分離科學(xué)---第六章色譜法

1、6.1 6.1 色譜基本理論色譜基本理論定義：定義： 基于物質(zhì)溶解度、蒸汽壓、吸附能力、立體化學(xué)或者離子交換等物理化學(xué)性質(zhì)的微小差異，使其在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同。當(dāng)兩相做相對運(yùn)動時，被分離物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次分配，這樣原來微小的分配差異產(chǎn)生了很大的效果，使各組分分離，從而達(dá)到分離、分析以及測定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。 第六章 色譜法色譜學(xué)基本概念和術(shù)語：色譜學(xué)基本概念和術(shù)語： 色譜的流出曲線色譜的流出曲線 tmABCDEFGhIJ0.5h0.607hLRtRtIJ=2Y=CD=4Y1/2=FG=2.354a)a) 基線基線b)b) 色譜峰色譜峰c) c) 峰高峰高d)d) 區(qū)

2、域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾萫)e) 峰面積峰面積f) f) 保留值保留值g)g) 相對保留值相對保留值 h)h) 柱效柱效i) i) 分離度分離度第六章 色譜法兩個基本特點(diǎn)：兩個基本特點(diǎn)： (1)(1)不同組分分子差速遷移不同組分分子差速遷移 熱力學(xué)熱力學(xué) (2)(2)同種組分分子分布離散同種組分分子分布離散 動力學(xué)動力學(xué)第六章 色譜法色譜過程熱力學(xué)基礎(chǔ)色譜過程熱力學(xué)基礎(chǔ) 兩相分配差異造成差速遷移兩相分配差異造成差速遷移 自發(fā)過程自發(fā)過程-自由能減少自由能減少 判斷依據(jù)判斷依據(jù)-化學(xué)勢化學(xué)勢( (偏摩爾自由能偏摩爾自由能) ) 平衡狀態(tài)平衡狀態(tài)-化學(xué)勢相等化學(xué)勢相等第六章 色譜法色譜體系中溶質(zhì)量很小，一般

3、做稀溶液處理：色譜體系中溶質(zhì)量很小，一般做稀溶液處理：)()CCRTln(00msmsssslnRT0mmmlnRT0mmsslnRTlnRT00第六章 色譜法分配系數(shù)分配系數(shù)K K)RTexp(CCK0ms（1-5） RTGRTKln00（1-6） 000STHGRSRTHK00ln相互作用力差別（焓變）相互作用力差別（焓變）自由度的變化（熵變）自由度的變化（熵變）官能基團(tuán)官能基團(tuán)分子大小和空間排列分子大小和空間排列第六章 色譜法影響分配系數(shù)的因素影響分配系數(shù)的因素: (1) (1)溶質(zhì)溶質(zhì) (2)(2)固定相固定相 (3)(3)流動相流動相 (4)(4)溫度溫度 T T一定、一定、K K為

4、常數(shù)為常數(shù)? ?分配等溫線分配等溫線第六章 色譜法CsCmCsCmCsCmttt三種分配等溫線及其相應(yīng)色譜峰形三種分配等溫線及其相應(yīng)色譜峰形 第六章 色譜法色譜過程動力學(xué)理論基礎(chǔ)色譜過程動力學(xué)理論基礎(chǔ)色譜流出曲線的形狀色譜流出曲線的形狀色譜區(qū)域?qū)挾葦U(kuò)張色譜區(qū)域?qū)挾葦U(kuò)張峰形拖尾峰形拖尾高效能色譜柱系統(tǒng)高效能色譜柱系統(tǒng)峰形預(yù)測峰形預(yù)測重疊峰定量解析重疊峰定量解析選擇最佳分離方法選擇最佳分離方法解釋解釋實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)第六章 色譜法1CsCm2CsCm121CsCm2CsCm12圖1.4 四種色譜類型的流出曲線（1 1）線性理想色譜線性理想色譜。溶質(zhì)的遷移決定于分配系數(shù)，。溶質(zhì)的遷移決定于分配系數(shù)，遷移過程

5、中譜帶形狀不變遷移過程中譜帶形狀不變（2 2）非線性理想色譜非線性理想色譜。譜帶不對稱，呈鮮明的前。譜帶不對稱，呈鮮明的前升或者拖尾升或者拖尾第六章 色譜法1CsCm2CsCm12圖1.4 四種色譜類型的流出曲線（3 3）線性非理想色譜線性非理想色譜。存在分子擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力。存在分子擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力等，溶質(zhì)通過色譜柱后譜帶對稱展寬，呈等，溶質(zhì)通過色譜柱后譜帶對稱展寬，呈GaussianGaussian曲線。大部分色譜過程屬于這種類型曲線。大部分色譜過程屬于這種類型第六章 色譜法1CsCm2CsCm12（4 4）非線性非理想色譜非線性非理想色譜。數(shù)學(xué)處理非常復(fù)雜，做。數(shù)學(xué)處理非常復(fù)雜，做適當(dāng)假設(shè)和

6、簡化后可以部分說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。適當(dāng)假設(shè)和簡化后可以部分說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 色譜動力學(xué)理論發(fā)展：色譜動力學(xué)理論發(fā)展： 根據(jù)溶質(zhì)遷移過程及各種影響因素，列出偏微分方程組，求出描述色譜譜帶運(yùn)動的方程式。 平衡色譜理論（ 1940年Wilson ） 塔板理論（1941年，Martin和Synge） 速率理論（50年代，van Deemter等）第六章 色譜法平衡色譜理論平衡色譜理論 基本假設(shè)：不考慮傳質(zhì)速率的有限性和物質(zhì)的擴(kuò)散對平衡過程的影響。dxc+dcc(c+dc)puqdt=pqdxcpuqdtMobile phaseStationary phaseqdttc=(1-p)qdxdttc第六章 色譜法

7、色譜柱內(nèi)某一小段dx處，其柱截面積為q，p為柱管橫截面上流動相占的分?jǐn)?shù)。則進(jìn)入dx內(nèi)的物質(zhì)量為cpuqdt。由于固定相對組分的吸收，流動相中組分的濃度變?yōu)閏+dc。自小段dx出來的物質(zhì)量為puq(c+dc)dt。小段在相應(yīng)時間內(nèi)物質(zhì)的變化量為dttcpqdxx)(dttaqdxpx)()1 (同理，小段固定相內(nèi)物質(zhì)的變化量為第六章 色譜法 進(jìn)入dx小段內(nèi)流動相中組分的量和從小段中出來的組分量之差，等于小段內(nèi)（包括流動相和固定相兩部分）相應(yīng)時間內(nèi)該組分變化的總量，即：dttaqdxpdttcpqdxcpuqdtpuqdtdccxx)()1 ()()(xxttaptcpxcpu)(1 ()()(第

8、六章 色譜法設(shè)物質(zhì)在兩相間的分配方程為：)(cfa xxtccfta)()()()(1 ()()(cxtaptcpcxxcpu)()( )1 ( )()( )1 ()(txcfppcxtccfpcxtcppu)()(cxtctx第六章 色譜法可以得到區(qū)域中心移動速度 的關(guān)系式： tx)(11cfpputx保留時間等于柱長除以譜帶移動速度，即 )1 ()()1 (1)/(0ktpcfpuLtxLtR第六章 色譜法k定義為容量因子為流動相所占體積與固定相所占體積之比，稱為相比。 )(1cfppkKtcfppttR1)(1100pp1)(cfK 局限性在于沒局限性在于沒能解釋色譜峰能解釋色譜峰展寬的

