生化技術(shù)：1生命大分子物質(zhì)的制備

1、 第一章第一章 生命大分子物質(zhì)的制備生命大分子物質(zhì)的制備生命大分子物質(zhì)生命大分子物質(zhì) 是指動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的是指動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)( (包括酶包括酶) )和和核酸核酸等有機(jī)化合物的總稱等有機(jī)化合物的總稱 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和和核酸核酸類物質(zhì)是本學(xué)科的主要研究對(duì)象，而類物質(zhì)是本學(xué)科的主要研究對(duì)象，而它們往往與其他物質(zhì)結(jié)合在一起，或蛋白質(zhì)和核酸相互它們往往與其他物質(zhì)結(jié)合在一起，或蛋白質(zhì)和核酸相互組合而一起出現(xiàn)，加之它們組合而一起出現(xiàn)，加之它們含量低含量低、離體后、離體后穩(wěn)定性較差穩(wěn)定性較差，使得提取分離過(guò)程變得困難；盡管如此，制備生命大分使得提

2、取分離過(guò)程變得困難；盡管如此，制備生命大分子物質(zhì)的程序還是存在不少共同之處子物質(zhì)的程序還是存在不少共同之處目目 的的n掌握材料的選擇與處理及確立測(cè)定方法掌握材料的選擇與處理及確立測(cè)定方法n掌握細(xì)胞的破碎、抽提、濃縮掌握細(xì)胞的破碎、抽提、濃縮n熟悉純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)熟悉純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)第一節(jié)第一節(jié) 材料的選擇與處理材料的選擇與處理一、材料的選擇一、材料的選擇是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)有效成分的定義有效成分的定義生物材料的特點(diǎn)生物材料的特點(diǎn)n有效成分含量一般較低有效成分含量一般較低n有效成分穩(wěn)定性較差有效成分穩(wěn)定性較差 選用的材料不同，有效成分的

3、含量就不同；選用的材料不同，有效成分的含量就不同；即使選用的材料相同，不同的部位和生長(zhǎng)時(shí)期，即使選用的材料相同，不同的部位和生長(zhǎng)時(shí)期，其有效成分的含量也不盡相同其有效成分的含量也不盡相同材料選擇原則材料選擇原則n有效成分含量高，穩(wěn)定性好有效成分含量高，穩(wěn)定性好n材料來(lái)源豐富，保持新鮮材料來(lái)源豐富，保持新鮮n提取工藝簡(jiǎn)單提取工藝簡(jiǎn)單n有綜合利用價(jià)值有綜合利用價(jià)值 實(shí)際工作中，不能硬套原則，要視實(shí)際情況實(shí)際工作中，不能硬套原則，要視實(shí)際情況而定而定二、材料的處理二、材料的處理 對(duì)于生物材料，應(yīng)及時(shí)使用，否則有效成分會(huì)部分對(duì)于生物材料，應(yīng)及時(shí)使用，否則有效成分會(huì)部分甚至全部被破壞，影響得率甚至全部被

4、破壞，影響得率 若處理不當(dāng)，會(huì)嚴(yán)重影響有效成分的產(chǎn)量和質(zhì)量若處理不當(dāng)，會(huì)嚴(yán)重影響有效成分的產(chǎn)量和質(zhì)量（一）動(dòng)物臟器（一）動(dòng)物臟器冰凍：去除脂肪和筋皮等非有效部位，冰凍：去除脂肪和筋皮等非有效部位，-10或或-70 冰凍儲(chǔ)存冰凍儲(chǔ)存干燥：干燥：小量（如垂體等小組織）可用丙酮脫水干燥小量（如垂體等小組織）可用丙酮脫水干燥 對(duì)于耐高溫的有效成分（肝素），其材料可用沸對(duì)于耐高溫的有效成分（肝素），其材料可用沸 水蒸煮處理，水蒸煮處理，烘干后保存烘干后保存除脂方法除脂方法n人工剝離人工剝離n用脂溶性有機(jī)溶劑脫脂用脂溶性有機(jī)溶劑脫脂n熱處理冷藏法（速熱到熱處理冷藏法（速熱到50 左右，然后速冷卻），使左右

