍發(fā)電鏡用電子流（電子槍發(fā)射的高速電子束）代替照射的高速電子束）代替照明的光線；明的光線；l用特殊的電極或磁極（靜用特殊的電極或磁極（靜電透鏡和磁透鏡）代替聚電透鏡和磁透鏡）代替聚光鏡、目鏡和物鏡

30、的作用，光鏡、目鏡和物鏡的作用，達(dá)到聚焦和放大的作用。達(dá)到聚焦和放大的作用。Company Logo 工作原理工作原理 當(dāng)電子束透射樣品時，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的當(dāng)電子束透射樣品時，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余電子成像，經(jīng)不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡等放大后投射到照相底片上或熒光屏物鏡和投射鏡等放大后投射到照相底片上或熒光屏上。散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部上。散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)，相反，標(biāo)本密分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)，相反，標(biāo)本密度小的部位散射的電子少而形成明區(qū)。度小的部位散射

31、的電子少而形成明區(qū)。 由于透射電鏡的電子穿透力較弱，所以觀察樣由于透射電鏡的電子穿透力較弱，所以觀察樣品需特殊制備成超薄切片（其厚度一般為品需特殊制備成超薄切片（其厚度一般為50-50-100nm100nm）。）。 Company Logo特點(diǎn)：特點(diǎn)：以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓加速電壓( (通常通常50-120KV)50-120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5 5部分構(gòu)成。部分構(gòu)成。分辨力分辨力

32、0.2nm0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2um0.2um）。）。Company LCompany Logo 掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（scanning electron scanning electron microscopemicroscope，SEMSEM）是一種利用電子束掃描樣）是一種利用電子束掃描樣品表面從而獲得樣品信息的電子顯微鏡。它能品表面從而獲得樣品信息的電子顯微鏡。它能產(chǎn)生樣品表面的高分辨率圖像，且圖像呈三維。產(chǎn)生樣品表面的高分辨率圖像，且圖像呈三維。分辨力為分辨力為6-10nm6-10nm，由于人眼

33、的分辨力（區(qū)別熒，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點(diǎn)的能力）光屏上距離最近兩個光點(diǎn)的能力）0.2mm0.2mm，掃，掃描電鏡的有效放大倍率為描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X0.2mm/10nm=20000X。6 6、掃描電鏡技術(shù)、掃描電鏡技術(shù)Company LCompany Logo 通過電子束照射在標(biāo)本后產(chǎn)生的通過電子束照射在標(biāo)本后產(chǎn)生的二次電子成像二次電子成像，二次電子產(chǎn)生的，二次電子產(chǎn)生的多少與電子束在標(biāo)本表面的投射多少與電子束在標(biāo)本表面的投射角有關(guān)，即與樣品的表面結(jié)構(gòu)有角有關(guān)，即與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。經(jīng)標(biāo)本表面所發(fā)射的二次電關(guān)。經(jīng)標(biāo)本表面所發(fā)射的二次

34、電子由探測體收集，并在那里被閃子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜卦龉芎头糯笃鬓D(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹?qiáng)度，顯示制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。面結(jié)構(gòu)。Company Logo 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信

35、號。Company LCompany Logo人類精子人類精子紅細(xì)胞紅細(xì)胞Company Logo三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling scanning tunneling microscopemicroscope，STMSTM）是一種利用量子理論中的隧）是一種利用量子理論中的隧道效應(yīng)探測物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的儀器。它于道效應(yīng)探測物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的儀器。它于19811981年由年由格爾德格爾德賓寧及海因里希賓寧及海因里希羅雷爾在羅雷爾在IBMIBM位于瑞士蘇位于瑞士蘇黎世的蘇黎世實(shí)驗(yàn)室發(fā)明，兩位發(fā)明者因此與恩黎世的蘇黎世實(shí)驗(yàn)室發(fā)明，兩位

36、發(fā)明者因此與恩斯特斯特魯斯卡分享了魯斯卡分享了19861986年諾貝爾物理學(xué)獎。年諾貝爾物理學(xué)獎。 Company Logo原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（疊，外加一電壓（2mV-2V2mV-2V），針尖與樣品之間形成），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)

