第一章實(shí)驗(yàn)室及基本操作2014.docx

1、第一章第一章 實(shí)驗(yàn)室及基本操作實(shí)驗(yàn)室及基本操作第一節(jié)第一節(jié) 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立第二節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室的大小大小取決于工作的取決于工作的目的目的和和規(guī)模規(guī)模 1. 以以工廠化生產(chǎn)工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，為目

2、的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小， 則會限制生產(chǎn)影響效率。則會限制生產(chǎn)影響效率。 2. 在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)，來設(shè)計(jì)， 避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。 植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件無菌的條件下進(jìn)行的，下進(jìn)行的， 要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具， 同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。一、一、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求 便于便于隔離隔離 便

3、于操作便于操作 便于滅菌便于滅菌 便于觀察便于觀察二、構(gòu)成二、構(gòu)成 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（洗滌室）化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（洗滌室） 接種室接種室 無菌無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)室 滅菌室滅菌室 細(xì)胞學(xué)觀測室（可以不設(shè)）細(xì)胞學(xué)觀測室（可以不設(shè)）三、主要單元功能介紹三、主要單元功能介紹接種室接種室(外設(shè)緩沖間外設(shè)緩沖間)無菌接種箱無菌接種箱1. 無菌操作室無菌操作室 材料的材料的消毒消毒、接種接種，繼代繼代。 內(nèi)置內(nèi)置超凈工作臺超凈工作臺或或接種箱接種箱。 外設(shè)外設(shè)緩沖間緩沖間， 放置拖鞋、工作服、工作帽等。放置拖鞋、工作服、工作帽等。2. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室滿足材料的生長（光、熱、水、氣）。滿足材料的生長（光、熱、水、氣）。 要求：要

4、求： 保溫隔熱；保溫隔熱； 控溫、控光；控溫、控光； 暗室暗室。 設(shè)備：培養(yǎng)架、設(shè)備：培養(yǎng)架、 加溫設(shè)備、降溫設(shè)備加溫設(shè)備、降溫設(shè)備3. 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 器皿器皿的洗滌、干燥、保存；的洗滌、干燥、保存； 藥品藥品稱量、溶解、稱量、溶解、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配置；的配置； 植物材料預(yù)處理，培養(yǎng)材料的觀察分析。植物材料預(yù)處理，培養(yǎng)材料的觀察分析。 主要設(shè)備主要設(shè)備 工作臺、藥品柜、冰箱、烘箱、天平、工作臺、藥品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸餾水器蒸餾水器。 4. 滅菌室滅菌室 對對培養(yǎng)基培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。進(jìn)行滅菌。 5. 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)材料的分析照相，培養(yǎng)材料的分析照相， 設(shè)備：顯微鏡、解

5、剖鏡、染色設(shè)備。設(shè)備：顯微鏡、解剖鏡、染色設(shè)備?；緦?shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖室緩沖室無菌室無菌室培養(yǎng)室培養(yǎng)室四、常用儀器設(shè)備四、常用儀器設(shè)備（一）儀器（一）儀器 1. 天平天平 1/10、1/100藥物天平：大量元素、藥物天平：大量元素、 蔗糖、瓊脂。蔗糖、瓊脂。 1/10000分析天平：維生素、分析天平：維生素、 激素、微量元素、微量附加物。激素、微量元素、微量附加物。 2. 滅菌鍋滅菌鍋 3. 烘箱（干燥箱）烘箱（干燥箱） 80-100：烘干物品、測定植物組織干物質(zhì)

6、重。：烘干物品、測定植物組織干物質(zhì)重。 150-160：干熱滅菌（不超過：干熱滅菌（不超過175）；）；4. 冰箱冰箱 有機(jī)試劑和母液的有機(jī)試劑和母液的儲藏儲藏； 細(xì)胞及其他材料的細(xì)胞及其他材料的冷藏保存冷藏保存； 植物材料的植物材料的處理處理（低（低 溫打破休眠）。溫打破休眠）。5. 酸度計(jì)酸度計(jì) 對培養(yǎng)基對培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整。值進(jìn)行調(diào)整。 （一般用（一般用pH4-7的精密試紙代替）的精密試紙代替）6. 雙筒實(shí)體顯微鏡（解剖鏡）雙筒實(shí)體顯微鏡（解剖鏡） 莖尖莖尖的剝?nèi)。ǚ稚M織）；的剝?nèi)。ǚ稚M織）； 對植物材料的對植物材料的隔瓶觀測隔瓶觀測。7. 蒸餾水器蒸餾水器 減小實(shí)驗(yàn)中的偶然因素。