5、，然后速冷卻），使其結(jié)塊而除去其結(jié)塊而除去n運(yùn)用油脂分離器分離運(yùn)用油脂分離器分離（二）植物組織（二）植物組織 莖葉等洗凈即可使用，或快速放置莖葉等洗凈即可使用，或快速放置-430儲(chǔ)藏備用；若為種子，則需泡脹或粉碎才使用儲(chǔ)藏備用；若為種子，則需泡脹或粉碎才使用（油脂較多的也需脫脂處理）（油脂較多的也需脫脂處理）（三）微生物（三）微生物 由于具有種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、誘變?nèi)菀子捎诰哂蟹N類多、繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、誘變?nèi)菀缀筒皇芗竟?jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為制備生命大分子物和不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一質(zhì)的主要材料之一 上清：制備胞外酶和輔基等成分上清：制備胞外酶和輔基等成

6、分培養(yǎng)液培養(yǎng)液 離心離心 菌體：破壁后提取胞內(nèi)成分菌體：破壁后提取胞內(nèi)成分 第二節(jié)第二節(jié) 確立測(cè)定方法確立測(cè)定方法 一、目的要求一、目的要求u 目的：目的：1.確定生物材料確定生物材料 2.確定提取純化方法的有效性確定提取純化方法的有效性u(píng)要求：方法簡(jiǎn)單、靈敏、專一性強(qiáng)（因?yàn)槌樘嵋汉图円螅悍椒ê?jiǎn)單、靈敏、專一性強(qiáng)（因?yàn)槌樘嵋汉图?化的前階段溶液中有效成分的比活低而雜質(zhì)的種化的前階段溶液中有效成分的比活低而雜質(zhì)的種 類多且含量高）類多且含量高） 常用的測(cè)定方法常用的測(cè)定方法 u光譜法光譜法 ：包括吸收光譜法、熒光法、濁度法包括吸收光譜法、熒光法、濁度法u電化學(xué)法電化學(xué)法 u生物活性檢測(cè)法生物活

7、性檢測(cè)法 u免疫分析法免疫分析法 u生物傳感器生物傳感器 （一）光譜法（一）光譜法特點(diǎn)：所需樣品量少，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，靈敏（特點(diǎn)：所需樣品量少，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，靈敏（10-7）。）。 廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定1.吸收光譜法吸收光譜法u直接測(cè)定：將待測(cè)物配成一定濃度的溶液，在一定波直接測(cè)定：將待測(cè)物配成一定濃度的溶液，在一定波 長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)定其含量長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)定其含量如如測(cè)定核酸含量：測(cè)定核酸含量：雙鏈雙鏈DNA：50g/ml；單鏈單鏈DNA：g/ml；單鏈單鏈NA：g/ml；A260=1 純度測(cè)定純度測(cè)定:純純DNA A260/A280 =1.8;純

8、純RNA A260/A280 =2.0 (若若DNA A260/A280 1.8或或2.0,說(shuō)明有蛋白質(zhì)混入說(shuō)明有蛋白質(zhì)混入)u比色法比色法:將待測(cè)物與相關(guān)試劑或酶的底物作用產(chǎn)生具有將待測(cè)物與相關(guān)試劑或酶的底物作用產(chǎn)生具有 特定顏色的物質(zhì)特定顏色的物質(zhì), ,通過(guò)測(cè)定有色物質(zhì)的通過(guò)測(cè)定有色物質(zhì)的A A值對(duì)待值對(duì)待 測(cè)物定量或測(cè)定酶的活性測(cè)物定量或測(cè)定酶的活性2.熒光法熒光法特點(diǎn)：精確、靈敏（特點(diǎn)：精確、靈敏（10-9-10）、重復(fù)性好）、重復(fù)性好如如AST的測(cè)定：的測(cè)定：ASP+-酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸+Glu 草酰乙酸草酰乙酸+NADH+H+ L-蘋果酸蘋果酸+NAD+ + AST

