大腸菌群檢測操作規(guī)范培訓(xùn)

1、大腸菌群檢測操作規(guī)范培訓(xùn)大腸菌群檢測操作規(guī)范培訓(xùn)質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部目錄目錄一、細菌介紹一、細菌介紹二、大腸桿菌生物學(xué)特性二、大腸桿菌生物學(xué)特性三、大腸桿菌檢測儀器、設(shè)備三、大腸桿菌檢測儀器、設(shè)備四、檢測培養(yǎng)基及試劑四、檢測培養(yǎng)基及試劑五、檢測前培養(yǎng)基準備五、檢測前培養(yǎng)基準備六、接種培養(yǎng)六、接種培養(yǎng)七、七、MPN單位介紹單位介紹八、檢測注意事項八、檢測注意事項一、細菌介紹一、細菌介紹細菌是單細胞原核微生物，個體微小細菌是單細胞原核微生物，個體微小（細胞直徑約（細胞直徑約0.5m, 0.5-5m），結(jié)構(gòu)），結(jié)構(gòu)簡單，以二等分裂方式繁殖。在自然簡單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細菌分布最廣、數(shù)

2、量最多。界中，細菌分布最廣、數(shù)量最多。1、細菌的形態(tài) 細菌個體微小、形態(tài)各異細菌個體微小、形態(tài)各異球菌球菌桿菌桿菌弧菌與彎曲菌弧菌與彎曲菌螺旋菌及螺旋體螺旋菌及螺旋體不規(guī)則形不規(guī)則形弧菌弧菌2、細菌的結(jié)構(gòu) 細菌的基本結(jié)構(gòu)包括：細胞壁、細菌的基本結(jié)構(gòu)包括：細胞壁、 細胞膜、細胞膜、間體、細胞漿、核糖體、細胞質(zhì)。間體、細胞漿、核糖體、細胞質(zhì)。 細菌的附屬結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)粒、莢膜、鞭毛、細菌的附屬結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)粒、莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞。菌毛和芽胞。3、細菌的繁殖 細菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁細菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延長菌體，染色體復(fù)制為二，殖。在分裂前先延長菌體

3、，染色體復(fù)制為二，然后垂直于長軸分裂，細胞赤道附近的細胞質(zhì)然后垂直于長軸分裂，細胞赤道附近的細胞質(zhì)膜凹陷生長，直至形成橫隔膜，同時形成橫隔膜凹陷生長，直至形成橫隔膜，同時形成橫隔壁，這樣便產(chǎn)生兩個子細胞壁，這樣便產(chǎn)生兩個子細胞。 4、細菌的菌落 單個或少數(shù)細菌細胞生長繁殖后，會形成單個或少數(shù)細菌細胞生長繁殖后，會形成以母細胞為中心的一堆肉眼可見、有一定以母細胞為中心的一堆肉眼可見、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團菌落。形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團菌落。細菌菌落常表現(xiàn)為濕潤、粘稠、光滑、較細菌菌落常表現(xiàn)為濕潤、粘稠、光滑、較透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部

4、位顏色一致等?；蜻吘壟c中央部位顏色一致等。 細菌的菌落圖細菌的菌落圖二、大腸桿菌生物學(xué)特性大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括埃希氏菌、檸檬酸細菌、腸桿菌、主要包括埃希氏菌、檸檬酸細菌、腸桿菌、克雷伯氏菌等，均屬于腸桿菌。克雷伯氏菌等，均屬于腸桿菌。大腸菌群以大腸埃希氏菌為主，是革蘭氏大腸菌群以大腸埃希氏菌為主，是革蘭氏陰性、兩端鈍圓的桿菌，無芽孢，以周生陰性、兩端鈍圓的桿菌，無芽孢，以周生鞭毛運動或不運動。鞭毛運動或不運動。最適生長溫度為最適生長溫度為37，在，在42-

5、44條件下仍條件下仍能生長，生長溫度范圍為能生長，生長溫度范圍為15-46。1、大腸桿菌平板菌落圖片、大腸桿菌平板菌落圖片2、大腸桿菌革蘭氏染色圖片、大腸桿菌革蘭氏染色圖片3、大腸桿菌微菌落圖片、大腸桿菌微菌落圖片4、大腸桿菌透射電鏡圖片、大腸桿菌透射電鏡圖片5、大腸桿菌掃描電鏡圖片、大腸桿菌掃描電鏡圖片6、大腸桿菌分裂圖片、大腸桿菌分裂圖片三、檢測儀器、設(shè)備三、檢測儀器、設(shè)備 冰箱：冰箱：04 恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：361 恒溫水浴鍋：恒溫水浴鍋：461 微生物顯微鏡微生物顯微鏡架盤藥物天平：架盤藥物天平：0g500g，精確至，精確至0.5g 三角瓶：三角瓶：500ml 滅菌吸管：滅菌吸管

