微生物與環(huán)境監(jiān)測(cè)

1、Microbiology Department.College of Resource & Environment SWU. Li Yongl指示微生物（indicator microorganism）或稱指示菌（indicator bacteria）l是在常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)中，用以指示環(huán)境樣品污染性質(zhì)與程度，并評(píng)價(jià)環(huán)境衛(wèi)生狀況的具有代表性的微生物。l主要生物性污染：細(xì)菌、真菌、病毒等各類微生物均有。l細(xì)菌總數(shù)（total bacteria count）：指環(huán)境中被測(cè)樣品，在一定條件下（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、通氣狀況等）培養(yǎng)后所得的1m1或lg檢樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。l它反映環(huán)

2、境中異養(yǎng)型細(xì)菌的污染度，也間接反映一般營養(yǎng)性有機(jī)物的污染程度。1液態(tài)與固態(tài)對(duì)象中的細(xì)菌總數(shù)l天然水體、飲水、飲料等液體物l土壤、污泥、堆肥、食品、化妝品、藥品等固態(tài)物，l常用傾注平板培養(yǎng)法或平板表面涂布培養(yǎng)法。國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：l營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，l將經(jīng)過一定倍數(shù)稀釋的樣品懸液，定量接種于瓊脂培養(yǎng)基平板，或傾注混勻，或表面均勻涂布；l在有氧條件下，37培養(yǎng)48h觀察平板上菌落生長結(jié)果。2空氣中的細(xì)菌總數(shù)l平板暴露沉降法l儀器法 平板暴露沉降法：l采用直徑9cm平皿，將營養(yǎng)瓊脂平板在1.2 m高處暴露5 min，37培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)生長菌落數(shù)。l測(cè)定的結(jié)果不是十分準(zhǔn)確。l經(jīng)濟(jì)方便，有實(shí)用價(jià)值

3、。l儀器法中以固體撞擊式采樣器多用。結(jié)果：l采用個(gè)m1為單位來表示 lcfu（colony forming unit）表示 ：指單位體積、單位表面積或單位質(zhì)量檢樣中的菌落形成單位。 對(duì)象樣品細(xì)菌總數(shù)/（cfu/ml或g） 霉菌數(shù)/（cfu/ml或g）飲用水*1100水礦泉水*2水源水5灌裝水50體游泳池水*31 000消毒牛乳30 000全脂奶粉特級(jí)20 000食*一級(jí)30 000二級(jí)50 000肉灌腸類出廠20 000銷售50 000糕點(diǎn)、面包冷加工出廠5 000100品銷售10 000150糕點(diǎn)、面包冷加工出廠1 00050銷售1 500500化*5眼部、口唇、口腔黏膜500100妝兒童化

4、妝品500100品其他化妝品1 000100藥*6中藥片劑10 000500丸 劑50 000500品散劑100 000500我國公共場(chǎng)所空氣細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)*撞擊法/（cfu/m3）沉降法/（個(gè)/皿） 適用范圍1 0001035星級(jí)以下賓館，飯店1 500102星級(jí)以下賓館和非星級(jí)帶空調(diào)賓館，飯店2 500300普通飯店，招待所，酒吧，茶座，咖啡廳，圖書館，博物館，美術(shù)館，飛機(jī)客艙4 00040影劇院，音樂廳，錄像廳，醫(yī)院候診室，候機(jī)室旅客列車車廂，輪船客艙，飯館（餐廳）7 00075展覽館，商場(chǎng)（店），候車室，候船室4 00040游泳館l霉菌和酵母菌數(shù)（fungi and yeast coun

5、t）是指環(huán)境中被測(cè)樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或lm1檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落數(shù)。l霉菌和酵母菌是異養(yǎng)型微生物，能致病或產(chǎn)毒素。 檢測(cè)方法l用傾注培養(yǎng)平板法。多采用孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基、高滲察氏培養(yǎng)基或加有抗菌素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。l環(huán)境樣本作一定倍數(shù)稀釋后，定量注入滅菌平皿。l傾入培養(yǎng)基混勻，凝固后置入2528 溫箱培養(yǎng)35天觀察平板上菌落生長情況并計(jì)數(shù)。結(jié)果：l以每毫升或每克檢樣中菌落形成單位（cfum1或g）來表示。l病原菌一般在環(huán)境中存在的數(shù)量不大，而且檢測(cè)方法較復(fù)雜，難以直接測(cè)定。l其他微生物作為代表，間接指示腸道病原菌存在。l糞便污染指示菌。理想條件：（1）是