7、減小實(shí)驗(yàn)中的偶然因素。8. 空調(diào)空調(diào) 溫度變化差異不大。溫度變化差異不大。蒸餾水器蒸餾水器9. 震蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)震蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī) 液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)。10. 培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱搖床搖床光照培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)箱1. 玻璃器皿玻璃器皿 培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 原則：無毒透光；原則：無毒透光； 試管：試管：215，2.515，315。 三角瓶三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于繼代培養(yǎng)）。（主要用于繼代培養(yǎng)） 培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿：原生質(zhì)體、游離細(xì)胞、花藥等的培養(yǎng)；原生質(zhì)體、游離細(xì)胞、花藥等的培養(yǎng)； 無菌種子的萌發(fā)；無菌種子的萌發(fā)； 材料的分離；材料的分離； 無菌濾紙的消毒滅菌無菌

8、濾紙的消毒滅菌 封閉物封閉物防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染、無毒透氣（防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染、無毒透氣（棉塞棉塞、菌膜）、菌膜）（二）必要器皿（二）必要器皿盛裝器皿盛裝器皿 燒杯、試劑瓶，燒杯、試劑瓶， 藥品的藥品的溶解溶解和和儲存儲存。計(jì)量器皿計(jì)量器皿 量筒：量筒： 10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。 容量瓶：容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。 移液管：移液管：0.1ml，0.2ml，1ml，2ml，5ml，10ml。其他其他 漏斗漏斗 玻棒玻棒 滴瓶滴瓶2. 金屬器皿金屬器皿 鑷子：鑷子： 剪刀：剪刀：

9、分離器械：手術(shù)刀、芽接刀分離器械：手術(shù)刀、芽接刀 大量元素；大量元素；微量元素；微量元素；維生素、氨基酸等（有機(jī)附加物）。維生素、氨基酸等（有機(jī)附加物）。糖類：糖類：蔗糖蔗糖、葡萄糖等。、葡萄糖等。凝固劑：瓊脂等。凝固劑：瓊脂等。激素激素生長素類：生長素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D。細(xì)胞分裂素類：細(xì)胞分裂素類：6-BA、KT、ZT赤霉素類：赤霉素類：GA3（三）常備藥品（三）常備藥品一、培養(yǎng)基及其配制一、培養(yǎng)基及其配制（一）概念（一）概念 培養(yǎng)基：外植體生長的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基：外植體生長的營養(yǎng)物質(zhì)。 （二）種類（二）種類1. 根據(jù)水平根據(jù)水平 基本基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基 大量元素和微量元素

10、、維生素和氨基酸，還有糖和水。大量元素和微量元素、維生素和氨基酸，還有糖和水。 完全完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，附加在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，附加植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑或有機(jī)附加物。或有機(jī)附加物。 MS + NAA 0.2 + 6-BA 2 + 蔗糖蔗糖 3% + pH 5.8第二節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)單位：單位：mg/LMSmg/L2、根據(jù)成分、根據(jù)成分 天然培養(yǎng)基：動(dòng)、植物的天然培養(yǎng)基：動(dòng)、植物的組織組織或組織的或組織的汁汁配成的培養(yǎng)基。配成的培養(yǎng)基。 化學(xué)成分還不清楚或不恒定?；瘜W(xué)成分還不清楚或不恒定。 生物性液體（血清）；組織浸液（胚胎浸液

11、）；凝固劑（血漿）等。生物性液體（血清）；組織浸液（胚胎浸液）；凝固劑（血漿）等。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基：成分、濃度已知。：成分、濃度已知。 半合成培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基 +合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基。3、根據(jù)理化狀態(tài)、根據(jù)理化狀態(tài) 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基 + 凝固劑。凝固劑。4、根據(jù)功能、根據(jù)功能 愈傷組織培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)基、莖尖培養(yǎng)基、愈傷組織培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)基、莖尖培養(yǎng)基、 脫分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基。脫分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基。1）脫分化脫分化培養(yǎng)基培養(yǎng)基 （mg/L）高濃度生長素高濃度生長素 煙草：煙草：