9、現(xiàn)象。展寬的現(xiàn)象。第六章 色譜法塔板理論塔板理論（1）平衡能夠在一個小段色譜柱（理論塔板）內(nèi)形成，相應(yīng)的色譜柱長稱為理論塔板高度（H）。K為分配系數(shù)。（2）H為常數(shù)，色譜柱內(nèi)塔板數(shù)目為n=L/H。（3）流動相不可以被壓縮。（4）塔板編號依次為0，1，2，3，n，總塔板數(shù)為n+1，實(shí)際上n很大，所以總塔板數(shù)約等于n。第六章 色譜法（5）假定流動相不是采取連續(xù)的方式前進(jìn)，而是跳躍式前進(jìn)。設(shè)q和 p分別是柱的橫截面積和在柱橫截面積中流動相所占據(jù)的截面積分?jǐn)?shù)，那么一個塔板上流動相所占據(jù)的空間體積為Hqp。當(dāng)通過色譜柱的流動相體積為V時，相當(dāng)于流動相在整個柱內(nèi)每個塔板上跳動的次數(shù)為r=V/Hqp。（6）

10、全部樣品開始都集中在第一塊塔板上。（7）分配系數(shù)不隨組分濃度變化，即分配等溫線是線性的。 第六章 色譜法基本關(guān)系式基本關(guān)系式 在塔板上，某一個分子出現(xiàn)在流動相中的概率Pm： 1111/ )1 (11 )1 ()1 (kKppKpKppapHqHqpcHqpcPm第六章 色譜法經(jīng)過r次跳躍后，各塔板上溶質(zhì)的分布可以用二項(xiàng)展開式來描述。rmrrrmmrrnmnrmnrmrmrmrmrrmrrmmPCPPCPPCPPCPPCPCPP 11222110)1 ()1 ( )1 ()1 ()1 ()1 ()!( !nrnrCnr根據(jù)上面的式子可知，經(jīng)過r次跳躍后在第n塊塔板上出現(xiàn)的概率P(r,n)（rn）

11、為：)!( !)1 (),(nrnrPPnrPnrmnm第六章 色譜法如果進(jìn)樣量為m，那么第n號塔板上物質(zhì)出現(xiàn)的量為： )!( !)1 (),(),(nrnrPPmnrPmnrmnrmnm塔板理論的保留值塔板理論的保留值 ),(), 1(maxmaxnrmnrm), 1(),(maxmaxnrmnrm（1-27） maxmax1rnPrnm第六章 色譜法maxrnPm)1 (maxknPnrm)1 ()1 ( )1 ()1 (00maxKVkVkLqpknHqpHqprVR第六章 色譜法塔板理論的色譜流出曲線方程塔板理論的色譜流出曲線方程 當(dāng)二項(xiàng)式分布的n，r很大時，可以用正態(tài)分布函數(shù)來表示：

12、 2max)1(221)21(),(rrnennrP所以 RVVHqprrHqprrmaxmax2)1(221)21(),(RVVnennrP第六章 色譜法r r足夠大時，進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)濃度為：足夠大時，進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)濃度為： 22)1(221)1(221)2( )21(),()(RRVVnRVVnmmenVmenHqpmPHqpPnrmVC22221max)1 (2)2(kpHLqmVmnCR2)1(2max)(RVVneCVC第六章 色譜法當(dāng)V=VR時，流出濃度最大： 影響色譜峰高的因素有：影響色譜峰高的因素有：(1) 進(jìn)樣量m-進(jìn)樣量和色譜峰高成正比；(2) 塔板高度H-H小，柱效率

13、高，Cmax/m大；(3) 色譜柱越細(xì)，q越小，填充越緊密，p越小， Cmax/m越大。在其他參數(shù)不變時， Cmax正比于m/q，因此單位體積柱管進(jìn)樣量大小是衡量柱管負(fù)載的指標(biāo)；(4) 色譜柱越短（L越?。?， Cmax/m越大；(5) k大的組分Cmax/m?。俣℉對所以組分相同）。 第六章 色譜法)1 ()1 ()1 (kqpLHHLkLqknkVnVmR色譜峰區(qū)域?qū)挾扰c溶質(zhì)的保留值成正比。死體積與色譜柱的結(jié)構(gòu)有關(guān)，色譜柱內(nèi)徑大，填充疏松，死體積大，色譜峰區(qū)域?qū)挾却蟆ＩV峰區(qū)域?qū)挾扰c柱長的平方根成正比。色譜峰區(qū)域?qū)挾扰c塔板高度的平方根成正比，即色譜柱柱效越高，H越小，色譜峰區(qū)域?qū)挾仍叫　?

14、第六章 色譜法（1）不能解釋不同流動相流速下同一溶質(zhì)將給出不同的理論塔板數(shù)。（2）沒有闡明理論塔板數(shù)和塔板高度的色譜含義和實(shí)質(zhì)。（3）沒有深入討論影響塔板高度的因素，因而對色譜體系的設(shè)計(jì)、色譜操作條件的選擇的指導(dǎo)意義十分有限。 第六章 色譜法速率理論速率理論 運(yùn)用流體分子規(guī)律研究色譜分離這種運(yùn)用流體分子規(guī)律研究色譜分離這種“非非平衡平衡”過程。過程。 隨機(jī)過程總是導(dǎo)致隨機(jī)過程總是導(dǎo)致GaussianGaussian分布分布 2 2-溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)離散的度量，與柱長溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)離散的度量，與柱長成正比：成正比： HL2LH2第六章 色譜法 色譜過程總的色譜區(qū)帶擴(kuò)張等于各個獨(dú)立色譜過程總的色譜區(qū)

15、帶擴(kuò)張等于各個獨(dú)立因素引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張的和，即各獨(dú)立離散因素引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張的和，即各獨(dú)立離散項(xiàng)具有加和性：項(xiàng)具有加和性： niini122222212niniiiniiHLLH11212第六章 色譜法（1 1）渦流擴(kuò)散；）渦流擴(kuò)散；（2 2）縱向分子擴(kuò)散；）縱向分子擴(kuò)散；（3 3）傳質(zhì)，包括流動相傳質(zhì)和固定相傳質(zhì)。）傳質(zhì)，包括流動相傳質(zhì)和固定相傳質(zhì)。uCCuBACuuBAHsm)(第六章 色譜法填充柱氣相色譜速率方程填充柱氣相色譜速率方程uDkdqkDdkkuDdHsfmpmp22222)1 ()1 (01. 022液相色譜速率方程液相色譜速率方程 smsmdeHHHHHHuDdkkuDdk