9、AST活力測(cè)定就是通過(guò)測(cè)定在活力測(cè)定就是通過(guò)測(cè)定在340nm340nm（NADHNADH）處的）處的A A值下降量值下降量ASTMDH3.濁度法濁度法主要對(duì)稀懸浮液進(jìn)行測(cè)定主要對(duì)稀懸浮液進(jìn)行測(cè)定如：半刀豆球蛋白活力測(cè)定如：半刀豆球蛋白活力測(cè)定 A420 培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度測(cè)定培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度測(cè)定 A600（二）電化學(xué)法（二）電化學(xué)法用用pH計(jì)或酸堿滴定進(jìn)行測(cè)定計(jì)或酸堿滴定進(jìn)行測(cè)定（三）生物活性檢測(cè)法（三）生物活性檢測(cè)法 根據(jù)生命活性物質(zhì)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上引起的變化對(duì)根據(jù)生命活性物質(zhì)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上引起的變化對(duì)生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè) 如：如：HCG能使小鼠子宮加速增殖，故通過(guò)注入能

10、使小鼠子宮加速增殖，故通過(guò)注入HCG后檢測(cè)小鼠子宮的變化來(lái)推測(cè)后檢測(cè)小鼠子宮的變化來(lái)推測(cè)HCG 的生物活性的生物活性（四）免疫分析法（四）免疫分析法 利用利用Ag-AbAg-Ab特異反應(yīng)，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記特異反應(yīng)，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記，對(duì)有關(guān)物質(zhì)靈敏定性或定量或酶標(biāo)記，對(duì)有關(guān)物質(zhì)靈敏定性或定量 如：酶聯(lián)免疫吸附法如：酶聯(lián)免疫吸附法（五）生物傳感器（五）生物傳感器 利用生物傳感器的利用生物傳感器的 敏感膜與待測(cè)液中某一成分進(jìn)行敏感膜與待測(cè)液中某一成分進(jìn)行反應(yīng)，來(lái)顯示有效成分的數(shù)量反應(yīng)，來(lái)顯示有效成分的數(shù)量 幾種測(cè)定蛋白質(zhì)和核酸含量的方法 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎 有效成

11、分有的存在于有效成分有的存在于“材料材料”細(xì)胞外，有的存在于細(xì)胞細(xì)胞外，有的存在于細(xì)胞內(nèi)。就原核細(xì)胞而言，若有效成分分泌到內(nèi)。就原核細(xì)胞而言，若有效成分分泌到細(xì)胞外細(xì)胞外（如淀粉酶（如淀粉酶類、水解酶類），則分離培養(yǎng)液上清，用相應(yīng)試劑和方法即類、水解酶類），則分離培養(yǎng)液上清，用相應(yīng)試劑和方法即可提取制備；若有效成分存在于可提取制備；若有效成分存在于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)（如氧化還原酶類），（如氧化還原酶類），則需破碎細(xì)胞，再進(jìn)行提取則需破碎細(xì)胞，再進(jìn)行提取 但也有例外，如從銅綠假單胞菌中提取但也有例外，如從銅綠假單胞菌中提取ALPALP時(shí)，可不破細(xì)時(shí)，可不破細(xì)胞，用含胞，用含0.2mol/LMgCl0.

12、2mol/LMgCl2 2的的0.01mol/LTris-HCl0.01mol/LTris-HCl緩沖液（緩沖液（pH8.4pH8.4）或或0.2mol/LMgCl0.2mol/LMgCl2 2的溶液（的溶液（pH8.4pH8.4）進(jìn)行抽提（提取酶蛋白后）進(jìn)行抽提（提取酶蛋白后的細(xì)菌細(xì)胞，可繼續(xù)培養(yǎng)）的細(xì)菌細(xì)胞，可繼續(xù)培養(yǎng)） 一般動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜比較脆弱，極易破碎，往往在組一般動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜比較脆弱，極易破碎，往往在組織絞碎或提取時(shí)就破壞了，而植物和微生物的細(xì)胞壁較牢固，織絞碎或提取時(shí)就破壞了，而植物和微生物的細(xì)胞壁較牢固，需提前進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作需提前進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作常用方法常用方法