12、MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 1-2。 水稻：水稻：MS + 2,4-D 1。多量生長素多量生長素 + 少量細(xì)胞分裂素少量細(xì)胞分裂素 煙葉：煙葉：MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 2 + KT 0.25 哈密瓜：哈密瓜：Miller + NAA 2 + KT 0.5多量多量細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素 + 少量生長素少量生長素 天竺葵：天竺葵：MS + NAA 0.2 + 6-BA 22）繼代培養(yǎng)基）繼代培養(yǎng)基 在脫分化培養(yǎng)基上降低生長素的量、在脫分化培養(yǎng)基上降低生長素的量、 或用或用原脫分化培養(yǎng)基原脫分化培養(yǎng)基。3）生根培養(yǎng)基）生根培養(yǎng)基 只用只用基本基本培養(yǎng)

13、基；培養(yǎng)基； 加加生長素生長素： 菠蘿：菠蘿：MS + IAA 0.3 加加細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素： 哈密瓜：哈密瓜：Miller + KT0.5 半量法半量法（三）培養(yǎng)基成分（三）培養(yǎng)基成分功能功能 組成各種化合物，參與機(jī)體的建成，成為組成各種化合物，參與機(jī)體的建成，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)構(gòu)物質(zhì)。 構(gòu)成一些構(gòu)成一些生理活性物質(zhì)生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝。，參與活躍的新陳代謝。 元素之間互相元素之間互相協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)， 以維持離子濃度的平衡、膠體穩(wěn)定、電化學(xué)平衡等作用。以維持離子濃度的平衡、膠體穩(wěn)定、電化學(xué)平衡等作用。注：不同器官的發(fā)生，注：不同器官的發(fā)生，需要營養(yǎng)需要營養(yǎng)元素的濃度元素的濃度不同不同。

14、1. 無機(jī)鹽無機(jī)鹽大量元素：碳、氫大量元素：碳、氫、氧氧、氮、磷、鉀、氮、磷、鉀、鈣鈣、鎂、硫、鎂、硫、硅硅（-） 。 3+7種，種， 干重干重0.01-10%微量元素微量元素：鐵鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、鎳鎳（-） 、鈉鈉（-） 。 9種，種， 干重干重0.00001-0.01% I（+） 、 Co（+）。必需元素必需元素的生理作用，的生理作用， 略。略。2. 有機(jī)物有機(jī)物1）維生素：）維生素：B1（鹽酸硫胺素）、（鹽酸硫胺素）、B3（煙酸）、（煙酸）、B6（鹽酸吡哆醇）。（鹽酸吡哆醇）。維生素主要是以各種維生素主要是以各種輔酶輔酶的形式參加的形式參加酶的形成酶的形

15、成， 以及以及蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪脂肪的的代謝代謝等重要生命活動(dòng)。等重要生命活動(dòng)。 對對生長生長和和分化分化有促進(jìn)作用。有促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成能合成所必需的維生素，所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯但在數(shù)量上還明顯不足不足，通常需加入通常需加入1至數(shù)種維生素，以便獲良好的生長至數(shù)種維生素，以便獲良好的生長.。2）氨基酸）氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)的氨基酸是蛋白質(zhì)的組成組成成分，成分， 也是一種也是一種有機(jī)氮源有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用，可直接被細(xì)胞吸收利用 。 常用的有常用的有甘氨酸甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷

16、氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸 以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺）以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺） 和和多種氨基酸的混合物多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。 用酶法等加工牛乳的用酶法等加工牛乳的水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物，由于營養(yǎng)豐富，極易引起污染。，由于營養(yǎng)豐富，極易引起污染。 如在培養(yǎng)中無特別需要，以如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜不用為宜。3）肌醇）肌醇 肌醇具有幫助肌醇具有幫助活性物質(zhì)（活性物質(zhì)（VB1）發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)物快速生長，發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)物快速生長，對對胚狀體胚狀體和和芽芽的形成有良好的促進(jìn)作用。的形成有良好的促進(jìn)作用。4）天然

17、有機(jī)附加物）天然有機(jī)附加物大多含大多含氨基酸氨基酸、激素激素、酶酶等一些復(fù)雜化合物。等一些復(fù)雜化合物。它對細(xì)胞和組織的它對細(xì)胞和組織的增殖增殖與與分化分化有明顯的促進(jìn)作用，有明顯的促進(jìn)作用，但對但對器官器官的分化作用不明顯。的分化作用不明顯。它的它的成分成分大多不清楚，與其成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大，大多不清楚，與其成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大，所以一般應(yīng)盡量所以一般應(yīng)盡量避免使用避免使用。 椰乳：是使用最多、效果最好的一種天然復(fù)合物。椰乳：是使用最多、效果最好的一種天然復(fù)合物。 它在它在愈傷組織愈傷組織和和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。中有促進(jìn)作用。 在馬鈴薯莖尖在馬鈴薯莖尖分生組織分生組織和草莓和草