16、qkuDduDdmpsfmpmp222222)1)(1 (30)1 ()1 (22第六章 色譜法6.2 6.2 高分辨氣相色譜高分辨氣相色譜 (毛細(xì)管柱氣相色譜）概述概述 1956年，Goly認(rèn)為填充柱可以看成是一束涂有固定液的毛細(xì)管。他認(rèn)為用中空的開管柱，將固定液涂漬在其內(nèi)壁，從而克服路徑差異。并從理論上推斷，柱效達(dá)到填充柱的上百倍甚至更高。因此出現(xiàn)了開管柱氣相色譜的概念。第六章 色譜法開管柱氣相色譜速率方程開管柱氣相色譜速率方程 1958年，基于Van Deemter方程，Goly提出了影響開管柱色譜峰擴(kuò)張的因素：第六章 色譜法uDdkkukkkDruDHlfgg22222)1 (32)1

17、 (1161242與填充柱的速率方程相比：與填充柱的速率方程相比：（1）開管柱只有一個氣體流路，沒有渦流擴(kuò)散項(xiàng)（多徑項(xiàng)），即 A0 。（2）分子擴(kuò)散項(xiàng)和填充柱相似，但是沒有分子擴(kuò)散路徑彎曲，其路徑彎曲因子1 。（3）傳質(zhì)項(xiàng)和填充柱相似，但是以柱內(nèi)徑r代替載體粒徑dp，而且Cl一般比填充柱小，氣相傳質(zhì)阻力常常是色譜峰擴(kuò)張的主要因素。 第六章 色譜法影響開管柱柱效的因素：影響開管柱柱效的因素：（1 1）流動相及其線速度）流動相及其線速度HHminH2uHuoptH1H3圖1 開管柱板高隨流動相線速度的變化曲線 第六章 色譜法和填充柱相似，同樣有最小板高和最佳流速，分別為： 22min)1 (311

18、612kkkrBCHg221161)1 (34kkkrDCBuggopt（8）（9）第六章 色譜法 當(dāng)uuopt時，因?yàn)殚_管柱液膜厚度小，液相傳質(zhì)阻力小，開管柱的板高隨流速的上升斜率小于填充柱。比填充柱更適合于快速分析。H(mm)Open tubular columnu(cm/s)Packed column1010202030填充柱和開管柱板高隨流動相線速度的變化曲線第六章 色譜法（2 2）柱內(nèi)徑）柱內(nèi)徑 最小板高和柱內(nèi)徑成正比，因此應(yīng)該盡可能使用小內(nèi)徑的柱子。 實(shí)際應(yīng)用中一般大于0.25mm，因?yàn)樘?xì)的柱子固定液涂漬操作不便，柱子滲透性差，柱容量低。 柱內(nèi)徑選擇要兼顧柱效和分析速度以及柱容量

19、。22min)1 (311612kkkrBCHg第六章 色譜法（3 3）液膜厚度）液膜厚度 液膜厚度dl是開管柱的重要參數(shù)。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)和dl2成正比。因此降低液膜厚度是提高柱效的重要方法。 但是dl降低，柱容量降低，對進(jìn)樣和檢測系統(tǒng)提出了更高的要求。液膜厚度過大，穩(wěn)定性下降，因此要兼顧柱效、柱容量和穩(wěn)定性來選擇液膜厚度。 一般WCOT柱dl在0.11m之間，SCOT柱dl在0.82m之間，填充柱dl達(dá)10m。 第六章 色譜法（4 4）相比）相比 2222)1 ()11 (KRkRN 同一種固定液開管柱的相比要比填充柱大得多，因此要達(dá)到相同的分離度，所需要的理論塔板數(shù)要大得多。 同理，當(dāng)柱

20、子內(nèi)徑增加時，相比也增大，因此要得到相同的分離度，柱子長度也要相應(yīng)增加。第六章 色譜法3 3 開管柱的制備開管柱的制備（1 1）柱材料）柱材料（a）表面惰性化，不參與保留或吸附被分離組分；（b）表面改性以確保固定液能夠均勻涂漬。 第六章 色譜法金屬材料金屬材料：銅、鎳、不銹鋼等，早期應(yīng)用，價格貴，表面活性大，高溫下催化樣品塑料塑料：早期應(yīng)用，不耐高溫玻璃玻璃：表面性質(zhì)優(yōu)于金屬材料，實(shí)驗(yàn)室易于拉制，價格便宜，70年代后應(yīng)用較多石英石英：性能最好，應(yīng)用最多，商品化，80年代開始取代玻璃稱為主要材料第六章 色譜法（2 2） 開管柱的表面特性開管柱的表面特性 超純石英的融凝硅石（99.9999%SiO

21、2）只含有小于1ppm的硅醇基和金屬氧化物，具有很好的表面惰性和穩(wěn)定性，不必經(jīng)過處理或者鈍化就能涂漬固定液。 然而一般純度不高的石英含有1801200ppm的硅醇基和金屬氧化物雜質(zhì)，涂漬前也需要進(jìn)行表面處理。 第六章 色譜法（3 3）開管柱內(nèi)表面處理）開管柱內(nèi)表面處理目的： 1）除去表面活性點(diǎn)，使表面能分布均勻； 2）改變表面的物理化學(xué)性質(zhì)，提高表面潤濕性。 3）增加表面積，提高固定液的涂漬量。第六章 色譜法 這些目標(biāo)很難同時實(shí)現(xiàn)。當(dāng)表面去活后，原來的高能表面變成低能表面，對于大多數(shù)非極性固定液的涂漬不存在問題。 對于中等極性的固定液，要求表面去活而又需要保持一定的表面能，常遇到一些困難。 對

22、于高極性的固定液，趨向于形成自己的去活層或者塊狀活性點(diǎn)，不進(jìn)行表面處理也可以進(jìn)行涂漬。 因此，對于不同極性的固定液，表面處理的方法也應(yīng)該不相同。第六章 色譜法表面粗糙化處理表面粗糙化處理 增加表面積來提高潤濕性。 因?yàn)楸砻嫔辖缑骈g的作用力可以消耗液滴的內(nèi)聚力，液滴下被粗糙化的表面積越大，總的作用力越大，消耗的內(nèi)聚力越大，從而減少液滴在該表面上的接觸角而鋪展開來。 另外，增大表面積還可以增大涂漬量從而增大柱容量。 第六章 色譜法柱壁粗糙化方法一般采用：柱壁粗糙化方法一般采用：1） 表面腐蝕： 腐蝕一般用氯化氫氣體（氯化鈉加濃硫酸產(chǎn)生）以靜態(tài)或者動態(tài)的方法進(jìn)行，使之形成規(guī)則排列的氯化鈉晶體粗糙層。

23、靜態(tài)法：柱子充滿氯化氫氣體，兩端用微型噴燈封死，在300-400C約312小時。形成的顆粒均勻。動態(tài)法則讓氯化氫連續(xù)不斷通過柱子。 腐蝕法不適合石英毛細(xì)管柱，因?yàn)楦g后柱壁變薄，容易脆斷。第六章 色譜法2） 沉積惰性微粒。 從溶液中沉積一層薄而均勻的微顆粒物質(zhì)。如采用動態(tài)涂漬法將含有三氯乙烷的飽和NaCl的甲醇飽和溶液通過柱子，可以形成致密的氯化鈉晶體層，去活后可涂漬極性和中等極性固定液；將二氧化硅的分散懸浮溶液通過柱子，然后揮發(fā)去溶劑可以沉積 SiO2粉末涂層，經(jīng)此方法涂漬的柱子可以涂漬極性較大的固定液。第六章 色譜法表面惰化處理表面惰化處理 表面粗糙化可以改善柱子的浸潤性，但也使活性增大。

