熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)干貨

1、Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.熒光定量熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項(xiàng)目部項(xiàng)目部?jī)?nèi)容概要內(nèi)容概要熒光定量熒光定量PCR的原理的原理熒光定量熒光定量PCR解析方法解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程熒光定量實(shí)驗(yàn)流程熒光定量熒光定量PCR儀儀生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量熒光定量PCR原理原理定義定義實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：技術(shù)：利用利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化增產(chǎn)物量的變化，對(duì)，對(duì)起始模板起始模板進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析與常規(guī)與常規(guī) P

2、CR技術(shù)比較：技術(shù)比較：對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)3熒光定量熒光定量PCR原理原理標(biāo)記方法標(biāo)記方法4SYBR Green ITaqMan Probe分子信標(biāo)分子信標(biāo)SYBR Green I 染料法染料法SYBR Green I5SYBR Green I是一種結(jié)合于所有是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBR Green I 染料法染料法作用機(jī)理作用機(jī)理6 SYBR Gre

3、en I 染料法染料法融解曲線融解曲線7將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo) (-dI/dT)原始圖譜原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜對(duì)數(shù)圖譜SYBR Green I 染料法染料法融解曲線融解曲線8融解曲線分析，單一融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光：峰無(wú)非特異性熒光：定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光：特異性熒光：定量不準(zhǔn)確定量不準(zhǔn)確Taqman 探針?lè)ㄌ结樂(lè)ㄔ碓?5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如，如FAM、VIC等等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)

4、，MGB 為不發(fā)光的熒光基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)探針完整，探針完整，R發(fā)射的熒光能量被發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光，無(wú)熒光， R與與Q分開(kāi)，發(fā)熒光分開(kāi)，發(fā)熒光Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針，外切核酸酶活性，可水解探針，R與與Q分開(kāi)，發(fā)熒光。分開(kāi)，發(fā)熒光。 Taqman 探針?lè)ㄌ结樂(lè)üぷ鳈C(jī)理工作機(jī)理Taqman 探針?lè)ㄌ结樂(lè)≒CRPCR體系的建立體系的建立引物、探針的設(shè)計(jì)：引物、探針的設(shè)計(jì)：探針探針Tm為為68-70, 30 bp, 5不能有不能有G, G可能會(huì)淬滅熒光素可能會(huì)淬滅熒光素引物盡量靠近探針引物盡量靠近探針, 擴(kuò)增片段擴(kuò)增片段400 bp, 引物引物Tm

5、為為59-60反應(yīng)參數(shù)的確定：反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 最高），也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度最高），也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度 優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)值，最大信號(hào)/背景比值背景比值引物濃度：引物濃度：100-900nM探針濃度：探針濃度：50-300nM 其他與常規(guī)其他與常規(guī)PCR相同相同實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類(lèi)分類(lèi)分子信標(biāo)分子信標(biāo)12標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成莖由互補(bǔ)配

6、對(duì)序列組成環(huán)環(huán)莖莖熒光素?zé)晒馑?淬滅劑淬滅劑實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類(lèi)分類(lèi)分子信標(biāo)分子信標(biāo)13FRET幾種熒光定量幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較方法的應(yīng)用比較熒光定量熒光定量PCR原理原理常用名詞概念常用名詞概念+擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線+熒光閾值熒光閾值+Ct值值熒光定量熒光定量PCR原理原理擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線16Cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）BaselineLgliner phase平臺(tái)期平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光檢測(cè)元件熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光閾值熒光閾值17Cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）BaselineLgl

7、iner phase平臺(tái)期平臺(tái)期 前前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（信號(hào)（baseline） 熒光閾值的缺省設(shè)置是熒光閾值的缺省設(shè)置是315個(gè)個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍倍 手動(dòng)設(shè)置手動(dòng)設(shè)置:大于熒光背景值和陰大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段數(shù)期的最初階段 真正的信號(hào)真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)閾值熒光信號(hào)超過(guò)閾值T熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值值18Cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）Ct值的定義：值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒

8、光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct value 熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值的重現(xiàn)性值的重現(xiàn)性19橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量縱軸：熒光信號(hào)量 Ct值的特點(diǎn)：值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性值極具重現(xiàn)性熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值定量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理20理想的理想的PCR反應(yīng)反應(yīng)XnX0 2n*Xn：第：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增