18、莓微莖尖微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用。培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用。香蕉：用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙瑢ο憬叮河命S熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?，對pH值的值的緩沖緩沖作用大。作用大。 主要在主要在蘭花蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用。的組織培養(yǎng)中應(yīng)用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。 對對pH值值緩沖緩沖作用也大。作用也大。酵母提取液：主要成分為酵母提取液：主要成分為氨基酸氨基酸和和維生素類維生素類。其他，麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。其他，麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉

19、米的胚乳等。 遇熱較穩(wěn)定，大多在遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。，有時(shí)有效。 3. 碳源碳源為細(xì)胞提供合成新化合物的為細(xì)胞提供合成新化合物的碳碳骨架，骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源能源，還可以維持一定的還可以維持一定的滲透壓滲透壓。最常用的碳源是最常用的碳源是蔗糖蔗糖。葡萄糖和果糖也是較好的碳源，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。濃度：濃度：2%-4%，最常用，最常用 3% 。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的白糖白糖代替。代

20、替。4. 植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑1）生長素類）生長素類 誘導(dǎo)細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化脫分化，促進(jìn)愈傷組織的形成；，促進(jìn)愈傷組織的形成； 促進(jìn)細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞伸長伸長生長和細(xì)胞分裂；生長和細(xì)胞分裂； 促進(jìn)促進(jìn)生根生根。吲哚乙酸：激素，有利于根形成，吲哚乙酸：激素，有利于根形成， 但是它容易被氧化和光解，組織培養(yǎng)中通常使用但是它容易被氧化和光解，組織培養(yǎng)中通常使用合成的生長素合成的生長素。吲哚丁酸吲哚丁酸：誘導(dǎo)許多植物：誘導(dǎo)許多植物生根生根。萘乙酸萘乙酸：最適宜誘導(dǎo)：最適宜誘導(dǎo)愈傷組織愈傷組織或誘導(dǎo)某些外植體或誘導(dǎo)某些外植體生根生根。二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起）：引起脫分化脫分化。

21、 能夠引起能夠引起染色體變異染色體變異，因此使用時(shí)必須格外小心。，因此使用時(shí)必須格外小心。作用效力作用效力吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）萘乙酸萘乙酸（NAA）二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）2）細(xì)胞分裂素類）細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分化；促進(jìn)細(xì)胞分化； 有利于細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成；有利于細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成； 促進(jìn)細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞分裂分裂與擴(kuò)大，可使莖增粗，而抑制莖的伸長；與擴(kuò)大，可使莖增粗，而抑制莖的伸長； 誘導(dǎo)誘導(dǎo)芽的分化芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生。，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生。激動(dòng)素：最主要的用途是誘導(dǎo)激動(dòng)素：最主要的用途是誘導(dǎo)芽的形成芽的形成。 玉米素：是一種天然激素

22、，玉米素：是一種天然激素，價(jià)格昂貴價(jià)格昂貴，其作用稍差于芐氨基嘌呤。，其作用稍差于芐氨基嘌呤。6-芐氨基腺嘌呤芐氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，）：具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)， 是組織培養(yǎng)是組織培養(yǎng)最常用最常用細(xì)胞分裂素類。細(xì)胞分裂素類。 主要作用是促進(jìn)主要作用是促進(jìn)芽的形成芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。作用效力作用效力玉米素玉米素ZT6-芐氨基腺嘌呤芐氨基腺嘌呤6-BA激動(dòng)素激動(dòng)素KT腺嘌呤腺嘌呤3）赤霉素）赤霉素 赤霉素有赤霉素有127種，種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等

23、各有不同，培養(yǎng)基中添加的是培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長伸長生長，生長， 促進(jìn)促進(jìn)胚狀體胚狀體發(fā)育成小植株。發(fā)育成小植株。5. 培養(yǎng)材料的支持物培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂瓊脂固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂的用量在瓊脂的用量在0.8-1.0%之間之間 。凝固能力凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外， 還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間和還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間和pH值值等因素有關(guān)。等因素有關(guān)。其它：玻璃纖維、濾紙橋、海綿、卡拉膠等。其它：玻璃纖維、濾紙橋、海綿、卡拉膠等。6、其他成分、其他成分抗生素物