6、人畜糞便中的正常菌，且數(shù)量比糞便是人畜糞便中的正常菌，且數(shù)量比糞便中其他菌為多；中其他菌為多；（2 2）受人畜糞便污染的環(huán)境中可檢出，而未）受人畜糞便污染的環(huán)境中可檢出，而未受污染環(huán)境無該菌存在；受污染環(huán)境無該菌存在；（3 3）排出至環(huán)境后，該菌存活時(shí)間與腸道致）排出至環(huán)境后，該菌存活時(shí)間與腸道致病菌相當(dāng)或略長；病菌相當(dāng)或略長；（4 4）對(duì)氯等消毒劑及其他不良因素的抵抗力）對(duì)氯等消毒劑及其他不良因素的抵抗力略強(qiáng)于腸道致病菌；略強(qiáng)于腸道致病菌；（5 5）檢出與鑒定方法比較簡便迅速。）檢出與鑒定方法比較簡便迅速。l大腸桿菌較理想大腸桿菌較理想 ，10109 9個(gè)個(gè)mlml；但鑒定；但鑒定方法比較復(fù)

7、雜方法比較復(fù)雜 ；l含有大腸桿菌在內(nèi)的總大腸菌群與糞大含有大腸桿菌在內(nèi)的總大腸菌群與糞大腸菌群。腸菌群。 l總大腸菌群（總大腸菌群（total co1iform），也稱），也稱大大腸菌群腸菌群（coliform group或或co1iform）；）；l它們是一群能在它們是一群能在37 ，24 h內(nèi)發(fā)酵乳糖內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。性無芽孢桿菌。l形成特殊的菌落特征；形成特殊的菌落特征；l大腸菌群不是分類學(xué)上的一個(gè)名稱，而大腸菌群不是分類學(xué)上的一個(gè)名稱，而是人為定義的名詞。是人為定義的名詞。 腸桿菌科細(xì)菌主要包括4個(gè)菌屬：l埃希氏

8、菌屬埃希氏菌屬（Escherichia）在此菌屬中與人類）在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個(gè)種，即大腸埃希菌也生活密切相關(guān)的僅有一個(gè)種，即大腸埃希菌也稱大腸桿菌；稱大腸桿菌；l其次有其次有檸檬酸桿菌檸檬酸桿菌屬或稱枸櫞酸桿菌屬屬或稱枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）、）、l克雷伯菌屬克雷伯菌屬（Klebsiella）、）、l腸桿菌屬腸桿菌屬（Enterobacter）。）。1多管發(fā)酵法（multiple-tube fermentation），又稱最大可能數(shù)法（most probable number，MPN）主要步驟：初發(fā)酵試驗(yàn)：l加入含有乳糖蛋白陳培養(yǎng)基（液）中，經(jīng)37 培養(yǎng)24 h

9、，l觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況以初步判別是否有大腸菌群存在。 平板分離。l將初發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。l挑選可疑為大腸菌群細(xì)菌的菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢和進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）。l上述可能為大腸菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陳培養(yǎng)液，置37溫箱培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 觀察結(jié)果：l復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)中仍有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即最后確證為有復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)中仍有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即最后確證為有大腸菌群存在。大腸菌群存在。l根據(jù)根據(jù)初發(fā)酵管初發(fā)酵管的數(shù)目及試驗(yàn)所用的檢樣量，利的數(shù)目及試驗(yàn)所用的檢樣量，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理或查閱專用統(tǒng)計(jì)表，最后算出用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理或查閱專用統(tǒng)

10、計(jì)表，最后算出每毫升檢樣中大腸菌群的最可能數(shù)目。每毫升檢樣中大腸菌群的最可能數(shù)目。 2.濾膜法（membrane filtration technique，MFT）l水樣水樣l濾膜濾膜l抽濾細(xì)菌抽濾細(xì)菌l濾膜培養(yǎng)，濾膜培養(yǎng)，l鑒定并計(jì)數(shù)典型菌落，鑒定并計(jì)數(shù)典型菌落，l計(jì)算總大腸菌群數(shù)。計(jì)算總大腸菌群數(shù)。主要步驟： 水樣過濾培養(yǎng) 觀察結(jié)果：l通過菌落特征及鏡檢菌體形態(tài)初步確定大腸菌群細(xì)菌；l凡革蘭氏陰性無芽孢桿菌再接入含乳糖蛋白陳培養(yǎng)基中以確證為大腸菌群細(xì)菌；l最后根據(jù)通過水量及濾膜上長出的肯定為大腸菌的菌落數(shù)換算出每升水中大腸菌群數(shù)。結(jié)果表達(dá)方式 ：大腸菌群數(shù)l又稱大腸菌指數(shù)，其表示方法有多種