9、循環(huán)數(shù)熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值定量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理21非理想的非理想的PCR反應(yīng)反應(yīng) XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值定量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理22在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCtX0 * （1En）CtM （1）整理方程式（整理方程式（2）：）：方程式（方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：）兩邊同取對(duì)數(shù)得：XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)

10、到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為它是一個(gè)常數(shù)，定為MLog2MLog2X0 *（1En）Ct （2）Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1En）熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值與起始模板量的關(guān)系值與起始模板量的關(guān)系23Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration 模板模板DNA量越多，熒光達(dá)量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。值越小。 Log模板起始濃度與模板起始濃度與Ct值值呈線性關(guān)系。呈線性關(guān)系。熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)熒

11、光定量反應(yīng)性的確認(rèn)24 線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn) 相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（R2）：大于）：大于0.98 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3 -3.5 PCR擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E）：）：0.9-1.2 檢測(cè)靈敏度確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn) 35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果 如果采用如果采用SYBR檢測(cè)方法，檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增 No template control確認(rèn)確認(rèn) 35 Cycles內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生熒光定量熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用技術(shù)的主要應(yīng)用 定性分析研究定性分析研究：雜合或純合子鑒

12、定，（：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等）分析等 絕對(duì)定量研究絕對(duì)定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測(cè)等定量檢測(cè)等 相對(duì)定量研究相對(duì)定量研究：mRNA表達(dá)量分析，表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等異顯示結(jié)果驗(yàn)證等熒光定量熒光定量PCR的解析方法的解析方法1絕對(duì)定量解析方法絕對(duì)定量解析方法1相對(duì)定量解析方法相對(duì)定量解析方法絕對(duì)定量的定義絕對(duì)定量的定義27Sample25 Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)

13、準(zhǔn)曲線可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系 根據(jù)樣品根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量絕對(duì)定量分析幾要素絕對(duì)定量分析幾要素28一個(gè)一個(gè)目的基因目的基因 即需要確定其量值的核酸序列。即需要確定其量值的核酸序列。一組一組標(biāo)準(zhǔn)樣本標(biāo)準(zhǔn)樣本 用來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒用來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組產(chǎn)物、基因組DNA等。等。重復(fù)反應(yīng)孔重復(fù)反應(yīng)孔 建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇標(biāo)記方

14、法的選擇 SYBR Green I 法或法或Taqman 探針?lè)ň伞Ｌ结樂(lè)ň?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線(探針?lè)ú恍枰结樂(lè)ú恍枰?。絕對(duì)定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備絕對(duì)定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29PCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)?；蚪M基因組DNA質(zhì)粒提取，質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法30倍比梯度稀釋方法：倍比梯度稀釋方法：1v原液原液(標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)

15、準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例畢赤酵母畢赤酵母A A基因的絕對(duì)定量基因的絕對(duì)定量31方法：方法：檢測(cè)畢赤酵母的檢測(cè)畢赤酵母的A基因基因標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5個(gè)濃度；個(gè)濃度；3個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： 提取提取A DNA； 設(shè)計(jì)特異引物；設(shè)計(jì)特異引物； 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針；探針并標(biāo)記探針； 熒光定量擴(kuò)增；熒光定量擴(kuò)增

16、； 結(jié)果分析：獲取畢赤酵母的結(jié)果分析：獲取畢赤酵母的A的精確的精確copy數(shù)。數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例畢赤酵母畢赤酵母A A基因的絕對(duì)定量基因的絕對(duì)定量絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例畢赤酵母畢赤酵母A A基因的絕對(duì)定量基因的絕對(duì)定量33擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E）計(jì)算）計(jì)算 E =10-1/斜率斜率 - -1 =10-1/-3.481 - -1 =1.983-1 =0.938標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用利用Mean Ct 作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y = -3.481x + 40.123 R2 = 絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例畢赤酵母畢赤酵母A A基因的絕對(duì)定量基因的絕對(duì)定量3

17、4未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將將Ct值帶入線性方程：值帶入線性方程：18.45= -3.481 X +40.123QuantityUnknown=10 6.226 =1682674 copies X=18.45-40.123-3.481=相對(duì)定量的必要性相對(duì)定量的必要性35目的基因擴(kuò)增效率相同目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同細(xì)胞起始數(shù)相同相對(duì)定量分析方法相對(duì)定量分析方法36比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點(diǎn)：關(guān)注點(diǎn)：基因的相對(duì)表達(dá)量，而不是基因的絕對(duì)量！基因的相對(duì)表達(dá)量，而不是基因的絕

