植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng).

1、第五章 植物原生質(zhì)體的別離、培養(yǎng)與雜交 楊柏云南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 在細(xì)胞工程中，植物原生質(zhì)體不但是植物細(xì)胞雜交良好的親本，而且是植物細(xì)胞遺傳工程的理想受體，此外，植物原生質(zhì)體也是細(xì)胞生物學(xué)研究的很有用的實驗材料。植物原生質(zhì)體的別離和培養(yǎng)是到達(dá)這些目的的重要技術(shù)根底，因此，掌握和運用這一技術(shù)是十分重要的。 二. 植物原生質(zhì)體的根本特點與作用 植物原生質(zhì)體是脫掉了細(xì)胞壁的、僅有質(zhì)膜包圍、裸露的、活植物細(xì)胞。與完整的植物細(xì)胞相比，它有以下主要特點：單細(xì)胞，在同一時間內(nèi)能得到大量的遺傳上同質(zhì)的原生質(zhì)體，用它可象細(xì)菌細(xì)胞那樣進(jìn)行多種遺傳學(xué)研究。不親和障礙，為較遠(yuǎn)緣的植物細(xì)胞雜交提供了融合親本

2、。二. 植物原生質(zhì)體的根本特點與作用外源顆粒，如DNA，質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌和其它細(xì)胞器，因此在植物遺傳工程中有重要作用。4.植物原生質(zhì)體也和植物細(xì)胞一樣，具有該植物體的全部遺傳信息，在適宜的培養(yǎng)條件下，它能象一粒種子那樣發(fā)育成與其親本相似的新的植物，即具有遺傳全能性。二. 植物原生質(zhì)體的根本特點與作用細(xì)胞壁的生物合成提供了方便。細(xì)胞膜與信息的傳遞，能量的轉(zhuǎn)換，物質(zhì)的運輸?shù)雀粳F(xiàn)象之間的密切聯(lián)系提供了可能。受體，同時又是別離細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器，如細(xì)胞核、葉綠體、線粒體等的好材料。見圖1：三. 植物原生質(zhì)體的材料來源 研究說明，幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)體(詳見圖二)，其中以葉片為多，因為植物葉

3、肉細(xì)胞的原生質(zhì)體有下面幾個優(yōu)點：1.取材容易，植株可來自盆栽和溫室栽培，也可在試管中培育無菌苗。2.原生質(zhì)體在生理和遺傳特性上比較一致。三. 植物原生質(zhì)體的材料來源3.比較容易用酶解法別離。根尖組織也是植物原生質(zhì)體的重要來源，它可由各種植物的種子萌發(fā)后取得?；ǚ劢?jīng)特異酶處理也能得到原生質(zhì)體，在單倍體遺傳育種中有特殊的用途。三. 植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中大量獲得。由于組織培養(yǎng)的嚴(yán)格條件，使得材料的重復(fù)性好，實驗材料可做到常年供給。 值得注意的是，在考慮別離植物原生質(zhì)體時，既要采用容易獲得原生質(zhì)體的植物材料，但更重要的是要選用易于再生完整植株的細(xì)胞。詳見圖2四. 植物

4、原生質(zhì)體的別離和純化(一) 原生質(zhì)體的別離旱在1892年就有人用機械法別離原生質(zhì)體。直到1960年，英國的科金(Cocking)首先采用酶解法別離原生質(zhì)體，這一重要發(fā)現(xiàn)開辟了細(xì)胞工程研究的許多領(lǐng)域，作出了巨大的奉獻(xiàn)。四. 植物原生質(zhì)體的別離和純化酶解法有下面幾個優(yōu)點：l能獲得大量的原生質(zhì)體；l條件溫和，原生質(zhì)體完整性好；l原生質(zhì)體純潔度高；下面以葉片和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞為材料介紹別離原生質(zhì)體的一般步驟：(詳見圖3)四. 植物原生質(zhì)體的別離和純化1.材料的準(zhǔn)備與消毒：取充分展開的幼葉，用自來水沖冼干凈后，放入70%灑精中進(jìn)行外表消毒，再放入2%的次氯酸鈉溶液中處理10分鐘，再用無菌水沖冼3-4次。懸

5、浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般是用胚性細(xì)胞，這有利于原生質(zhì)體的再生。2.酶解：用鑷子撕去葉子的下表皮后，切成2厘米見方的小片，使去表皮的一層朝下放入酶液中處理，在25-28攝氏度，黑暗條件下酶解3-4小時。假設(shè)采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，那么采用繼代3天的細(xì)胞最好，經(jīng)離心收集細(xì)胞，放入酶液中置低速轉(zhuǎn)床酶解8-12小時。別離植物原生質(zhì)體常用試劑見表1.四. 植物原生質(zhì)體的別離和純化(二) 原生質(zhì)體的純化 植物材料經(jīng)酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：1.酶解懸浮液用400目的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過濾，以除去未消化的碎片。2.將含有原生質(zhì)體的酶液收集到離心管中，低速離心使原生質(zhì)體沉于管底，倒掉上清液。(二) 原生質(zhì)體的純化3.在離

6、心管中參加適量的洗滌液，并離心。4.重復(fù)上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌一次。上述的離心純化法可細(xì)分為：A沉降法；B漂浮法；C沉降法和漂浮法結(jié)合等三種。(詳見圖4) 四. 植物原生質(zhì)體的別離和純化(三) 原生質(zhì)體的活力測定 用于培養(yǎng)和細(xì)胞工程操作的必須是健康的有活力的原生質(zhì)體。方法有二：一是憑借形態(tài)可識別原生質(zhì)體的存活性。二是采用特異的染色方法來確定，可用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能著紅色；最好是采用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色。有活力的原生質(zhì)體帶有熒光，無活力的不產(chǎn)生熒光。五. 影響原生質(zhì)體別離的幾個因素 1.材料不同其細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)也有差異。因此分解細(xì)