6、：1ml、10ml 滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm 試管：試管：18180mm四、檢測培養(yǎng)基及試劑四、檢測培養(yǎng)基及試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍瓊脂伊紅美藍瓊脂乳糖發(fā)酵管乳糖發(fā)酵管革蘭氏染色液革蘭氏染色液生理鹽水生理鹽水乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測定。乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測定。35g乳糖膽鹽于乳糖膽鹽于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，試管中，放入小倒管，11515分鐘高壓滅菌。分鐘高壓滅菌。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其它成分加雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其它成分加倍。倍。乳糖發(fā)酵管：大腸菌群證實試驗用。乳糖發(fā)酵管

7、：大腸菌群證實試驗用。 30g乳乳糖于糖于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，中，放入小倒管，11515分鐘高壓滅菌。分鐘高壓滅菌。伊紅美蘭瓊脂：用于大腸菌群的固體平板伊紅美蘭瓊脂：用于大腸菌群的固體平板檢測。檢測。 37.5g于于1升蒸餾水中，搖勻，加熱升蒸餾水中，搖勻，加熱煮沸，煮沸，12115分鐘高壓滅菌。分鐘高壓滅菌。五、檢測前培養(yǎng)基準備五、檢測前培養(yǎng)基準備 檢查預(yù)先經(jīng)過滅菌處理的乳糖膽鹽發(fā)酵培檢查預(yù)先經(jīng)過滅菌處理的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基小導(dǎo)管內(nèi)是否有氣體。養(yǎng)基小導(dǎo)管內(nèi)是否有氣體。按產(chǎn)品品種將培養(yǎng)基分別放在試管架內(nèi)，按產(chǎn)品品種將培養(yǎng)基分別放在試

8、管架內(nèi)，同時將同時將9ml 0.85%滅菌鹽水管也放入相應(yīng)的滅菌鹽水管也放入相應(yīng)的試管架內(nèi)。試管架內(nèi)。六、接種培養(yǎng) （一）酸牛奶系列產(chǎn)品（一）酸牛奶系列產(chǎn)品酸牛奶系列產(chǎn)品接種單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)酸牛奶系列產(chǎn)品接種單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基基9支管，分別接種樣品量為支管，分別接種樣品量為1ml (原濃度原濃度)3支，支，0.1ml (10-1濃度濃度)3支，支，0.01ml (10-2濃度濃度)3支。支。 1、 1ml接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)在無菌條件下，用在無菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1ml樣樣品試液于含有品試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成振蕩搖勻制成

9、1:10的稀釋液；同時分別吸取的稀釋液；同時分別吸取1ml樣品試液于樣品試液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。并輕微振蕩搖勻，放入原位置。2、 0.1ml接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)另換另換1根根1ml滅菌移液管吸取滅菌移液管吸取1:10的稀釋液的稀釋液1ml于含有于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成蕩搖勻制成1:100的稀釋液；同時分別吸取的稀釋液；同時分別吸取1ml 1:10稀釋液于稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。3、 0.01ml接種培養(yǎng)接種

10、培養(yǎng)另換另換1根根1ml滅菌移液管分別吸取滅菌移液管分別吸取1ml 1:100稀釋液于稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。并輕微振蕩搖勻，放入原位置。4、接種過程操作錄像接種過程操作錄像檢測檢測單料大腸檢單料大腸檢測測.MPG討論討論錄像中存在的問題：錄像中存在的問題：1、整個微生物檢測前應(yīng)先消毒手。、整個微生物檢測前應(yīng)先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕輕抖出。輕抖出

11、。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。5、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。5、接種后培養(yǎng)、接種后培養(yǎng)將接種完的試管連同試管架一起置于將接種完的試管連同試管架一起置于361的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)242h，觀察乳糖，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。膽鹽發(fā)酵管的變化情況。6、結(jié)果查詢并記錄、結(jié)果查詢并記錄若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報告大腸菌群陰性。報告大腸菌群陰性。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。（二）活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品（二）活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品活性

12、乳酸菌飲料系列產(chǎn)品接種雙料乳糖膽活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品接種雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基鹽發(fā)酵培養(yǎng)基3支管，單料乳糖膽鹽發(fā)酵培支管，單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基養(yǎng)基6支，分別接種樣品量為支，分別接種樣品量為10ml 3支，支，1ml 3支，支，0.1ml 3支。支。1、 10ml接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)在無菌條件下，用在無菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1ml樣品樣品試液于含有試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成搖勻制成1:10的稀釋液；同時用的稀釋液；同時用10ml滅菌吸管滅菌吸管分別吸取分別吸取10ml樣品試液于樣品試液于3支雙料乳糖膽鹽發(fā)支雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，

13、并輕微振蕩搖勻，放入原位置。酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。2、 1ml接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)另用另用1ml滅菌移液管分別吸取滅菌移液管分別吸取1ml 樣品試液樣品試液于于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。搖勻，放入原位置。3、 0.1ml接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)另換另換1根根1ml滅菌移液管分別吸取滅菌移液管分別吸取1ml 1:10稀稀釋液于釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。振蕩搖勻，放入原位置。4、接種過程操作錄像、接種過程操作錄像檢測檢測雙料大腸檢雙料大腸檢測測.MPG討論討論錄像中存在的