18、對(duì)量！相對(duì)定量分析幾要素相對(duì)定量分析幾要素37一個(gè)一個(gè)參照樣本參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本未知樣本一個(gè)一個(gè)目的基因目的基因管家基因管家基因用來(lái)校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量用來(lái)校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔重復(fù)反應(yīng)孔建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性標(biāo)記方法的選擇標(biāo)記方法的選擇SYBR Green法或探針?lè)ň煞ɑ蛱结樂(lè)ň蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針?lè)ú恍枰ㄌ结樂(lè)ú恍枰┮唤M一

19、組標(biāo)準(zhǔn)樣本標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要）相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析管家基因篩選管家基因篩選38管家基因管家基因 維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如：如：GAPDH、Actin、18S rRNA等等篩選方法篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供根據(jù)文獻(xiàn)提供通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選P P P P P P O O相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法39雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2 -Ct法法相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析雙標(biāo)曲線法雙標(biāo)曲線法40通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目

20、的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。公式：公式：相對(duì)值相對(duì)值=校正值校正值=目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測(cè)樣品的校正值待測(cè)樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析雙標(biāo)曲線法雙標(biāo)曲線法41優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一

21、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析2 2CtCt法法42假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同： 或或最后用任一待測(cè)樣本最后用任一待測(cè)樣本 q 的的 XN 除以對(duì)照樣本（除以對(duì)照樣本（calibrator，cb）的）的 XN 得到：得到： 對(duì)于一個(gè)少于對(duì)于一個(gè)少于 150bp 的擴(kuò)增片斷而言，如果的擴(kuò)增片斷而言，如果 Mg 2+ 濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于化，擴(kuò)增效率接近于 1 。因此目標(biāo)序列的量通過(guò)內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照因子。因此目標(biāo)序列的量通過(guò)內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照因子而言就是：而言就是： XT 是目

22、標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)是目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)RT是內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)是內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù) 相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析2 2CtCt法法43公式：公式：F = 2優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需作標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 假定擴(kuò)增效率為假定擴(kuò)增效率為 100 %； 假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致； 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一 待測(cè)組目的基因待測(cè)組目的基因平均平均Ct

23、值值待測(cè)組內(nèi)參基因待測(cè)組內(nèi)參基因平均平均Ct值值對(duì)照組目的基因?qū)φ战M目的基因平均平均Ct值值對(duì)照組內(nèi)參基因?qū)φ战M內(nèi)參基因平均平均Ct值值相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析2 2CtCt法法44實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：2 - Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100% Ct（處理前）（處理前）15132 Ct（處理后）（處理后）1820=2 Ct=Ct（處理后）（處理后）Ct（處理前）（處理前）224 比率比率（處理后（處理后/處理前）處理前）2Ct2（4） 16 所以所以Jun基因在處理后表達(dá)水平是處理前的基因在處理后表達(dá)水平是處理前的16倍倍修正方法：修正

24、方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于等于2，那么，那么2Ct可以修正為：可以修正為：ECt，例如擴(kuò)增效率為，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式，那么計(jì)算公式可修正為可修正為1.95C熒光定量熒光定量(SYBR Green)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)45樣品制備樣品制備定量體系配備定量體系配備引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析儀器介紹儀器介紹RT上機(jī)上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇分析方法分析方

25、法熒光定量熒光定量(SYBR Green)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)46樣品制備樣品制備環(huán)境要求環(huán)境要求定量體系配備定量體系配備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)上機(jī)濃度確定濃度確定無(wú)無(wú)RNase環(huán)境環(huán)境使用無(wú)使用無(wú)RNase耗材耗材專用專用RNase-free工具工具分光光度計(jì)檢測(cè)分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)熒光定量熒光定量(SYBR Green)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)47樣品制備樣品制備試劑選擇試劑選擇定量體系配備定量體系配備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化AMVM-MLV下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇引物的選擇熒光定量熒光定量(SYBR Green)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)48樣品制備樣品制備誤差控制誤差控制定量體系配備定量體系配備數(shù)據(jù)分