24、質(zhì)：有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗生素物質(zhì)：有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等, 可防止菌類可防止菌類污染污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。，減少培養(yǎng)中材料的損失?？寡趸瘎阂卓寡趸瘎阂缀只只牟牧?。的材料?；钚蕴浚夯钚蕴浚?莖尖莖尖初代初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物褐化物； 新梢新梢增殖增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢新梢的形成和伸長；的形成和伸長； 活性炭在活性炭在生根生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用。時(shí)有明顯的促進(jìn)作用。 7、pH值值喜光、耐旱、耐鹽堿：喜光、耐旱、耐鹽堿： pH值中性；值中性；喜濕、耐陰、喜酸

25、：喜濕、耐陰、喜酸： pH值值偏酸偏酸。 培養(yǎng)基滅菌后，培養(yǎng)基滅菌后， pH值一般下降。值一般下降。（四）培養(yǎng)基的選擇（四）培養(yǎng)基的選擇1. 幾種基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)幾種基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)1）富集元素富集元素平衡培養(yǎng)基平衡培養(yǎng)基 - MS培養(yǎng)基（典型代表）培養(yǎng)基（典型代表） 無機(jī)鹽無機(jī)鹽濃度高，元素間的比例較適合；濃度高，元素間的比例較適合； 緩沖緩沖性能好，某些元素略有損失不會影響離子平衡；性能好，某些元素略有損失不會影響離子平衡； 營養(yǎng)豐富營養(yǎng)豐富，不需再加入水解蛋白等有機(jī)成分；，不需再加入水解蛋白等有機(jī)成分； 微量元素微量元素種類較全，濃度較高；種類較全，濃度較高； 適合多種植物，適合多種植物

26、，用途廣泛用途廣泛。 與與MS相類似的培養(yǎng)基，相類似的培養(yǎng)基， LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基等。2）硝酸鉀硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基含量較高的培養(yǎng)基 硝酸鉀硝酸鉀的含量高，的含量高， 銨態(tài)氮銨態(tài)氮的含量低，的含量低， 含有較高的含有較高的鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素（VB1）。）。如，如，B5（水稻成熟胚愈傷組織（水稻成熟胚愈傷組織分化分化時(shí)用其時(shí)用其微量元素微量元素部分）部分）、 N6（禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng) ）、 SH培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。3）中等中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基 大量元素?zé)o機(jī)鹽約為大量元素?zé)o機(jī)鹽約為MS的的一半一半； 微量元索微量元索種類減少

27、種類減少而而含量增高含量增高； 維生素維生素種類種類比比 MS多多。 如，如，H、Nitsch、Miller培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。4）低低無機(jī)鹽培養(yǎng)基無機(jī)鹽培養(yǎng)基 無機(jī)鹽含量很低，一般為無機(jī)鹽含量很低，一般為MS的的1/4； 有機(jī)成分含量也有機(jī)成分含量也很低很低； 多用作多用作生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基。 如，如，White 、WS、HE、HB培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。2. 培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇 1）背景調(diào)查）背景調(diào)查對該供試對該供試植物植物分類地位、生理特性、繁殖、栽培條件及品種類型等分類地位、生理特性、繁殖、栽培條件及品種類型等有充分的了解。有充分的了解。應(yīng)詳細(xì)查閱應(yīng)詳細(xì)查閱前人前人對該植物的對該植物的研究研究

28、工作，工作，總結(jié)分析前人工作的成功和不足之處，總結(jié)分析前人工作的成功和不足之處，從而在此基礎(chǔ)上確定從而在此基礎(chǔ)上確定基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基類型。類型。2）選擇原則選擇原則同一物種同一物種的不同亞種、品種間的基本培養(yǎng)基類型基本相同；的不同亞種、品種間的基本培養(yǎng)基類型基本相同；同一植物同一植物的不同組織、器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；的不同組織、器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；營養(yǎng)成分需求與營養(yǎng)成分需求與田間田間栽培有相似性；栽培有相似性；無機(jī)鹽濃度無機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素，是基本培養(yǎng)基類型的重要因素， 應(yīng)該作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；應(yīng)該作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；有機(jī)成分主要是有機(jī)成分主要