14、細節(jié)問題：錄像中存在的細節(jié)問題：1、整個微生物檢測前應(yīng)先消毒手。、整個微生物檢測前應(yīng)先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕輕抖出。輕抖出。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。5、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。5、接種后培養(yǎng)、接種后培養(yǎng)將接種完的試管連同試管架一起置于將接種完的試管連同試管架一起置于361的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)242h，觀察乳糖，觀

15、察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。膽鹽發(fā)酵管的變化情況。6、結(jié)果查詢并記錄、結(jié)果查詢并記錄若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報告大腸菌群陰性。報告大腸菌群陰性。 若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。（三）證實試驗（三）證實試驗1、伊紅美藍瓊脂平板分離、伊紅美藍瓊脂平板分離將產(chǎn)酸產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的培養(yǎng)物分將產(chǎn)酸產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的培養(yǎng)物分別接種于伊紅美蘭瓊脂平板別接種于伊紅美蘭瓊脂平板(劃線分離劃線分離)，置，置于于361的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)242h。接種和分離工具接種和分離工具1接種針接種針 2.接種環(huán)接種環(huán) 3.接種鉤接種

16、鉤 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接種圈接種圈 7.接種鋤接種鋤 8.小解剖刀小解剖刀平板分離畫線法平板分離畫線法1.斜線法斜線法 2.曲線法曲線法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法將伊紅美藍瓊脂平板從培養(yǎng)箱取出后將伊紅美藍瓊脂平板從培養(yǎng)箱取出后,觀察觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗。試驗。革蘭氏染色：見革蘭氏染色：見革蘭氏染色及鏡檢操作革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范規(guī)范。（四）乳糖發(fā)酵試驗（四）乳糖發(fā)酵試驗挑取可疑菌落進行革蘭氏染色后接種乳糖挑取可疑菌落進行革蘭氏染色后接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于發(fā)酵培養(yǎng)基，置于361的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的

17、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。，觀察產(chǎn)氣情況。凡是革蘭氏陰性無芽孢桿菌乳糖發(fā)酵管產(chǎn)凡是革蘭氏陰性無芽孢桿菌乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌落即可報告大腸菌群陽性。酸產(chǎn)氣的菌落即可報告大腸菌群陽性。根據(jù)證實為大腸菌群的陽性管數(shù)，查根據(jù)證實為大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，查找每檢索表，查找每100ml樣品內(nèi)的大腸菌群的樣品內(nèi)的大腸菌群的MPN值。值。七、七、MPN單位介紹單位介紹MPN=Most Probable Number ，最大可能，最大可能數(shù)數(shù) ，是一種利用統(tǒng)計學(xué)檢測微生物的方法。，是一種利用統(tǒng)計學(xué)檢測微生物的方法。食品大腸菌群是以每克或食品大腸菌群是以每克或100ML中大腸菌中大腸菌群

18、的最近似值，是用群的最近似值，是用MPN來表示。來表示。采用采用9管法，對樣品選三個稀釋度，每個稀管法，對樣品選三個稀釋度，每個稀釋度接種三管相應(yīng)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然釋度接種三管相應(yīng)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后根據(jù)情況做出判斷陽性和陰性，再根據(jù)后根據(jù)情況做出判斷陽性和陰性，再根據(jù)不同稀釋度的陽性管數(shù)查表即可得到被測不同稀釋度的陽性管數(shù)查表即可得到被測樣品相應(yīng)指標(biāo)的樣品相應(yīng)指標(biāo)的MPN值。值。八、注意事項八、注意事項 乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)小導(dǎo)管內(nèi)如無氣泡，需輕振試乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)小導(dǎo)管內(nèi)如無氣泡，需輕振試管，若有氣泡上冒，也算產(chǎn)氣。管，若有氣泡上冒，也算產(chǎn)氣。 在伊紅美藍瓊脂平板上的菌落如為深紫色有金屬在伊紅美藍瓊脂平板上的菌落如為深紫色有金屬光澤，則為典型菌落，光澤，則為典型菌落，98%以上為大腸菌群。以上為大腸菌群。革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵時如有典型菌落，則挑取典革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵時如有典型菌落，則挑取典型菌落；無典型菌落，應(yīng)挑取紅色和粉色菌落。型菌落；無典型菌落，應(yīng)挑取紅色和粉色菌落。如果只有紅色或粉色菌落，應(yīng)挑取如果只有紅色或粉色菌落，應(yīng)挑取3個進行革蘭氏染個進行革蘭氏染色，并接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。色，并接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。如果有紅色和粉色菌落，則各挑取如果有紅色和粉色菌落，則各挑取3個做革蘭氏染色，個做革蘭氏染色，各挑取各挑取