37、。顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)榉直媛剩簷M向?yàn)?.1-0.2nm0.1-0.2nm，縱向可達(dá)，縱向可達(dá)0.001nm0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。察。搬動搬動4848個個FeFe原子到原子到CuCu表面上構(gòu)成的量子圍欄表面上構(gòu)成的量子圍欄一氧化碳分子豎立在鉑表面上一氧化碳分子豎立在鉑表面上 形成的形成的“分子分子人人”Company Logo硅表面77重構(gòu)圖 硅表面硅原子的排列硅表面硅原子的排列 7 7個鈾原子團(tuán)個鈾原子團(tuán)Company Logo原子力顯微鏡原子力顯微鏡 原子力顯微鏡（原子力顯微鏡（Atom

38、ic Atomic Force Microscope Force Microscope ，AFMAFM）是繼掃描隧道顯是繼掃描隧道顯微鏡之后發(fā)明的一種具微鏡之后發(fā)明的一種具有原子級高分辨的新型有原子級高分辨的新型儀器。儀器。19861986年第一臺原年第一臺原子力顯微鏡問世。子力顯微鏡問世。Company Logo原理：是一種利用原子、分子間的相互作用力來觀原理：是一種利用原子、分子間的相互作用力來觀察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它有一根納察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它有一根納米級的探針米級的探針, ,被固定在可靈敏操控的微米級彈性懸被固定在可靈敏操控的微米級彈性懸臂上。當(dāng)探針很靠近

39、樣品時，其頂端的原子與樣品臂上。當(dāng)探針很靠近樣品時，其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會使懸臂彎曲，偏離原來的位表面原子間的作用力會使懸臂彎曲，偏離原來的位置。根據(jù)掃描樣品時探針的偏離量或振動頻率重建置。根據(jù)掃描樣品時探針的偏離量或振動頻率重建三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。分。應(yīng)用應(yīng)用: :可以在大氣和液體環(huán)境下對各種材料和樣品可以在大氣和液體環(huán)境下對各種材料和樣品進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測，或者進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測，或者直接進(jìn)行納米操縱直接進(jìn)行納米操縱。 局局部部蝴蝴蝶蝶翅翅膀膀鱗鱗片片 紅血細(xì)胞形

40、貌圖紅血細(xì)胞形貌圖 多孔氧化鋁范本多孔氧化鋁范本Company Logo第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物及其復(fù)合物轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min10000-25000r/min的離心機(jī)稱為高速的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。離心機(jī)。轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速25000r/min25000r/min，離心力，離心力89K89K者稱為超者稱為超速離心機(jī)。速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min100000r/min，離心力超過，離心力超過500Kg500K

41、g。 Company Logo1、差速離心技術(shù)：、差速離心技術(shù)：定義：差速離心（定義：差速離心（differential centrifugationdifferential centrifugation）是采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度是采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。不同的顆粒分批分離的方法。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核沉降順序：核線粒體線粒體溶酶體與過氧化物溶酶體與過氧化物酶體酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離可將細(xì)胞器初步分

42、離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。心再行分離純化。 Company Logo2 2、密度梯度離心、密度梯度離心定義：密度梯度離心（定義：密度梯度離心（density gradient density gradient centrifugationcentrifugation）是）是用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞

43、的介質(zhì)要求：分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：有足夠大的溶解度；不與有足夠大的溶解度；不與分離組分反應(yīng)；而且不會引起分離組分的凝集、變分離組分反應(yīng)；而且不會引起分離組分的凝集、變性或失活。性或失活。Company Logo原理：原理： 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量的分布和含量。二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)等成分的顯示方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)等成分的顯示方法Company Log

44、o 蛋白質(zhì)定性：蛋白質(zhì)定性：氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物紫色化合物；蛋白質(zhì)與米倫試劑反應(yīng)形成紅色；蛋白質(zhì)與米倫試劑反應(yīng)形成紅色沉淀（酪氨酸特有）；氫氧化重氮與蛋白質(zhì)反沉淀（酪氨酸特有）；氫氧化重氮與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成有色復(fù)合物。應(yīng)形成有色復(fù)合物。 金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成成CoSCoS或或PbSPbS有色沉淀，而顯示出酶活性。有色沉淀，而顯示