29、是種類種類的變化，每種成分含量的變化不大；的變化，每種成分含量的變化不大；在確定基本培養(yǎng)基類型后，研究最適的在確定基本培養(yǎng)基類型后，研究最適的蔗糖濃度蔗糖濃度。3）激素的選擇原則）激素的選擇原則生長素生長素 主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織愈傷組織和和生根生根等，等， 各種生長素的強(qiáng)度按以下排列而減弱：各種生長素的強(qiáng)度按以下排列而減弱： 2,4-D、NAA、IBA和和IAA。 與與細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖?；プ鞔龠M(jìn)莖的增殖。細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素 主要促進(jìn)主要促進(jìn)細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢，促進(jìn)，改變頂端優(yōu)勢，促進(jìn)芽的分化芽的分化等。等。 常用幾種

30、細(xì)胞分裂素的強(qiáng)度按以下排列減弱；常用幾種細(xì)胞分裂素的強(qiáng)度按以下排列減弱； ZT、6-BA、KT和腺嘌呤。和腺嘌呤。激素選擇原則激素選擇原則細(xì)胞分裂素與生長素的細(xì)胞分裂素與生長素的比例比例是激素使用的關(guān)鍵；是激素使用的關(guān)鍵；細(xì)胞分裂素與生長素的細(xì)胞分裂素與生長素的種類種類對不同對不同植物植物的敏感性不同；的敏感性不同；同一植物的同一植物的不同組織不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過程中對在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過程中對激素激素的要求不同。的要求不同。4 4）總結(jié)）總結(jié)基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 糖糖 營養(yǎng)元素營養(yǎng)元素 天然附加物天然附加物 凝固劑凝固劑4）常用試驗(yàn)方法）常用試驗(yàn)方法

31、單因子試驗(yàn)單因子試驗(yàn) 培養(yǎng)基中其他成分都不變，只變動(dòng)一個(gè)因子。培養(yǎng)基中其他成分都不變，只變動(dòng)一個(gè)因子。 就可以找出這一因子對試驗(yàn)的影響和影響的程度。就可以找出這一因子對試驗(yàn)的影響和影響的程度。多因子試驗(yàn)多因子試驗(yàn) 對培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究。對培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究。 試驗(yàn)可采用試驗(yàn)可采用完全完全試驗(yàn)方案、試驗(yàn)方案、正交正交設(shè)計(jì)方案。設(shè)計(jì)方案。培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方配方試驗(yàn)試驗(yàn)（五）培養(yǎng)基的配制（五）培養(yǎng)基的配制1. 對藥品和水的要求對藥品和水的要求 選擇選擇等級較高等級較高的藥品的藥品; 同一試驗(yàn)要用同一試驗(yàn)要用同一批次同一批次的藥品的藥品; 原則上用原則上用純水純水。藥品純

32、度等級藥品純度等級1、工作基準(zhǔn)試劑（無簡寫標(biāo)記，用漢語注明，綠色標(biāo)簽）：、工作基準(zhǔn)試劑（無簡寫標(biāo)記，用漢語注明，綠色標(biāo)簽）： 作為作為基準(zhǔn)物質(zhì)基準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。，標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2、優(yōu)級純（、優(yōu)級純（GR，綠色標(biāo)簽）：用于精確分析和研究工作，有的可作為，綠色標(biāo)簽）：用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)基準(zhǔn)物質(zhì)。 3、分析純（、分析純（AR，紅色標(biāo)簽）：用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)，紅色標(biāo)簽）：用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)，用得最多用得最多的等級。的等級。 4、化學(xué)純（、化學(xué)純（CP，藍(lán)色標(biāo)簽）：用于，藍(lán)色標(biāo)簽）：用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。和合成制備。 5、實(shí)驗(yàn)試劑（、實(shí)驗(yàn)試劑（LR ，黃

33、色標(biāo)簽）：用于，黃色標(biāo)簽）：用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。和合成制備。 2. 母液配制母液配制1）優(yōu)點(diǎn)）優(yōu)點(diǎn) 減少減少工作量工作量; 減少多次稱量造成的減少多次稱量造成的誤差誤差; 便于微量元素的便于微量元素的稱量稱量; 保證每一個(gè)材料的培養(yǎng)基有保證每一個(gè)材料的培養(yǎng)基有相同的成分相同的成分。2）母液種類）母液種類 大量元素：大量元素：1050倍；倍； 微量元素：微量元素：100200倍；倍； Fe鹽：鹽： 100200倍（棕色瓶）；倍（棕色瓶）； 有機(jī)物：有機(jī)物： 20100倍；倍； 植物生長調(diào)節(jié)劑母液植物生長調(diào)節(jié)劑母液 （1mg/ml）。）。3）母液配制注意事項(xiàng)）母液配制注意事項(xiàng)植