13、n機(jī)械破碎機(jī)械破碎（研磨法、組織器搗碎法、超聲波法、（研磨法、組織器搗碎法、超聲波法、壓榨法和凍融法）壓榨法和凍融法）n溶脹和自溶溶脹和自溶n化學(xué)處理化學(xué)處理n生物酶降解生物酶降解一、機(jī)械破碎一、機(jī)械破碎1.1.研磨法：研磨法：將剪碎的動(dòng)物組織置研缽中，用研磨棒研將剪碎的動(dòng)物組織置研缽中，用研磨棒研 磨。為提高研磨效率，也可加入一定量的石磨。為提高研磨效率，也可加入一定量的石 英砂（注意英砂（注意“吸附吸附”）。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可）。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可 用電動(dòng)研磨法（如球磨機(jī)）用電動(dòng)研磨法（如球磨機(jī)）此法為此法為溫和破碎，適用于動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞的破碎溫和破碎，適用于動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞的破碎2.2

14、.組織搗碎器法：組織搗碎器法：搗碎器（搗碎器（8000800010000r/min10000r/min）處理）處理303045S, 45S, 植物和動(dòng)物細(xì)胞可完全破碎，但對(duì)微生物需加石英砂才有效植物和動(dòng)物細(xì)胞可完全破碎，但對(duì)微生物需加石英砂才有效；注意必須低溫?fù)v碎，以防溫度升高引起有效成分變性，因；注意必須低溫?fù)v碎，以防溫度升高引起有效成分變性，因此時(shí)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)此時(shí)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)劇烈方法劇烈方法3.超聲波法：超聲波法：利用超聲波破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法利用超聲波破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法，時(shí)間一般較長(zhǎng)，（，時(shí)間一般較長(zhǎng)，（5 510min或更長(zhǎng)。為防止電器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)或更長(zhǎng)。為防止電器長(zhǎng)時(shí)間

15、運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)熱，一般采用間歇處理和降溫破碎法）轉(zhuǎn)產(chǎn)熱，一般采用間歇處理和降溫破碎法）4.4.壓榨法：壓榨法：用高壓（高于用高壓（高于10001000倍以上大氣壓的壓力）迫使倍以上大氣壓的壓力）迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔（幾十毫升細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔（孔徑細(xì)胞直徑孔徑細(xì)胞直徑），使），使細(xì)胞被細(xì)胞被擠破擠破5.5.凍融法：凍融法：將細(xì)胞反復(fù)速凍（低溫）速融（高溫，如將細(xì)胞反復(fù)速凍（低溫）速融（高溫，如4040），使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞破碎二、溶脹和自溶二、溶脹和自溶u溶脹：將細(xì)胞置低滲環(huán)境中，細(xì)胞水腫、脹裂，釋出胞內(nèi)溶物溶脹：將細(xì)胞置低滲環(huán)境中，細(xì)胞水腫、脹裂，釋出胞內(nèi)溶物 如：紅細(xì)胞置蒸餾水中會(huì)迅

16、速溶脹破裂而釋放血紅素如：紅細(xì)胞置蒸餾水中會(huì)迅速溶脹破裂而釋放血紅素u自溶：細(xì)胞在本身具有的水解酶（如蛋白酶、酯酶自溶：細(xì)胞在本身具有的水解酶（如蛋白酶、酯酶 類類 ）作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象（如尸體的腐化）作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象（如尸體的腐化） 此法要注意酶對(duì)有效成分是否有分解作用此法要注意酶對(duì)有效成分是否有分解作用 三、化學(xué)處理三、化學(xué)處理 運(yùn)用脂溶性溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表面活運(yùn)用脂溶性溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表面活性劑（如性劑（如SDS等）處理細(xì)胞時(shí)，可溶解細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的等）處理細(xì)胞時(shí)，可溶解細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的部分結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的酶、部分結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的酶、DNA等物質(zhì)釋放