24、如果不能有效去活，對于涂漬非極性和中等極性固定液的柱子將會造成嚴(yán)重吸附。 通常硅醇基團(tuán)的去活比金屬雜質(zhì)造成的Lewis酸點(diǎn)的去活要容易。第六章 色譜法1） 表面羥基化涂漬極性柱 石英柱因?yàn)樵诟邷叵吕?，表面羥基很少。因此水熱處理以獲取豐富得表面羥基對涂漬極性柱非常重要。很多人提出用鹽酸或者硝酸來處理柱子，其中20%的硝酸在200C處理，隨后硅烷化處理可以得到最好的去活效果。 對于玻璃柱可以用不同濃度的鹽酸進(jìn)行瀝濾處理。第六章 色譜法2） 去活（惰化） 有效的去活作用取決于石英的特性、固定液和被分析樣品的種類以及表面粗糙化的方法等諸多因素，沒有通用的去活方法。（a）早期,在表面預(yù)涂上一層表面活性

25、劑薄膜，利用其極性端與柱表面活性點(diǎn)作用使之惰化，另一非極性端朝向固定相使其表面張力下降，從而改善潤濕性。 缺點(diǎn)去活難以完全，難重復(fù)，熱穩(wěn)定性有限。第六章 色譜法（b）用有機(jī)化合物的高溫下熱解產(chǎn)物與硅羥基反應(yīng)也能夠有效地掩蔽活性點(diǎn)。例如經(jīng)過280C 熱處理，聚乙二醇在表面形成非萃取的分子層。（c）更廣泛的應(yīng)用方法是各種硅烷化方法，它是消除表面羥基最有效的方法。 硅烷化試劑主要有三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基二氯硅烷、三苯基氯硅烷等，完全硅烷化反應(yīng)需要300-400C高溫。SiOHSiOHSiOSi(CH3)3Si(CH3)3SiO+(CH3)3SiCl第六章 色譜法（4 4） 固定液固定液

26、 固定液決定了對被分離物質(zhì)的選擇性能力，這和固定液的組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)。要求: 組成明確 不含容易引起試樣催化分解的活性雜質(zhì) 易于涂漬 熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性好第六章 色譜法聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG，又名，又名CarbowaxCarbowax） 包括不同分子量的聚乙二醇，改性聚乙二醇、聚乙二醇與不同的酸反應(yīng)得到的脂等，廣泛應(yīng)用于膽甾醇脂、脂肪酸甲脂、精油等多種極性化合物的分析。 主要問題是化學(xué)穩(wěn)定性差，最高使用溫度低（2的條件下測定，常用的物質(zhì)有萘、十二烷等。 第六章 色譜法（2 2）涂漬效率（）涂漬效率（coating efficiency, CEcoating efficiency, C

27、E） 涂漬效率是在最佳條件下理論和實(shí)測的塔板高度之比，用百分?jǐn)?shù)表示： %100實(shí)測理論HHCE（13）其中H理論即Hmin由下式計(jì)算得到： 22min)1 (31161kkkrH（14）第六章 色譜法 涂漬效率高，說明柱子的理論利用效率高。 用它來評價柱效的優(yōu)點(diǎn)是和柱子長度無關(guān)，而且包括了組分容量比和柱子直徑等參數(shù)，可用于柱子間質(zhì)量的直接比較。 一般較好的柱子涂漬效率在80%100%之間。涂漬效率計(jì)算不適用于PLOT柱和須狀表面柱。 第六章 色譜法（3 3）惰性）惰性 色譜柱的惰性好壞直接影響柱子的柱效、柱內(nèi)液膜的穩(wěn)定性以及對組分的有效分離和檢測。 活性與柱子材料、處理方法、固定相極性、柱內(nèi)載

28、體材料、液膜厚度等有關(guān)。 活性主要指的是吸附活性和催化活性。其中吸附活性又可表現(xiàn)為可逆吸附和不可逆吸附兩種。 第六章 色譜法 柱子的活性會導(dǎo)致：（1）峰展寬；（2）峰型拖尾；（3）峰面積或者峰高減小甚至消失；（4）峰面積變化不大但是保留值顯著增加。 第六章 色譜法 吸附作用大致分為三種：（1）極性組分與柱子內(nèi)壁硅羥基或者硅氧烷橋之間的氫健相互作用；（2）與氫健作用無關(guān)但是機(jī)理不清楚的吸附作用；（3）存在于玻璃或者載體內(nèi)金屬氧化物所表現(xiàn)出來的酸堿活性引起的吸附，這類活性點(diǎn)在高溫時也會產(chǎn)生對試樣催化作用。第六章 色譜法Grob提出了評價毛細(xì)管柱綜合性能的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法：濃的Grob實(shí)驗(yàn)混合物的組成

29、實(shí)驗(yàn)縮寫20mL正己烷溶劑中物質(zhì) 所溶解的量（mg）甲基癸酸脂E10242甲基十一酸脂E11236甲基十二酸脂E12230癸烷C10172十一烷C11174十二烷*C12 辛醇-1ol222壬醛al2502，3-丁二醇*D (diol)3802，6-二甲苯胺A2052，6-二甲苯酚P194二環(huán)己基胺am2042-乙基己酸S242* 2，3-丁二醇溶于氯仿；*代替十一烷以減少在極性固定相中峰重疊的可能性。（取各種所需物質(zhì)1mL混合, 稀釋至200倍）第六章 色譜法辛醇-1和2，3-丁二醇用來檢測第一類氫健吸附;壬醛用來檢測第二類吸附;第三類吸附用AP實(shí)驗(yàn)來測定，即將含有AP的混合樣進(jìn)樣，根據(jù)二者

30、的峰高或者峰面積的比值來表征柱子的酸性、堿性或者中性。即A/P1為堿性，A/P1為酸性，A/P=1為中性。 如果在接近中性的柱子上，A和P的峰高都沒有達(dá)到理論值的100%，但是二者的峰面積比接近1。實(shí)際上這類柱子即具有酸性也具有堿性，這種情況下無法判斷這類柱子適合酸分析還是堿分析。此時應(yīng)該用空間位阻大的am（二環(huán)己基胺）和S（2-乙基己酸）進(jìn)行更加嚴(yán)格的酸堿測試。因?yàn)檫@一對混合物可以避免氫健型吸附對峰值的影響，所得結(jié)果只反映酸堿性吸附。 第六章 色譜法GrobGrob方法的優(yōu)點(diǎn)：方法的優(yōu)點(diǎn)：一次實(shí)驗(yàn)可以同時取得反映柱子性能的多個方面內(nèi)容，即分離效率、吸附活性、酸堿度以及固定液液膜厚度等因素。適

31、用于不同類型和不同極性固定液柱子的性能評價。條件標(biāo)準(zhǔn)化所得結(jié)果可以直接進(jìn)行比較。包括了某些定量概念。第六章 色譜法Grob實(shí)驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)條件：柱長（m）H2做載氣時甲烷流出時間（s）升溫速率（C/min）N2做載氣時甲烷流出時間（s）升溫速率（C/min）10205.0352.515303.3531.6520402.5701.2530601.671050.8440801.251400.63501001.01750.5第六章 色譜法Grob標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的步驟： 柱溫開始溫度小于40C。 通過甲烷的流出時間測定載氣流速和合適的分流比，使儀器的死時間誤差調(diào)整到表中所示的標(biāo)準(zhǔn)時間的 5以內(nèi)。 按表2