34、物生長調(diào)節(jié)劑的溶解植物生長調(diào)節(jié)劑的溶解 生長素類：堿溶；生長素類：堿溶； 95%乙醇乙醇溶、溶、蒸餾水蒸餾水定容。定容。 細(xì)胞分裂素類：細(xì)胞分裂素類：酸溶酸溶、蒸餾水蒸餾水定容。定容。 赤霉酸：熱水溶，以赤霉酸：熱水溶，以95%乙醇配成原液。乙醇配成原液。Fe鹽制備：將兩物質(zhì)分別溶解在鹽制備：將兩物質(zhì)分別溶解在450ml水中，水中， 然后混合，然后混合， 定容。定容。配制好的母液分別貼上標(biāo)簽配制好的母液分別貼上標(biāo)簽MS MS 大量元素大量元素10 X 10 X 查仁明查仁明 04.04.0404.04.04貯存：溫度貯存：溫度2-4度，度， 一般無機(jī)物一般無機(jī)物3-6個(gè)月，個(gè)月， 有機(jī)物有機(jī)物

35、3個(gè)月。個(gè)月。3、培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)基配制 蒸餾水蒸餾水母液母液生長調(diào)節(jié)劑生長調(diào)節(jié)劑瓊脂粉瓊脂粉蔗糖蔗糖 融化融化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH分裝分裝滅菌滅菌冷卻冷卻二、無菌技術(shù)二、無菌技術(shù)有菌的范疇有菌的范疇凡是凡是暴露暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的至少它的表面表面都是有菌的，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。都是有菌的，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。無菌的范疇無菌的范疇經(jīng)經(jīng)高溫灼燒高溫灼燒或一定時(shí)間或一定時(shí)間蒸煮蒸煮過后的物體，過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，高層大氣

36、、巖石內(nèi)部、高層大氣、巖石內(nèi)部、強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等的表面和內(nèi)部等等都是無菌的。強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等的表面和內(nèi)部等等都是無菌的。 污染污染 指在組織培養(yǎng)過程中由于真菌、細(xì)菌或病毒的侵染，指在組織培養(yǎng)過程中由于真菌、細(xì)菌或病毒的侵染，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。直接侵入培養(yǎng)物中，直接侵入培養(yǎng)物中，殺死殺死培養(yǎng)物；培養(yǎng)物；向培養(yǎng)基分泌有毒物質(zhì)，向培養(yǎng)基分泌有毒物質(zhì)，毒死毒死培養(yǎng)物；培養(yǎng)物；競爭培養(yǎng)基養(yǎng)分使?fàn)I養(yǎng)耗盡，培養(yǎng)物競爭培養(yǎng)基養(yǎng)分使?fàn)I養(yǎng)耗盡，培養(yǎng)物饑餓饑餓而死。而死。污染所引起的危害污染所引起的危害污染引起的危害

37、有的是極明顯的，污染引起的危害有的是極明顯的，如如早期早期培養(yǎng)的失敗，增殖效率的降低，生長減慢，培養(yǎng)的失敗，增殖效率的降低，生長減慢，玻璃苗玻璃苗增加，生長的不均勻等；增加，生長的不均勻等；而有的影響可在而有的影響可在以后以后的過程顯現(xiàn)，如移栽困難和苗的死亡，田間的不良表現(xiàn)。的過程顯現(xiàn)，如移栽困難和苗的死亡，田間的不良表現(xiàn)。污染也會引起培養(yǎng)物的污染也會引起培養(yǎng)物的遺傳變異遺傳變異。有些有些病原菌病原菌的存在（如國際上已發(fā)現(xiàn)的某些商業(yè)生產(chǎn)的試管苗的存在（如國際上已發(fā)現(xiàn)的某些商業(yè)生產(chǎn)的試管苗帶有帶有胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌），可以引起多種作物的），可以引起多種作物的病害病害；試管苗（在