17、出來(lái)等物質(zhì)釋放出來(lái)四、生物酶降解四、生物酶降解 生物酶（如溶菌酶等）能降解細(xì)胞壁。在用此法處理生物酶（如溶菌酶等）能降解細(xì)胞壁。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，先是細(xì)胞壁消化降解，然后由于滲透壓差細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，先是細(xì)胞壁消化降解，然后由于滲透壓差引起細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎引起細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎 如從細(xì)菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒如從細(xì)菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA時(shí)，很多方法都是采用時(shí)，很多方法都是采用了加溶菌酶破壁了加溶菌酶破壁 第四節(jié)第四節(jié) 抽抽 提提 u含義：抽提通常是指用適當(dāng)?shù)某樘嵬ǔＪ侵赣眠m當(dāng)?shù)娜軇┤軇┖头椒?，從原料中把有和方法，從原料中把有效成分分離出來(lái)的過(guò)程效成分分離出來(lái)的過(guò)程u一

18、般理想的抽提溶劑應(yīng)具備下述條件一般理想的抽提溶劑應(yīng)具備下述條件 對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用小對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用小 對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很小對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很小 來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等一、抽提的含義一、抽提的含義 對(duì)不同組織抽提的具體對(duì)不同組織抽提的具體抽提方法抽提方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)可參閱有關(guān)文獻(xiàn)二、影響抽提的因素二、影響抽提的因素（一）（一）pH值值 抽提溶劑抽提溶劑pH值對(duì)有效成分的穩(wěn)定性和抽提效率都有極大值對(duì)有效成分的穩(wěn)定性和抽提效率都有極大影響。對(duì)于兩性電解質(zhì)成分的提取，一般選擇影響。對(duì)于兩性電解質(zhì)成分的提取，一般選擇pH值偏離等電值

19、偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)抽提點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)抽提 如肝素提取時(shí)，在酸性如肝素提取時(shí)，在酸性pH范圍內(nèi)易受破壞，且不易與脂范圍內(nèi)易受破壞，且不易與脂蛋白分離；而在堿性蛋白分離；而在堿性pH范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，不能與帶范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，不能與帶強(qiáng)負(fù)電荷的肝素形成離子鍵而分離。故選擇強(qiáng)負(fù)電荷的肝素形成離子鍵而分離。故選擇pH10.511的高堿的高堿性性注意：注意：調(diào)抽提液調(diào)抽提液pH時(shí)，一般時(shí)，一般pH用弱酸（用弱酸（HCL）或弱堿調(diào)）或弱堿調(diào)節(jié)，且應(yīng)及時(shí)攪拌均勻，如果攪拌不均，以免局部節(jié)，且應(yīng)及時(shí)攪拌均勻，如果攪拌不均，以免局部pH過(guò)過(guò)高或過(guò)低而引起所需成分變性高或過(guò)低而引起所需成分變性（二

20、）溶劑的極性和離子強(qiáng)度（二）溶劑的極性和離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)溶劑極性的方法調(diào)節(jié)溶劑極性的方法:增加極性增加極性加蔗糖或甘油加蔗糖或甘油 降低極性降低極性加加DMSO或二甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度：加入中性鹽，如加入中性鹽，如KCl、NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4等等 一般，離子強(qiáng)度低的中性鹽溶液有促進(jìn)一般，離子強(qiáng)度低的中性鹽溶液有促進(jìn) pro溶解，保護(hù)蛋白質(zhì)活性的作用；離子溶解，保護(hù)蛋白質(zhì)活性的作用；離子強(qiáng)度過(guò)高會(huì)引起強(qiáng)度過(guò)高會(huì)引起pro鹽析鹽析（三）水解酶（三）水解酶 水解酶在生物組織中往往與蛋白質(zhì)、核酸等共存。在提水解酶在生物組織中往往與蛋白質(zhì)、核酸等共存。在提取