32、-2設(shè)定升溫速率。 進(jìn)混合物樣，使每個樣品組分的量約為2.0ng。 進(jìn)樣后迅速將爐溫升至40C，然后開始程序升溫直至達(dá)到終溫。 記錄混合試樣中各組分的峰高和相應(yīng)流出時間以及流出溫度。 第六章 色譜法 將不被吸附的兩種烷烴和三種脂肪酸脂的峰頂點(diǎn)相連畫成一條100%的線，如圖所示。柱子的活性以未達(dá)到100%連線的余下各峰的高度占基線于100%線間距離的百分?jǐn)?shù)來表示。由此計(jì)算出各組分的損失量，可以定量測出不可逆吸附，也為柱子對各種樣品分析的適用性提供有用信息。 DC10C11 olalamE10E11E12AP30%86%77%88%97%97%吸附活性定量測試圖（虛線為100%線）第六章 色譜法G

33、rob標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)中需注意的問題： 不能用于測定高熔點(diǎn)固定相的柱子。 對于一個新的固定相，需要標(biāo)樣對每個峰定性，確定流出順序。 傾向于測定吸附活性，對催化活性觀察不到。一般柱子活性是溫度的函數(shù)，低溫時以吸附活性為住，高溫時催化活性逐漸增大并成為主導(dǎo)。 第六章 色譜法（4 4）熱穩(wěn)定性）熱穩(wěn)定性 毛細(xì)管柱常采用程序升溫方法和結(jié)合GC/MS等聯(lián)用技術(shù)，要求固定液涂漬毛細(xì)管柱具有良好的熱穩(wěn)定性。 影響柱子的穩(wěn)定性的因素主要有兩方面：一是固定液本身的熱穩(wěn)定性；二是柱表面對固定液的催化作用。第六章 色譜法(1) 柱子的熱穩(wěn)定性通?？梢栽诔绦蛏郎貤l件下以基線的漂移量來測量。程序升溫的最終溫度根據(jù)各類固定液的最

34、高使用溫度和制柱技術(shù)不同而確定。為了避免檢測器污染，一般應(yīng)該比最高溫度低2030C(2) 考察柱子的熱穩(wěn)定性還可以采用高溫使用后測定下列參數(shù)的變化率：a) 組分的容量因子 （固定液分解程度）。b) 每米柱長理論塔板數(shù)（液膜均勻性是否破壞）。c) Grob試樣中組分的保留情況（檢查固定液和去活層是否化學(xué)變化）。 第六章 色譜法固定液的極性固定液的極性 1966年由Rohrschneider提出，后由McReynolds做了修正的“相特征參數(shù)”是氣液色譜中研究被分析物分子和固定相分子之間相互作用力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它反映了固定液對各種類型化合物的分離選擇性，也代表了固定液的平均極性，是至今公認(rèn)的評價

35、和分類固定液和針對分析任務(wù)有效選擇固定液的一個好方法。 第六章 色譜法它規(guī)定五種溶質(zhì)在極性固定液和非極性固定液上保留指數(shù)的差值，來作為評價固定液選擇性和極性的量度，即： 苯 正丁醇 戊酮-2 硝基丙烷 吡啶111SPIIIX222SPIIIY333SPIIIZ444SPIIIU555SPIIIS第六章 色譜法 其中Ip是相應(yīng)溶質(zhì)在極性固定液上的保留指數(shù)，Is是該溶質(zhì)在非極性固定相角鯊?fù)樯系谋Ａ糁笖?shù)。 保留指數(shù)是由Kovats提出的，他把某組分的保留值用兩個靠近它的的正構(gòu)烷烴來標(biāo)定。定義正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為該分子碳原子數(shù)的100倍，某一組分的保留指數(shù)為： )()()()(loglogloglog

36、100ZRnZRZRxRttttnZI（15） 、 、 分別代表被測組分和具有Z和Z+n個碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時間，n可以是1、2、3。)(xRt)(ZRt)(nZRt第六章 色譜法XYZUS常數(shù)化合物結(jié)構(gòu)特征相互作用力特征代表性化合物易極化，電子給予體化合物色散力，并具有較弱的質(zhì)子接受能力芳烴、烯烴含羥基、質(zhì)子給予體形成氫健的化合物既具有質(zhì)子給予體又有接受質(zhì)子能力的定向力醇、腈、鹵化物含羰基，定向偶極質(zhì)子接受體化合物只具有質(zhì)子接受能力的定向力酮、脂、醛、醚、環(huán)氧化物、二甲胺衍生物含強(qiáng)極性基團(tuán)電子接受體化合物偶極定向力硝基化合物、腈類衍生物質(zhì)子接受體化合物具有強(qiáng)的質(zhì)子接受能力的弱偶極定

37、向力芳香類堿McReynolds常數(shù)表征的分離選擇性苯正丁醇戊酮-2 硝基丙烷吡啶第六章 色譜法儀器系統(tǒng)儀器系統(tǒng)氣路系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，溫控系統(tǒng)，檢測器，數(shù)據(jù)收集和處理系統(tǒng)。 穩(wěn)壓閥壓力表注射器記錄儀模數(shù)轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)系統(tǒng)色譜柱穩(wěn)流閥燃燒氣尾吹氣調(diào)節(jié)閥進(jìn)樣器檢測器減壓閥高壓氣源凈化管分流閥柱箱毛細(xì)管柱氣相色譜儀基本流程 第六章 色譜法（1 1）氣路系統(tǒng)）氣路系統(tǒng) 氣路系統(tǒng)要求能夠提供穩(wěn)定的流速和純的載氣（1%精度）。因?yàn)榱魉賹Ψ蛛x影響很大，載氣雜質(zhì)會影響分離或者破壞固定液膜。氣路不得漏氣。 與填充柱不同：（a）毛細(xì)管柱進(jìn)柱前有一個分流氣路，目的：控制進(jìn)入柱子內(nèi)的樣品量，提供大量溶劑放空以避免柱子過載。

38、第六章 色譜法（b）柱后進(jìn)檢測器前有一個尾吹氣路，以減小柱出口至檢測器之間過渡管線以及接頭區(qū)的死空間，防止分離后組分堆積和重新混合造成的不利影響。并使單位時間內(nèi)進(jìn)入檢測器的樣品量增多，提高靈敏度。尾吹氣過小，組分到達(dá)檢測器的時間長，增加譜帶擴(kuò)寬；尾吹氣過大，柱出口端阻力增大，延長了組分在柱子內(nèi)的停留時間，使柱子內(nèi)組分譜帶擴(kuò)寬，同樣會影響分離效能和檢測靈敏度。第六章 色譜法（2 2）進(jìn)樣系統(tǒng)）進(jìn)樣系統(tǒng) 分流進(jìn)樣將樣品在汽化室內(nèi)汽化并和載氣均勻混合，然后分成兩個部分，一小部分進(jìn)入色譜柱，大部分通過放空管線放空。這兩部分比例稱為分流比。調(diào)節(jié)放空管線的氣阻或者放空氣閥可以控制分流比。根據(jù)兩個流路的載氣