7、胞壁的酶的種類和濃度也不相同，如別離根尖細(xì)胞的原生質(zhì)體要有較多的果膠酶。2.滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度也因材料不同而有變化。3.在酶液中參加適量的氯化鈣和磷酸二氫鉀作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強質(zhì)膜的穩(wěn)定性。五. 影響原生質(zhì)體別離的幾個因素pH值也直接影響別離的速度和穩(wěn)定性。pH值低那么別離速度較快，而損壞的較多；pH值高那么別離速度較慢，而完整性較好；故酶液的pH值一般為57左右。5.取材植株的生理狀態(tài)也是重要的因素，如采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般用繼代三天的較為理想。(詳見表二)六. 培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法 原生質(zhì)體經(jīng)別離和純化后，需要進(jìn)行活力測定和計數(shù)。原生質(zhì)體培養(yǎng)時有一種密度效應(yīng)，一般在每毫升培養(yǎng)

8、液中應(yīng)有10 個左右的原生質(zhì)體有利于培養(yǎng)。計數(shù)可用血球計數(shù)板進(jìn)行。常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有以下幾種：(詳見圖5)1.液體培養(yǎng)法：是把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。又可分為液體淺層培養(yǎng)法和液體懸滴法二種。六. 培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法2.固體平板法：它是把原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。3.雙層培養(yǎng)法：是在瓊脂培養(yǎng)基上部參加一薄層液體原生質(zhì)體培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。4.瓊脂糖包埋法：同固體平板法。詳見圖5六. 培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法七. 植物原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生 植物原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中，一般要經(jīng)過下面幾個不同的階段：1.細(xì)胞壁再生：2.細(xì)胞分裂：3.愈傷組織或胚狀體的形成

9、：4.植株再生：有二條途徑，一是從愈傷組織誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生；二是誘導(dǎo)胚狀體。八. 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合，也叫體細(xì)胞雜交，就是使別離出來的不同親本的原生質(zhì)體之間在人工控制的條件下，像性細(xì)胞受精作用那樣互相融合成一體。受精作用是一種自發(fā)的融合，而原生質(zhì)體由于質(zhì)膜外表帶有負(fù)電荷，它們之間通常是相互排斥的，所以自然融合頻率極低。所以要采用一定的方法加以誘導(dǎo)以促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。八. 原生質(zhì)體融合八. 原生質(zhì)體融合八. 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體的融合過程八. 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體的融合過程八. 原生質(zhì)體融合八. 原生質(zhì)體融合一原生質(zhì)體融合的方法1. 無機鹽誘導(dǎo)融合用來做融合劑的無機鹽是硝酸鈉，1972年Ca

10、rlsony就是用它來融合煙草的原生質(zhì)體，并首次獲得種間的體細(xì)胞雜種。其原理是硝酸鈉的作用是中和了質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起，但硝酸鈉對原生質(zhì)體有害作用，且誘導(dǎo)頻率也很低，所以目前很少有人采用。八. 原生質(zhì)體融合2. 聚二乙醇PEG與高pH的Ca2+相結(jié)合的誘導(dǎo)融合法1以常規(guī)的方法收集原生質(zhì)體，將兩親本的原生質(zhì)體高密度等體積混合。2滴3滴混合的原生質(zhì)體懸浮液于載玻片上，放置10分鐘。3加PEG 450L。PEG的制備方法：1gPEG參加的2mlmol/Lmmol/LCaCl2mmol/LKH2PO4溶液中，再放置1020分鐘。八. 原生質(zhì)體融合(4) ml高Ca2+

11、、高pH溶液，間隔10分鐘再加一次。其組成是50mmol/LCaCl2 、50mmol/L的甘氨酸鈉，pH10.5。(5) 加1ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌，洗滌5次，每次間隔5分鐘。(6)最后加300-500L原生質(zhì)體培養(yǎng)基，以微滴形式培養(yǎng)。八. 原生質(zhì)體融合用此方法的 誘導(dǎo)頻率可以高達(dá)10%-50%。并無種屬特性，幾乎可以誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體之間的融合。其原理是PEG是一種略帶負(fù)電的高分子化合物，在原生質(zhì)體的融合中起到一種橋的作用，可以使原生質(zhì)體凝聚，而鈣離子的參加會在質(zhì)膜與PEG中間起到連接作用。在洗脫PEG過程中，會導(dǎo)致質(zhì)膜外表電荷重排。由于粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，這種電荷的重排會導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷局部與另一個原生質(zhì)體的正電荷局部相連而導(dǎo)致融合。P1P2P1 P2高Ca2+高pH融 合洗 滌培 養(yǎng)選 擇混合靜止1min加入PEG加入培養(yǎng)基融合技術(shù)要點：電場下形成原生質(zhì)體凝聚體 八. 原生質(zhì)體融合3. 電融合技術(shù)就是使用電融合儀，其優(yōu)點在于防止了PEG、高鈣離子，高pH強加于原生質(zhì)體的生理非常條件，同時融合的條件更加數(shù)據(jù)化，更便于控制和相互比較。交變電流的強弱、處理時間的長短、電泳沖的大小等因素對融合的效果都有明顯的影響。八. 原生質(zhì)體融合二雜種細(xì)胞的選擇與細(xì)胞雜種