45、出酶活性。Company LogoDNADNA定性：定性：FeulgenFeulgen反應(yīng)（醛基可使反應(yīng)（醛基可使SchiffSchiff試劑試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色）。中的無色品紅變?yōu)榧t色）。多糖定性：多糖定性：PASPAS反應(yīng)即過碘酸希夫反應(yīng)（過碘反應(yīng)即過碘酸希夫反應(yīng)（過碘酸可氧化多糖使其暴露出醛基，醛基與品紅反酸可氧化多糖使其暴露出醛基，醛基與品紅反應(yīng)）。應(yīng)）。脂肪定性：脂肪定性：四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應(yīng)呈四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應(yīng)呈黑色，證明脂肪滴的存在；蘇丹黑色，證明脂肪滴的存在；蘇丹使脂滴呈深使脂滴呈深紅紅。Company Logo三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原

46、的定位與定性( (一一) )免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)熒光素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)（immunofluorescenceimmunofluorescence ）。）。l常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。l常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody me

47、thodenzyme-labeled antibody method）：）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。Company Logo( (二二) )免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù) 又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法。

48、該方法為精確定位各種抗原的量抗原的技術(shù)方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理存在部位、研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)以及技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)以及膠體金標(biāo)記技術(shù)三個主要發(fā)展階段。膠體金標(biāo)記技術(shù)三個主要發(fā)展階段。 Company Logo鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù) 適用于細(xì)胞膜表面抗原的定位，由于其適用于細(xì)胞膜表面抗原的定位，由于其分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜，定位細(xì)胞內(nèi)分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜，定位細(xì)胞內(nèi)抗

49、原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特抗原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特異性吸附很強(qiáng)，不適用于包埋后免疫標(biāo)記，異性吸附很強(qiáng)，不適用于包埋后免疫標(biāo)記，使其應(yīng)用受到一定限制。使其應(yīng)用受到一定限制。 Company Logo酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) 將酶（主要是過氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，將酶（主要是過氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應(yīng)后，加底物顯示酶的活性部位，酶抗原抗體反應(yīng)后，加底物顯示酶的活性部位，酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsOOsO4 4處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子量黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子量較小

50、，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經(jīng)處理的細(xì)胞膜，較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經(jīng)處理的細(xì)胞膜，可用于細(xì)胞內(nèi)抗原的定位。但是酶反應(yīng)產(chǎn)物比較可用于細(xì)胞內(nèi)抗原的定位。但是酶反應(yīng)產(chǎn)物比較彌散，因此分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高。彌散，因此分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高。Company Logo膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) 目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標(biāo)記物，該技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標(biāo)記物，該技術(shù)是將膠體金作為抗體的標(biāo)記物，用于細(xì)胞表面和將膠體金作為抗體的標(biāo)記物，用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多種抗原的精確定位。膠體金是直徑細(xì)胞內(nèi)多種抗原的精確定位。膠體金是直徑1-1-100nm100nm的金顆粒分散在水中形成的金溶膠

51、。特異的金顆粒分散在水中形成的金溶膠。特異性強(qiáng)，容易識別。分辨率高。性強(qiáng)，容易識別。分辨率高。Company Logo四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性 分子雜交技術(shù)：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條分子雜交技術(shù)：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系

52、。Company Logo（一）原位雜交（一）原位雜交（in situ hybridizationin situ hybridization） 原位雜交技術(shù)：用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交原位雜交技術(shù)：用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交, ,經(jīng)經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，放射自顯影或非放射檢測體系，確定特殊核苷酸序確定特殊核苷酸序列在染色體或細(xì)胞中位置的方法。列在染色體或細(xì)胞中位置的方法。最初是使用帶放最初是使用帶放射性的射性的DNADNA探針探針，后來又發(fā)明了，后來又發(fā)明了免疫探針免疫探針法。法。 分分RNARNA原位雜交原位雜交和和染色體原位雜交染色體原位雜交兩大類。兩大類。l光鏡水平的原位雜交