39、流速可以測定分流比，其變化范圍很大，從1：10到1：500乃至更大。 分流進(jìn)樣器要保持恒定進(jìn)樣溫度，保證樣品汽化和均勻混合，實(shí)現(xiàn)線性分流，即樣品中各組分都被準(zhǔn)確分成相同比例，而與其化學(xué)物理性質(zhì)和濃度無關(guān)。第六章 色譜法 對稀溶液中痕量組分的測定可以采用不分流進(jìn)樣，關(guān)鍵是設(shè)法排除大量溶劑對微量組分的干擾。 對一些熱和化學(xué)穩(wěn)定性差的樣品，如生物樣品，可以用冷柱頭進(jìn)樣，即直接將樣品送到柱子頂端而沒有隔膜，沒有樣品分流、沒有樣品瞬間激烈蒸發(fā)過程的“冷”進(jìn)樣方式。操作條件必須嚴(yán)格控制，否則大量樣品的注入容易引起柱子失效。 對于一些微量或者痕量易揮發(fā)物質(zhì)的分析（如血樣、環(huán)境土樣等），可以采用頂空進(jìn)樣方式，

40、即氣態(tài)進(jìn)樣，從而可以避免大量樣品基體對柱子系統(tǒng)的影響，也便于自動化。第六章 色譜法（3 3）溫控系統(tǒng)）溫控系統(tǒng) 溫度變化1C，保留時間變化5%左右，因此要求控溫盡可能好。 要求升溫和降溫的速度快，控溫精度高（0.1 C），保溫性能好，柱箱內(nèi)溫度分布均勻。目前國內(nèi)外多采用空氣浴雙腔式風(fēng)道結(jié)構(gòu)，用大功率電阻絲加熱，可控硅控溫。 采用數(shù)控技術(shù)，提供多階升溫程序，升溫速率可在0.140C/min范圍，柱溫調(diào)節(jié)穩(wěn)定性可達(dá) 0.1 C。第六章 色譜法（4 4）檢測器）檢測器 能夠用于氣相色譜的檢測器有十多種，但是適用于毛細(xì)管氣相色譜的有：u 氫火焰離子化檢測器（FID）u 電子捕獲檢測器（ECD）u 火焰

41、光度檢測器（FPD）u 熱離子化檢測器（TID） 檢測器分為濃度型（檢測器分為濃度型（ECDECD）和質(zhì)量型（）和質(zhì)量型（FIDFID、FPDFPD、TIDTID），濃度型），濃度型響應(yīng)信號和樣品進(jìn)入檢測器的濃度成正比，峰高不隨載氣流速變化而變響應(yīng)信號和樣品進(jìn)入檢測器的濃度成正比，峰高不隨載氣流速變化而變化，但是峰面積會受影響；質(zhì)量型信號和進(jìn)入檢測器的樣品的物質(zhì)的量化，但是峰面積會受影響；質(zhì)量型信號和進(jìn)入檢測器的樣品的物質(zhì)的量有關(guān)，載氣流速影響峰高，但是不影響峰面積。有關(guān)，載氣流速影響峰高，但是不影響峰面積。 第六章 色譜法檢測器的基本性能參數(shù)有：檢測器的基本性能參數(shù)有：靈敏度靈敏度：信號值隨

42、樣品組分濃度或者質(zhì)量的變化率。即以信號值對被測組分量作圖，得到以通過原點(diǎn)的直線，斜率即為靈敏度。敏感度敏感度：儀器靈敏度高，噪音也隨之增大，使微量組分的信號仍難以辨認(rèn)。因此性能好的檢測器不僅要求靈敏度高，還要求噪音小。定義敏感度為檢測器給出信號等于兩倍噪音時所需進(jìn)入檢測器的組分量。 實(shí)際測定的樣品敏感度和檢測器的最小檢測量以及色譜柱的性能和實(shí)際測定的樣品敏感度和檢測器的最小檢測量以及色譜柱的性能和操作條件有關(guān)。毛細(xì)管氣相色譜的敏感度接近儀器的最小檢測量。操作條件有關(guān)。毛細(xì)管氣相色譜的敏感度接近儀器的最小檢測量。第六章 色譜法線性范圍：線性范圍： 信號值隨樣品量變化呈成直線部分所對應(yīng)的最大量和最

43、小量之比。毛細(xì)管柱因柱容量小，通常其工作范圍小于檢測器本身的線性范圍。響應(yīng)時間和死體積：響應(yīng)時間和死體積： 響應(yīng)時間要求快，死體積小穩(wěn)定性：穩(wěn)定性： 檢測器對所分析的組分必須表現(xiàn)化學(xué)惰性，特別是極性組分在檢測器內(nèi)不被催化分解或者吸附，這在痕量分析中尤為重要。第六章 色譜法氫火焰離子化檢測器（氫火焰離子化檢測器（FIDFID） 工作原理工作原理：氫氣在空氣中燃燒的火焰作為能源，載氣和氫氣從噴嘴進(jìn)入檢測器，助燃空氣從四周導(dǎo)入，當(dāng)分離后的有機(jī)物組分隨載氣進(jìn)入火焰時被解離成正負(fù)離子，在電場作用下各自向相反的電極移動形成電流。 特點(diǎn)特點(diǎn)：靈敏度高，基流小，死體積?。?0分析速度慢快檢測限隨峰形變化很少變

44、化進(jìn)樣速度快不必很快具體隨進(jìn)樣方式而定固定相選擇能廣泛選擇選擇范圍有限盡量選用交聯(lián)鍵合固定相載氣純度不嚴(yán)格要求純度高流速控制只需恒壓必須恒流毛細(xì)管氣相色譜程序升溫和恒溫的比較第六章 色譜法 載氣的程序升流，也稱壓力程升，由Lipsky提出，通過改變柱入口壓力，使柱內(nèi)載氣的平均流量隨時間變化，這種變化可以是線性的，可以是指數(shù)曲線增加的。 程序升流是改變分離條件的很方便的方法，對寬沸程混合物的分析時間更短，而且可以在較低柱溫下工作，大大減少柱流失。第六章 色譜法 和程序升溫相比，更適合分離熱不穩(wěn)定化合物，還可以得到更為穩(wěn)定的基線和延長柱子的壽命。因?yàn)楣潭ㄏ嗟恼舭l(fā)速率與流量只呈線性關(guān)系，而與溫度卻呈

45、指數(shù)關(guān)系變化。 在程序升流操作中，柱內(nèi)壓力變化很快恢復(fù)至儀器初始狀態(tài)，能夠提高單位時間內(nèi)的分析次數(shù)。 缺點(diǎn)是對后流出峰柱效下降，當(dāng)采用氫氣或者氦氣時柱效降低不明顯。對于流速敏感的檢測器（TCD、FPT）難于校正。第六章 色譜法 程序升流中參數(shù)的選擇主要考慮分離能力和分析時間兩方面。 對于一般長度為1525米的毛細(xì)管，程序升流范圍大約在0.110ml/min較為合適。 為了使毛細(xì)管柱獲得最大分離能力，也可以同時采用程序升溫和程序升流。第六章 色譜法 4 4、進(jìn)樣量、進(jìn)樣量 進(jìn)樣量不得超過最大進(jìn)樣量。最大進(jìn)樣量又稱為樣品容量，定義為柱效下降10%時的進(jìn)樣量，與固定液量有關(guān)。進(jìn)樣量超過柱子容量后柱效