11、，地表水環(huán)境又稱大腸菌指數(shù)，其表示方法有多種，地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、游泳池水衛(wèi)生標(biāo)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、游泳池水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中以個(gè)準(zhǔn)中以個(gè)L L表示之；食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中用個(gè)表示之；食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中用個(gè)m1m1表示。表示。大腸菌群值l是指水樣可檢出是指水樣可檢出1 1個(gè)大腸菌群細(xì)菌的最小水樣容積，個(gè)大腸菌群細(xì)菌的最小水樣容積，此值愈大即表示水中大腸菌群數(shù)愈少。此值愈大即表示水中大腸菌群數(shù)愈少。水 ：l大腸菌群值大腸菌群值1 000 m1大腸菌群數(shù)大腸菌群數(shù)土壤 l大腸菌群值大腸菌群值l g大腸菌群數(shù)大腸菌群數(shù)樣品樣品總大腸菌群總大腸菌群糞大腸菌群糞大腸菌群I200個(gè)個(gè)/L地表水

12、地表水*1II2 000個(gè)個(gè)/LIII10 000個(gè)個(gè)/L20 000個(gè)個(gè)/L40 000個(gè)個(gè)/L游泳池水游泳池水*218個(gè)個(gè)/L飲用水飲用水0個(gè)個(gè)/100 ml0個(gè)個(gè)/100 ml醫(yī)院排放污水醫(yī)院排放污水*3一級(jí)一級(jí)500個(gè)個(gè)/L二級(jí)二級(jí)1 000個(gè)個(gè)/L三級(jí)三級(jí)5 000個(gè)個(gè)/L方法評(píng)價(jià)（1）發(fā)酵法：（）發(fā)酵法：（MPN法）步驟多，耗時(shí)長，得到結(jié)法）步驟多，耗時(shí)長，得到結(jié)果需要果需要72h，不能及時(shí)指導(dǎo)實(shí)踐工作。，不能及時(shí)指導(dǎo)實(shí)踐工作。（2）濾膜法（）濾膜法（MFT法）：操作簡單，可現(xiàn)場(chǎng)過濾水法）：操作簡單，可現(xiàn)場(chǎng)過濾水樣，避免運(yùn)送水樣的麻煩，且縮短時(shí)間。但此法不樣，避免運(yùn)送水樣的麻煩，且

13、縮短時(shí)間。但此法不適用于混濁度高的水樣。適用于混濁度高的水樣。（3）總大腸菌群中細(xì)菌并非全部來自糞便，可能由）總大腸菌群中細(xì)菌并非全部來自糞便，可能由腐敗的植物、土壤等其他環(huán)境帶來，放可能導(dǎo)致某腐敗的植物、土壤等其他環(huán)境帶來，放可能導(dǎo)致某些不準(zhǔn)確性。些不準(zhǔn)確性。（4）飲水加氯消毒可殺滅大腸菌群而難殺滅）飲水加氯消毒可殺滅大腸菌群而難殺滅腸道病腸道病毒毒，故大腸菌群不能指示水中病毒，故大腸菌群不能指示水中病毒。l水中糞大腸菌群與腸道病原微生物具有相關(guān)水中糞大腸菌群與腸道病原微生物具有相關(guān)性，是糞大腸菌群作為指示菌的重要依據(jù)；性，是糞大腸菌群作為指示菌的重要依據(jù)； l由于人糞便中糞大腸菌群數(shù)多于糞

14、鏈球菌，動(dòng)物由于人糞便中糞大腸菌群數(shù)多于糞鏈球菌，動(dòng)物糞便中則相反，因此，在水質(zhì)檢測(cè)時(shí)可根據(jù)兩菌糞便中則相反，因此，在水質(zhì)檢測(cè)時(shí)可根據(jù)兩菌菌數(shù)比值不同而推測(cè)糞便污染的來源。菌數(shù)比值不同而推測(cè)糞便污染的來源。l糞大腸菌群糞鏈球菌的比值（糞大腸菌群糞鏈球菌的比值（FeFs）大于或）大于或等于等于4，則認(rèn)為污染主要來自，則認(rèn)為污染主要來自人糞人糞；l如小于或等于如小于或等于0.7，則認(rèn)為污染主要來自，則認(rèn)為污染主要來自溫血?jiǎng)游餃匮獎(jiǎng)游锏募S便；的糞便；l如比值小于如比值小于4而大于而大于2，則為，則為混合污染混合污染但以但以人糞為人糞為主主；l如比值小于如比值小于1而大于而大于0.7，則為混合污染但以

15、，則為混合污染但以動(dòng)物動(dòng)物糞便糞便為主。為主。 l產(chǎn)氣英膜梭菌（產(chǎn)氣英膜梭菌（Clostridium perfringenes）為）為革蘭氏陽性具有芽孢、能還原亞硫酸鹽的厭氧革蘭氏陽性具有芽孢、能還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌。桿菌。l存在于人糞（成人每克糞內(nèi)有此菌存在于人糞（成人每克糞內(nèi)有此菌105106個(gè)）個(gè)）及溫血?jiǎng)游锏募S便內(nèi)，可作為糞便污染指示菌。及溫血?jiǎng)游锏募S便內(nèi)，可作為糞便污染指示菌。 優(yōu)點(diǎn)：l有芽孢，對(duì)氯等消毒劑及外界不良環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，l能在水中較長期存在，l特別適用于在含有有毒物質(zhì)（如氯等）的水體中檢測(cè)是否有過糞便污染。 l蛭弧菌（蛭弧菌（Bdellovibrio）是一類以捕食