53、技術(shù)：同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針。光鏡水平的原位雜交技術(shù)：同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針。l電鏡水平的原位雜交技術(shù)：生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗電鏡水平的原位雜交技術(shù)：生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合。體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合。標(biāo)記特異性探針標(biāo)記特異性探針RNA被固定的組織切片被固定的組織切片若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子分子放射自顯影或酶促免疫顯色放射自顯影或酶促免疫顯色放射性物質(zhì)或非放射性（如生物素）放射性物質(zhì)或非放射性（如生物素）對該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞對該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出定位定量的分析水平上做出定位定量的分析反應(yīng)反應(yīng)RNARN

54、A原位雜交原位雜交熒光素標(biāo)記探針熒光素標(biāo)記探針DNA染色體染色體DNA檢測熒光素來確定與探針檢測熒光素來確定與探針DNA序列雜交的序列雜交的互補(bǔ)序列在染色體或互補(bǔ)序列在染色體或DNA 上的位置上的位置熒光原位雜交顯示的端粒熒光原位雜交顯示的端粒 熒光原位雜交顯示的人體著絲粒衛(wèi)星熒光原位雜交顯示的人體著絲粒衛(wèi)星DNA 熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridizationfluorescence in situ hybridization）Company Logo（二）（二）SouthernSouthern雜交雜交 體外分析特異體外分析特異DNAD

55、NA序列的方法，操作時先用序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核限制性內(nèi)切酶將核DNADNA或線粒體或線粒體DNADNA切成切成DNADNA片段，片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將將RNARNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為NorthernNorthern雜交。雜交。Company LCompany Logo五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、

56、組織和細(xì)胞中的分布、用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。放射性曝光，使乳膠感光。一般用一般用1414C C和和3 3H H標(biāo)記。常用標(biāo)記。常用3 3H H - -TdRTdR來顯示來顯示DNADNA，用，用3 3H H- -UdRUdR顯示顯示RNARNA；用；用3 3H H氨基酸研究

57、蛋白質(zhì)，用氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3 3H H甘露糖、甘露糖、3 3H H巖藻糖研究多糖。巖藻糖研究多糖。1414C C半衰期為半衰期為57305730年，年，3 3H H為為12.512.5年。年。Company Logo六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)（一）流式細(xì)胞術(shù)（一）流式細(xì)胞術(shù)原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)

58、結(jié)果，并可根電信號，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)達(dá)99%99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（流式細(xì)胞計(jì)（flow flow cytometercytometer）。）。Company Logo用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。一門技術(shù)。用于定量測定細(xì)胞中的用于定量測定細(xì)胞中的DNADNA、RNARNA或或某一特異蛋白的含量；某一特異蛋白的含量；l測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量；測定細(xì)

59、胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量；l從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；l分離分離DNADNA含量不同的中期染色體。含量不同的中期染色體。 Company Logo 當(dāng)含有單個細(xì)胞的液當(dāng)含有單個細(xì)胞的液滴通過激光束時，帶滴通過激光束時，帶有不同熒光的細(xì)胞所有不同熒光的細(xì)胞所在的液滴被充上正電在的液滴被充上正電荷、負(fù)電荷或不被充荷、負(fù)電荷或不被充電，因帶有不同表面電，因帶有不同表面標(biāo)記的細(xì)胞所帶的電標(biāo)記的細(xì)胞所帶的電荷不同，當(dāng)液滴通過荷不同，當(dāng)液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時，液滴高壓偏轉(zhuǎn)板時，液滴發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到將細(xì)胞分選的目的。將細(xì)胞分選的目的。Comp

60、any Logo（二）顯微分光光度測定技術(shù)（二）顯微分光光度測定技術(shù) 根據(jù)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對光譜吸收的原理，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對光譜吸收的原理，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等重要生測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等重要生物分子）在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞某一部分結(jié)構(gòu)內(nèi)物分子）在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞某一部分結(jié)構(gòu)內(nèi)化學(xué)成分的含量，同時可進(jìn)行定位、定性化學(xué)成分的含量，同時可進(jìn)行定位、定性和定量的方法。和定量的方法。l紫外光顯微分光光度測定法紫外光顯微分光光度測定法l可見光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法Company Logo七、七、PCR PCR 技術(shù)技術(shù) PCR PCR是是polymerase chain re