46、會下降。 第六章 色譜法 毛細(xì)管氣相色譜的應(yīng)用毛細(xì)管氣相色譜的應(yīng)用（1）環(huán)境污染物分析：大氣、水樣、農(nóng)藥殘留、土壤與食品、香煙煙氣、（2） 石油化工與地質(zhì)（3）生物、醫(yī)學(xué)：昆蟲信息素、微生物（脂肪酸）、臨床（氨基酸、糖、有機(jī)酸、甾體激素等）、藥物分析（4）天然產(chǎn)物：香料、精油、中草藥、（5）食品釀酒：風(fēng)味與香氣、肉質(zhì)、水果蔬菜、飲料等第六章 色譜法第六章 色譜法第六章 色譜法第六章 色譜法第六章 色譜法6.3 6.3 高效液相色譜高效液相色譜特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）采用數(shù)m微球填料，傳質(zhì)快，柱效高；（2）封閉式可重復(fù)使用上百次、數(shù)千次的色譜柱；（3）高壓輸液泵，快速；高精度連續(xù)操作儀器化，定性定量分

47、析準(zhǔn)確度高；（4）流動相影響組分的分配，有限的幾種和幾十種固定相就可以解決相當(dāng)大范圍的問題； （5）樣品回收容易而且是定量的，有利于制備；（6）柱外效應(yīng)對柱效的影響特別嚴(yán)重。第六章 色譜法1 1 固定相和流動相固定相和流動相（1 1）固定相）固定相按照承受壓力來分： 剛性固體剛性固體硅膠等，耐高壓，表面可鍵合各種功能團(tuán) 硬膠硬膠聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，承壓能力低，主要用于離子交換和尺寸排阻色譜第六章 色譜法（2 2）流動相）流動相 純度高 粘度低 化學(xué)穩(wěn)定性好 沸點(diǎn)高于55C 溶劑要完全浸潤固定相 與檢測器匹配 混合溶劑要考慮互溶性從有機(jī)溶劑到水溶液，既可以是純?nèi)軇?，也可以是二元或多元?/p>

48、合溶劑。第六章 色譜法根據(jù)分子作用力的情況，溶劑一般分為八類： 脂肪醚，純質(zhì)子接受體； 脂肪醇，質(zhì)子接受-給予體； 吡啶衍生物，四氫呋喃，質(zhì)子接受體，易極化； 乙二醇、芐醇、乙酸、甲酰胺，質(zhì)子給予體； 二氯甲烷、二氯乙烷，大偶極鉅； 脂肪酮、脂、二氧六環(huán)； 芳烴、芳醚、硝基甲烷 氟代醇、氯仿、水，質(zhì)子給體 為了使混合溶劑的選擇性差別盡可能大，應(yīng)選用不同類為了使混合溶劑的選擇性差別盡可能大，應(yīng)選用不同類型混合的混合溶劑。型混合的混合溶劑。第六章 色譜法2 2 各種各種HPLCHPLC方法方法q正相色譜q反相色譜 q液-固吸附色譜q液-液分配色譜q離子交換色譜q大小排阻色譜q親和色譜q第六章 色譜

49、法反相色譜應(yīng)用最廣泛：反相色譜應(yīng)用最廣泛：u在水中可以加入各種添加劑，改變流動相的離子強(qiáng)度、pH和極性等，以提高選擇性。u水的截止波長低，有利于痕量組分的檢測。u反相鍵合相穩(wěn)定，不易被強(qiáng)極性組分污染。u利用二次化學(xué)平衡，可以使不能直接用反相色譜分離的組分用反相色譜分離，例如離子對色譜離子對色譜。第六章 色譜法反相色譜反相色譜分離機(jī)理分離機(jī)理: : 疏溶劑理論疏溶劑理論：當(dāng)一個非極性分子或者溶質(zhì)分子中的非極性部分和極性溶劑接觸時，相互產(chǎn)生斥力，自由能增加，分子中非極性部分的取向?qū)е氯軇┲行纬梢粋€空腔?？涨坏男纬珊兔娣e大小與溶劑性質(zhì)（表面張力、介電常數(shù)等）以及溶質(zhì)的表面積和偶極鉅有關(guān)。 第六章 色

50、譜法 溶質(zhì)保留影響因素：溶質(zhì)保留影響因素：（1）溶質(zhì)分子中非極性部分的總面積；（2）鍵合相上的非極性部分的總面積；（3）流動相表面張力增大，洗脫能力變?nèi)酰唬?）鹽加入，增加表面張力，減少溶質(zhì)分子間的靜電斥力。對于非極性溶質(zhì)，鹽濃度增加，表面張力增大，保留增大；對于極性溶質(zhì)，隨鹽濃度增大減小。 （5）緩沖溶液pH（6）溫度第六章 色譜法（1 1）反相離子對色譜）反相離子對色譜 實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)極性電離型化合物的反相色譜分離。 羧酸、磺酸、胺、季胺鹽、氨基酸、多肽、核酸及其衍生物、各種藥物、染料的分離分析orgKaqaqYXYXXY)()()( aqaqorgXYYXYXK)()()(第六章 色譜法分配系

51、數(shù)為： aqXYaqorgRPYKXYXD)()()(msaqXYmsRPRPVVYKVVDk)(分配比（分配容量、容量因子）為： 第六章 色譜法 加入有機(jī)溶劑可使親脂性離子對穩(wěn)定性提高： orgnKaqaqaqSYXSnYXS)()()()(naqaqaqorgnSSYXSYXK)()()()(msnaqaqSmsRPSVVSYKVVDk)()( 假設(shè)只有溶劑化離子對存在于固定相中： 選擇合適的有機(jī)溶劑能夠獲得高平衡常數(shù)KS，將提高溶質(zhì)的分配容量和分離選擇性。 第六章 色譜法影響離子對色譜保留的因素： pH 離子對試劑的性質(zhì)（鏈長）和濃度 有機(jī)溶劑 離子強(qiáng)度影響離子強(qiáng)度的增加，離子對的保留值

52、下降，而中性溶質(zhì)的保留值趨于上升。 金屬離子 溫度第六章 色譜法（2 2）尺寸排阻色譜）尺寸排阻色譜 一般說來，在生物化學(xué)領(lǐng)域常用水溶性溶劑，稱為凝膠過濾色譜（Gel filtration）；在合成高分子化學(xué)領(lǐng)域，采用有機(jī)溶劑較多，常稱為凝膠滲透色譜（GPC，Gel permeation chromatography）。實(shí)際應(yīng)用中，常用的名稱是尺寸排阻色譜（SEC，Size exclusion chromatography）和凝膠滲透色譜。 第六章 色譜法VsVGVmSSaGPCVVKSGPCmSameVKVVVVK KGPCGPC：0101第六章 色譜法 對于一定的凝膠填料，它能夠分離的分子