38、未進(jìn)行專門的病原體脫除和鑒定時(shí)）試管苗（在未進(jìn)行專門的病原體脫除和鑒定時(shí)）也常是很多致病的病毒、類病毒、類菌原體的攜帶者，也常是很多致病的病毒、類病毒、類菌原體的攜帶者，育目發(fā)展可能引起育目發(fā)展可能引起病毒大規(guī)模的擴(kuò)散病毒大規(guī)模的擴(kuò)散。（一）污染源及其表現(xiàn)特征（一）污染源及其表現(xiàn)特征1. 外植體外植體 表面帶菌：接種后表面帶菌：接種后很快很快長出微生物菌落長出微生物菌落; 內(nèi)生帶菌：接種后內(nèi)生帶菌：接種后一定時(shí)間一定時(shí)間才表現(xiàn)出來。才表現(xiàn)出來。 特征：靠近外植體特征：靠近外植體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)基表面出現(xiàn)微生物菌落。出現(xiàn)微生物菌落。 2. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基在培養(yǎng)基表層表層和和深層深層同時(shí)出現(xiàn)

39、點(diǎn)狀分布的菌落。同時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀分布的菌落。3. 培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 在培養(yǎng)基與容器在培養(yǎng)基與容器接觸處接觸處 或或器壁上器壁上出現(xiàn)菌落。出現(xiàn)菌落。4. 工作人員工作人員 在培養(yǎng)基在培養(yǎng)基表面表面 或操作器械或操作器械接觸處接觸處出現(xiàn)菌落。出現(xiàn)菌落。5. 空氣空氣 原因：超凈工作臺故障；原因：超凈工作臺故障； 瓶塞過松瓶塞過松 特征：在培養(yǎng)基特征：在培養(yǎng)基表面靠近表面靠近培養(yǎng)容器壁處出現(xiàn)菌落。培養(yǎng)容器壁處出現(xiàn)菌落。（二）常用的滅菌方法（二）常用的滅菌方法滅菌滅菌用物理或化學(xué)的方法，用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物

40、質(zhì)即把所有生命的物質(zhì)全部殺死全部殺死。消毒消毒殺死、消除或充分抑制殺死、消除或充分抑制部分微生物部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。使之不再發(fā)生危害作用。1. 加熱滅菌加熱滅菌1）濕熱滅菌）濕熱滅菌設(shè)備：高壓滅菌鍋設(shè)備：高壓滅菌鍋原理：通過蒸汽接觸材料表面原理：通過蒸汽接觸材料表面 冷凝時(shí)釋放熱能冷凝時(shí)釋放熱能達(dá)到殺死微生物的目的。達(dá)到殺死微生物的目的。工作條件：工作條件：1-1.2kg/2，20-30 min。 121 ，15 min。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 滅菌前排盡冷空氣；滅菌前排盡冷空氣； 滅菌后壓力切勿降低太快。滅菌后壓力切勿降低太快。2 2）干熱滅菌）干熱滅菌灼燒灼燒 蘸蘸95%酒精燃燒

41、器具。酒精燃燒器具。烘燒烘燒 設(shè)備：設(shè)備： 烘箱烘箱 工作條件：工作條件：140，4h 或或160-170，2-3h注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 要妥為要妥為包扎包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染；，以免滅菌后取用時(shí)重新污染； 溫度一般溫度一般勿超過勿超過175 2. 化學(xué)滅菌化學(xué)滅菌 1）液體滅菌：酒精、升汞、雙氧水、次氯酸鈉等，適用于）液體滅菌：酒精、升汞、雙氧水、次氯酸鈉等，適用于外植體外植體表面滅菌。表面滅菌。 2）氣體滅菌：甲醛、乙二醇。）氣體滅菌：甲醛、乙二醇。 向向甲醛甲醛內(nèi)加入內(nèi)加入高錳酸鉀高錳酸鉀，促進(jìn)甲醛的快速，促進(jìn)甲醛的快速揮發(fā)揮發(fā)而起到滅菌的作用。而起到滅菌的作用。 用于用于培養(yǎng)室和接種室培養(yǎng)室和接種室的滅菌，每立方米用甲醛的滅菌，每立方米用甲醛2毫升，高錳酸鉀毫升，高錳酸鉀1克，克， 3. 紫外輻射滅菌紫外輻射滅菌 原理：細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生原理：細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)變化，變化， 引起細(xì)菌的引起細(xì)菌的染色體染色體變異，造成死亡。變異，造成死亡。 用途：紫外線的穿透能力