實驗高效液相色譜法(2015年)

1、高效液相色譜法測定飲料中山高效液相色譜法測定飲料中山梨酸、苯甲酸和糖精鈉梨酸、苯甲酸和糖精鈉 1.掌握高效液相色譜法測定飲料中糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的原理和方法 2.熟悉高效液相色譜儀的使用方法 3.了解高效液相色譜儀的儀器結(jié)構(gòu) 目的與要求目的與要求 方法原理方法原理 在適宜的條件下,高效液相色譜可同時分離飲料中的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸。樣品超聲超聲除去二氧化碳和乙醇,調(diào)pH至近中性,過濾后進高效液相色譜儀,經(jīng)反相C18 液相色譜分離后,紫外檢測器230nm波長處檢測。 以色譜峰的保留時間保留時間定性定性,利用色譜峰面積色譜峰面積在一定范圍內(nèi)與濃度呈線性關(guān)系進行定量定量1.儀器儀器: 高效液相

2、色譜儀,配備二極管陣列檢測器; 超聲波清洗儀; 50ml容量瓶;50ml燒杯;50l微量進樣器儀器與試劑儀器與試劑 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(10.0mg/ml): 準(zhǔn)確稱取于120烘干4h后的糖精鈉(C6H4CONNaSO22H2O)0.5000g,加水溶解 后定容至50ml 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(5.0mg/ml): 準(zhǔn)確稱取0.2500g,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解, 定容至50ml 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(5.0mg/ml): 準(zhǔn)確稱取0.2500g山梨酸,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶 解,定容至50ml 標(biāo)準(zhǔn)混合使用液標(biāo)準(zhǔn)混合使用液

3、(含糖精鈉1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.0ml,加水定容至 50ml2.試劑試劑: 稀氨水(1+1);碳酸氫鈉溶液:20g/L;甲醇(色譜純)2.2.配制標(biāo)準(zhǔn)系列配制標(biāo)準(zhǔn)系列: : 取9只50ml容量瓶分別編上號碼,按下表配制標(biāo)準(zhǔn)系列。 混合標(biāo)樣中各物質(zhì)的濃度混合標(biāo)樣中各物質(zhì)的濃度1.樣品處理樣品處理:吸取10.0020.00ml汽水,放入50ml燒杯中, 超聲除去二氧化碳,用稀氨水調(diào)pH7.0,加水定容至50ml,用濾膜(0.45m)過濾,備用。 操作步驟操作步驟 1.插好電極,打開電源開關(guān),按模式鍵切換到pH測量狀態(tài) 2.用兩

4、點法進行校正(b=2)(pH 4.01,6.86,9.18)3.按模式進入b=24.將電極浸入標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中(pH=6.86),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_ 終點時顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;將電極放入第二種 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH=4.01或9.18),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_ 終點時 顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;按“讀數(shù)”,保存校正結(jié)果 并退回到正常的測量狀態(tài)5.將電極插入到被測液中,調(diào)節(jié)pH到所需值pH計的使用計的使用(1)過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。前處理前處理濾膜類型：濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，

5、酸和鹽醋酸纖維濾膜：醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水溶劑尼龍尼龍6666濾膜：濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜：再生纖維素濾膜：同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑3.測定測定色譜條件色譜條件: 色譜柱:C18 ,4.6mm150mm;流動相流動相: 甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(5+95);流速流速:1ml/min 檢測波長檢測波長:230nm 取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各10l注入高效液相色譜儀進行分離,以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間為依據(jù)進行定性。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(或計算回歸方

6、程),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或根據(jù)回歸方程求出)樣液中被測物質(zhì)的含量,按下式計算:V0 xVCC式中: Cx為樣品中被測物的含量,g/kg C 為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的相對應(yīng)的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml V0 為樣品定容體積,ml V 為取樣體積,ml思考題思考題1.為什么被測溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm為測定波長,對樣品中山梨酸的測定有何影響？ 注意事項注意事項 1.流動相使用前必須經(jīng)過脫氣。如果流動相中含有氣體,在較高的柱壓下會產(chǎn)生氣泡,使流動相流動受阻,對分離樣品產(chǎn)生不利影響2.應(yīng)通過預(yù)實驗調(diào)整和最后確定流動相實際配比,以使各分析組分的分離效果最佳3.被測溶液pH值對測

7、定和色譜柱使用壽命均有影響,以中性為宜4.苯甲酸、糖精鈉的靈敏波長為230nm,山梨酸靈敏波長為254nm,在此波長測定時苯甲酸和糖精鈉的靈敏度較低,因此采用230nm為測定波長(2)脫氣：脫氣： 除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動A.示差折射率檢測器 *使折射率變化B.UV檢測器（200nm以下） *溶解氧氣有吸收 C. 熒光檢測器 *溶解氧氣有消光作用1. 吸氣器法（流動相抽濾） *可以抑制制做流動相時產(chǎn)生的氣泡 *只是暫時的脫氣法 *不能解決因溶解氣體造成

8、的問題2. 超聲脫氣法3. 使用氟樹脂膜的減壓脫氣法溶劑前處理溶劑前處理-脫氣脫氣使用超聲波震蕩器，一般超聲震蕩 15 分鐘左右注意流動相在超聲震蕩脫氣過程中，溫度會升 高，應(yīng)待其降至室溫后再上機使用。由于液體對氣體的溶解作用，時間長后氣體會 再溶入流動相中，應(yīng)引起注意。溶劑前處理溶劑前處理-脫氣脫氣溶劑前處理溶劑前處理- -脫氣脫氣使用氟樹脂膜的減壓脫氣法氟樹脂膜氟樹脂膜真空室真空室真空泵真空泵流動相流動相往送液泵往送液泵緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要進行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞: 用含5%甲醇的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min用純水沖洗泵頭清洗管

9、路 易受到細(xì)菌和霉菌的影響不能直接用有機溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖液流動相的更換不互溶的流動相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機溶劑水液相色譜簡易流程圖輸輸液液泵泵進樣進樣器器 色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器溶溶劑劑數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處處理理廢液廢液液相系統(tǒng)維護流程圖吸濾頭吸濾頭單向閥單向閥柱塞密封圈柱塞密封圈線路過濾器線路過濾器手動進樣器手動進樣器檢測器檢測器色譜柱色譜柱泵工作示意圖 凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥 泵頭流動相入口流動相入口流動相出口流動相出口LC-20AT串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵LC-20AD 并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵柱塞泵的基

10、本結(jié)構(gòu) LC-10ATvp LC-10ADvp 單向閥單向閥單向閥1_at.flv1_ad.flv單向閥單向閥結(jié)構(gòu)球座吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭拋光面寶石球流動相單向閥工作原理單向閥結(jié)構(gòu)請不要分解閥心A和閥心B重新組裝后性能不被保證，輸液可能不穩(wěn)定注意：線路過濾器故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力偏高措施：異丙醇（或5稀硝酸）， 超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力0.5MPa，則堵塞。排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相線路過濾器部件號：部件號：228-32744228-32744Minutes0246810121416182022mAU020406080100120140空白樣品色譜圖空白樣品色譜圖 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖 Minutes02