53、大小有一定的范圍，超過上限的大分子全部被排除，低于下限的小分子都能夠滲透進(jìn)入填料孔穴。 ABVmVm+VS分子大小凝膠色譜分子大小與保留體積的關(guān)系 第六章 色譜法相對分子量校準(zhǔn)曲線相對分子量校準(zhǔn)曲線 以相對分子量對保留體積作圖。A 排除極限排除極限B 全滲透極限全滲透極限第六章 色譜法GPC的峰容量： Nn2 . 01色譜峰容量比較色譜峰容量比較塔板數(shù)NGPCGCLC400521132500115131100002110161第六章 色譜法數(shù)均分子量、重均分子量和粘均分子量：iiiiiinMWWNMNMiiiiiiiWWMWMNMNM211iiiiMNMNM 是特性粘度是特性粘度-分子量分子量

54、方程中的常數(shù)。方程中的常數(shù)。 高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布nWMMM第六章 色譜法多分散性指數(shù)多分散性指數(shù)d=Mw/Mn在單分散時，Mw/Mn 等于1；隨著分子量分布寬度增大，Mw/Mn 逐漸增大。 一般多分散性聚合物Mw/Mn 在1.53.0之間?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)技術(shù)能合成的單分散聚合物Mw/Mn在1.021.10之間。第六章 色譜法凝膠色譜測定分子量分布凝膠色譜測定分子量分布 柱子出口需要兩個檢測器，一個檢測組分濃度，一個檢測組分分子量。 濃度檢測常用紫外和示差折光檢測器，而分子量檢測還沒有一種理想的技術(shù)可供使用。因此只得采用間接分子量檢測,如淋洗體積指示器或者自動粘度計(jì)。 用淋洗體積指示

55、器作為相對分子量檢測器，是基于在給定色譜柱中，組分的淋洗體積和分子量有依賴關(guān)系。當(dāng)用已知分子量的標(biāo)樣標(biāo)定色譜柱后，就可以從淋洗體積求出試樣分子量。第六章 色譜法6.4 6.4 超高效液相色譜超高效液相色譜 (Ultra performance liquid chromatography, UPLC)概述概述 分離科學(xué)的能力隨著首次成功地使用小顆粒得到驚人的分離能力而進(jìn)入了一個新的時空。這個新的色譜領(lǐng)域，所謂超高效液相色譜（UPLCTM），與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比提供了更高的效率，因而具有更強(qiáng)的分離能力。 UPLCTM的商品化，是分離科學(xué)和技術(shù)的巨大進(jìn)步，液相色譜亦由此進(jìn)入了全新的時代。第六章

56、色譜法 2004年3月，Waters公司在匹茲堡會議上發(fā)布UPLC技術(shù)Acquity，推出第一臺商品化的超高效液相色譜系統(tǒng)，獲得新技術(shù)金獎； 2004年7月，在ASMS上發(fā)布nanoAcquity及Q-TOF組合，專門用于蛋白表達(dá)。第六章 色譜法小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ)小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ) 液相色譜30年的發(fā)展史是顆粒技術(shù)的發(fā)展史。顆粒度的改變直接影響到柱效，從而對分離結(jié)果產(chǎn)品直接影響。 第六章 色譜法Van Deemeter曲線的提示第六章 色譜法顆粒度越小，柱效越高更小的顆粒度： 使得最高柱效點(diǎn)向高線速方向移動 有更寬的線速范圍，增加分離速度q要求儀器在超出目前限度（6000psi

57、/400bar）的壓力下工作q要求儀器系統(tǒng)體積要更小q檢測器能高速檢測出峰寬只有幾秒的色譜峰。第六章 色譜法 Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，充分利用了小顆粒的所有優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)的不足。 由于把全局設(shè)計(jì)思路用于所有集成的部件，包括從進(jìn)樣到數(shù)據(jù)采集Waters UPLCTM系統(tǒng)展示了一種設(shè)計(jì)理念，在當(dāng)今市場上給分離科學(xué)賦予了新的含義。 第六章 色譜法創(chuàng)新的顆粒合成技術(shù)，硬件及填裝過程1.7m的顆粒度 為傳質(zhì)作用所優(yōu)化的孔體積及孔徑 新的橋式雜化顆粒專利技術(shù)，具有耐壓及極為優(yōu)秀的色譜性能 創(chuàng)新的顆粒合成及篩分技術(shù)使顆粒度分布非常窄色譜柱硬件 為保留更

58、小的顆粒新型篩板技術(shù) 新型的柱接頭技術(shù)適應(yīng)更高的耐壓和更低的擴(kuò)散裝填技術(shù) 新型超高壓裝填技術(shù)使得柱床更加穩(wěn)定，有更長的柱壽命第六章 色譜法Waters新技術(shù)的實(shí)現(xiàn)高壓溶劑輸送單元 兩溶劑管理系統(tǒng)，高達(dá)15000psi耐壓完善的系統(tǒng)設(shè)計(jì) 整個系統(tǒng)體積小于150L，包括20L的Loop、50L的梯度混合器體積、500nL的檢測池體積 新型自動進(jìn)樣器，降低實(shí)驗(yàn)周期，減少樣品交叉污染 高速檢測器，采樣速率40點(diǎn)/秒第六章 色譜法Acquity UPLCTM的優(yōu)勢 UPLCTM所展示的優(yōu)勢 樣品通量增加9倍 靈敏度增加3倍 分離度增加2倍數(shù)據(jù)質(zhì)量提高生產(chǎn)力提高 分析速度加快色譜峰容量增加 單位時間內(nèi)能分

59、離樣品的能力增加第六章 色譜法超高分離度超高分離度分離度方程: Rs N1/2Van Deemter色譜理論: N與顆粒度(dp)成反比 ACQUITY UPLCTM系統(tǒng): 1.7m顆粒提供的柱效比5m顆粒提高了3倍 1.7m顆粒的分離度比5m顆粒提高了70第六章 色譜法峰容量增加峰容量增加第六章 色譜法超高速度（高通量）超高速度（高通量） 高通量要求在單位時間內(nèi)提供更多的信息和處理更多的樣品并保證提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。 較小的顆粒能超乎尋常地提高分析速度而不降低分離度。 dp減小后，柱長可以按比例縮短而保持柱效不變 N L/dp Van Deemter理論:最佳流速與粒度成反比 流量1/dp 第

60、六章 色譜法 ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)用1.7 m顆粒，與普通5m顆粒相比： 柱長縮短3倍而保持柱效不變 分離在高3倍的流速下進(jìn)行分離度保持不變，結(jié)果使分離過程快了9倍。第六章 色譜法 Waters ACQUITY UPLCTM的快速分析亦節(jié)省了以往一向耗時的方法認(rèn)證的時間，使方法認(rèn)證的變得簡單快速。原有HPLC分析需要4個不同的方法、三根不同的色譜柱，至少需要65分鐘才能完成；UPLCTM使用了一根色譜柱、一種簡單方法，在1分鐘內(nèi)即可完成。 第六章 色譜法超高靈敏度超高靈敏度 N 1/W2 峰高1/W 峰高1/L 因?yàn)樯V峰變得更窄，峰高也就更高了；同樣，當(dāng)UPLCTM用于快速分析、