21、分離過(guò)程中應(yīng)采取適當(dāng)方法抑制酶的活性；如加苯甲基磺取分離過(guò)程中應(yīng)采取適當(dāng)方法抑制酶的活性；如加苯甲基磺酰氟化物（酰氟化物（PMSF）、調(diào)節(jié)抽提液的）、調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子強(qiáng)度或極性等、離子強(qiáng)度或極性等 例：胰島素的制備原理例：胰島素的制備原理 幾 種 蛋 白 酶 的 抑 制 劑苯甲基磺酰氟化物（PMSF ）在水溶液的半衰期 在抽提液中加入在抽提液中加入2-巰基乙醇巰基乙醇(15mmol/L)或半胱氨酸或半胱氨酸(520mmol/L)、還原谷胱甘肽和巰基乙酸鹽還原谷胱甘肽和巰基乙酸鹽(15mmol/L)等還原劑等還原劑時(shí)，就可以防時(shí)，就可以防止巰基發(fā)生氧化作用，或者延緩某些酶活性的喪失止巰基發(fā)

22、生氧化作用，或者延緩某些酶活性的喪失 在抽提液中，酶和巰基試劑間發(fā)生如下反應(yīng)：在抽提液中，酶和巰基試劑間發(fā)生如下反應(yīng)： ENZ-S-S-ENZ + RSH ENZ-SH + ENZ-S-S-R 無(wú)活性酶無(wú)活性酶 巰基試劑巰基試劑 活化的酶活化的酶 無(wú)活性酶無(wú)活性酶 ENZ-S-S-R + RSH ENZ-SH + R-S-S-R（四）溫度（四）溫度 一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì)在低溫（如一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì)在低溫（如0左右）條件下較穩(wěn)定左右）條件下較穩(wěn)定 例：從孕婦尿中提取例：從孕婦尿中提取HCG在在8以下以下 但此規(guī)律不是絕對(duì)的，也有的物質(zhì)在相對(duì)高溫條件下更但此規(guī)律不

23、是絕對(duì)的，也有的物質(zhì)在相對(duì)高溫條件下更穩(wěn)定穩(wěn)定 例：從鳥肝中提取例：從鳥肝中提取丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶25（五）攪拌（五）攪拌 攪拌可促進(jìn)溶劑與待提取成分的接觸，并能增加溶攪拌可促進(jìn)溶劑與待提取成分的接觸，并能增加溶解度；但應(yīng)溫和攪拌，否則容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶解度；但應(yīng)溫和攪拌，否則容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶變性失活變性失活（六）氧化（六）氧化 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中往往含有一定數(shù)量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中往往含有一定數(shù)量的-SH（為蛋白質(zhì)或酶的必須基團(tuán)），（為蛋白質(zhì)或酶的必須基團(tuán)），易被氧化變質(zhì)失活易被氧化變質(zhì)失活 解決方法：解決方法：在抽提液中加入在抽提液中加入2-巰基乙醇、巰基乙醇、Cys、GS

24、H、巰基乙酸鹽等、巰基乙酸鹽等 另外，植物組織和微生物細(xì)胞中含有較多酚類化合物，也易被多酚另外，植物組織和微生物細(xì)胞中含有較多酚類化合物，也易被多酚氧化酶氧化成紅色或棕色的醌類化合物；可通過(guò)加入氧化酶氧化成紅色或棕色的醌類化合物；可通過(guò)加入10%苯基硫脲或苯基硫脲或310-3mmol/L的的PVP，防止氧化，防止氧化（七）金屬離子（七）金屬離子金屬離子能與金屬離子能與-SH結(jié)合成沉淀物結(jié)合成沉淀物解決辦法：解決辦法：1.用去離子水或重蒸水配制試劑用去離子水或重蒸水配制試劑 2.在配制的試劑中加入在配制的試劑中加入13mmol/L的的EDTA（八）抽提溶劑的用量（八）抽提溶劑的用量 在抽提時(shí)，溶

25、劑與抽提物原料要適當(dāng)，一般以在抽提時(shí)，溶劑與抽提物原料要適當(dāng)，一般以5 1為為宜；如抽提物過(guò)多，則有利于有效成分的提取，但不利于宜；如抽提物過(guò)多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行純化工序的進(jìn)行第五節(jié)第五節(jié) 濃濃 縮縮 常用的濃縮方法有下面幾種常用的濃縮方法有下面幾種 沉淀法沉淀法 吸附法吸附法 超過(guò)濾法超過(guò)濾法 透析法透析法 減壓蒸餾法減壓蒸餾法 冰凍干燥法冰凍干燥法一、沉淀法一、沉淀法u在抽提液中加入適量中性鹽，如（在抽提液中加入適量中性鹽，如（NH4）2SO4或有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑，使，使有效成分沉淀有效成分沉淀u沉淀物復(fù)溶后，經(jīng)離心除去不溶物（沉淀物復(fù)溶后，經(jīng)離心除去不溶物（