16、細(xì)菌為生的）是一類以捕食細(xì)菌為生的寄生菌，依靠對(duì)宿主菌的寄生和裂解使自身得到寄生菌，依靠對(duì)宿主菌的寄生和裂解使自身得到生長繁殖。生長繁殖。l當(dāng)水體受到糞便污染時(shí)，可供蛭弧菌寄生的宿主當(dāng)水體受到糞便污染時(shí)，可供蛭弧菌寄生的宿主增加，蛭弧菌因而大量繁殖，數(shù)量增加，從而對(duì)增加，蛭弧菌因而大量繁殖，數(shù)量增加，從而對(duì)污染起到指示作用。污染起到指示作用。致病菌的指示菌：1.2.志賀氏菌（Shigella）3.銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）4.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）5.鏈球菌屬（Streptococcus）6.破傷風(fēng)梭菌（Clostridi

17、um tetani）腸道病毒的指示微生物 1.發(fā)光細(xì)菌細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)（microtox）l一類能產(chǎn)生生物發(fā)光的細(xì)菌，統(tǒng)稱為發(fā)光細(xì)菌（luminous bacteria）。 l目前發(fā)現(xiàn)的發(fā)光細(xì)菌分屬弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和異短桿菌屬。發(fā)光細(xì)菌均為革蘭氏陰性、兼性厭氧菌。l（0.4-1.0）（1.0-2.5）m，無孢子、莢膜，有端生鞭毛一根或數(shù)根，l最適生長溫度為20-30，pH6-9，培養(yǎng)基中NaCl濃度2-40%。 試驗(yàn)原理：毒性測(cè)定：2.硝化細(xì)菌硝化作用抑制試驗(yàn)（nitrification inhibition test）323NONONH硝化抑制率3.藻類生長抑制試驗(yàn)（algoe gro

18、wth inhibition test）試驗(yàn)原理：l水質(zhì)生物檢測(cè)中比較常用的有硅藻、柵藻、小球藻等；l因?yàn)樯L繁殖迅速，對(duì)水質(zhì)變化敏感，可以通過測(cè)定水中這些藻類的生長量來測(cè)定水質(zhì)污染情況或物質(zhì)毒性程度 。測(cè)定藻類生長量的方法有下列幾種：S1S2S3S4時(shí)間Lg生物量（待測(cè)物濃度S4S3S2S1）4.原生動(dòng)物微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)（microscale community-level toxicity test）試驗(yàn)原理l該方法中最成熟、應(yīng)用最廣泛的是PFU（Polyurethane foam unit，聚氨酯泡沫塑料塊）法。l聚氨酯泡沫塑料塊，可浸沒于水體，能收集到85的種類，具有環(huán)境真實(shí)性；l

19、在一定時(shí)間內(nèi)，PFU中原生動(dòng)物種群構(gòu)成會(huì)達(dá)到平衡，而有害污染物會(huì)破壞這一平衡。l通過比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的群落結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，即可評(píng)價(jià)水體質(zhì)量與污染程度。1.脫氫酶活性試驗(yàn)（dehydrogenase actZvity test）l脫氫酶類能使被氧化有機(jī)質(zhì)的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，l反映活性污泥對(duì)污水中有機(jī)質(zhì)的氧化分解能力；l有毒物質(zhì)的存在會(huì)使脫氫酶類活性降低并影響活性污泥的效果。l可通過指示劑的還原變色速度來確定脫氫酶活性，以判斷毒性物質(zhì)的作用強(qiáng)度。 2.呼吸抑制試驗(yàn)（respiratiion inhibition test ）l微生物在進(jìn)行有氧呼吸、分解有機(jī)質(zhì)的過程中會(huì)消耗氧，產(chǎn)生CO2，因此測(cè)定呼吸速率可以反映活性污泥中微生物的代謝速率，對(duì)分析廢水生物可降解性有重要意義。l廢水中有毒物質(zhì)可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2產(chǎn)生量下降，下降的程度與毒性物質(zhì)的濃度和強(qiáng)度有關(guān)。abcda：無毒，能被利用b：無毒，不能被利用c：有毒，能被利用d: 有毒，不能被利用基質(zhì)濃度污泥相對(duì)耗氧速率與廢水毒性、可降解性的關(guān)系100%相對(duì)耗氧速率特點(diǎn)：l美國美國AmesAmes教授，教授，19751975年，致突變性測(cè)試法，也稱年，致突變性測(cè)