26、雜質(zhì)雜質(zhì)），上清液通過(guò)），上清液通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾等方法脫鹽等透析、凝膠過(guò)濾等方法脫鹽等二、吸附法二、吸附法 用干用干葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-25（或吸水棒）加入抽提液中，（或吸水棒）加入抽提液中，1 5混合，利用凝膠的吸水性去除抽提液中的水分（混合，利用凝膠的吸水性去除抽提液中的水分（注意：若凝注意：若凝膠對(duì)有效成分有吸附，則不宜用此法濃縮膠對(duì)有效成分有吸附，則不宜用此法濃縮）三、超三、超 濾濾 法法 將抽提液裝入超濾裝置，在氮?dú)饣蚩諏⒊樘嵋貉b入超濾裝置，在氮?dú)饣蚩諝鈮毫Γ鈮毫Γ?.055.0510105 5PaPa）下，使小分子物質(zhì)）下，使小分子物質(zhì)（包括水等）通過(guò)半透膜除去，而大分子（

27、包括水等）通過(guò)半透膜除去，而大分子物質(zhì)則留在膜內(nèi)，即起到濃縮的目的，又物質(zhì)則留在膜內(nèi)，即起到濃縮的目的，又發(fā)揮純化的作用（如硝酸纖維素膜）發(fā)揮純化的作用（如硝酸纖維素膜）四、透四、透 析析 法法 將裝有抽提液的透吸袋（半透膜袋）將裝有抽提液的透吸袋（半透膜袋）埋于埋于PEGPEG或甘油中，利用其強(qiáng)親水性吸干或甘油中，利用其強(qiáng)親水性吸干抽提液中的水分抽提液中的水分五、減壓蒸餾法五、減壓蒸餾法 在減壓（真空）狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。在減壓（真空）狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。當(dāng)真空度較高時(shí)，溶液沸點(diǎn)可控制在較當(dāng)真空度較高時(shí)，溶液沸點(diǎn)可控制在較低溫度（如低溫度（如3030以下）以下） 適合于常溫（適合于常溫（3030）較

28、穩(wěn)定的物質(zhì)）較穩(wěn)定的物質(zhì)的濃縮的濃縮六、冰凍干燥法六、冰凍干燥法原理：原理：利用低溫真空升華原理；即是將冰凍的抽提液利用低溫真空升華原理；即是將冰凍的抽提液置抽真空的干燥器中（如置抽真空的干燥器中（如P2O5、硅膠等），水從固態(tài)、硅膠等），水從固態(tài)升華為氣態(tài)并被干燥劑吸附，使抽提液濃縮升華為氣態(tài)并被干燥劑吸附，使抽提液濃縮第六節(jié)第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià) 純化方案的定義純化方案的定義 指在純化某一物質(zhì)過(guò)程中，將幾種分離方法（如指在純化某一物質(zhì)過(guò)程中，將幾種分離方法（如沉淀、離子交換、凝膠過(guò)濾等）有機(jī)地互補(bǔ)聯(lián)合形成沉淀、離子交換、凝膠過(guò)濾等）有機(jī)地互補(bǔ)聯(lián)合形成的純化工藝流程的純化工藝流程一、純化方案的設(shè)計(jì)一、純化方案的設(shè)計(jì) 1、選擇、選擇分離方法：分離方法： 一般從抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理一般從抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理 化性質(zhì)的差異化性質(zhì)的差異性考慮的性考慮的 2 2、純化方案中各分離方法的排布原則、純化方案中各分離方法的排布原則 一般應(yīng)當(dāng)先選用粗放、快速、有利于縮小樣品一般應(yīng)當(dāng)先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工