基因組序列比對分析及相關軟件的使用

1、WWW.Ggene.CnA 生物基因組序列比對分析，分子進化生物基因組序列比對分析，分子進化A 兔肝兔肝DNA的提取與二苯胺顯色法測定的提取與二苯胺顯色法測定DNA含量含量A 目的基因目的基因SNP位點的鑒定及其意義位點的鑒定及其意義綜合性設計性實驗綜合性設計性實驗-5-5此實驗共包括如下三個部分此實驗共包括如下三個部分1.第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進化第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進化2.第二部分：兔肝第二部分：兔肝DNA的提取和測定的提取和測定3.第三部分：目的基因第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義位點的鑒定及其意義WWW.Ggene.Cn第一部分：生物基因組序

2、列比對分析、分子進化第一部分：生物基因組序列比對分析、分子進化全基因組序列數(shù)據(jù)的積累全基因組序列數(shù)據(jù)的積累,使得不同生物之間的進化關系可以從分子水平上進行研究。使得不同生物之間的進化關系可以從分子水平上進行研究。不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學特征不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學特征,這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列使得我們可以研究使得我們可以研究,從單細胞生物到植物、動物甚至人的進化關系。從單細胞生物到植物、動物甚至人的進化關系。 比較基因組學比較基因組學(Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎上，對已知的是基于基因組圖譜

3、和測序基礎上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)?；?，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼基

4、因的比例較高，重復順序和非編碼順序較少；其基因的比例較高，重復順序和非編碼順序較少；其GC%比較高；內(nèi)含子和外顯子比較高；內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點在多種生物中一致。的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點在多種生物中一致。WWW.Ggene.Cn比較作圖就是利用共同的遺傳標記（主要是分子標記、基因的比較作圖就是利用共同的遺傳標記（主要是分子標記、基因的cDNA克隆以及基因組克隆以及基因組克?。ο嚓P物種進行物理或遺傳作圖，比較這些標記在不同物種基因組中的分布情克?。ο嚓P物種進行物理或遺傳作圖，比較這些標記在不同物種基因組中的分布情況，提示染色體或染色體片段上的同線性（況，提示染色體或染

5、色體片段上的同線性（synteny）或共線性（）或共線性（collinearity），從而），從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進化歷程進行精確分析。基因組比較作圖的研究，對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進化歷程進行精確分析?；蚪M比較作圖的研究，不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用 。比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排

6、列順序的高度保守特點繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進化線索。廣泛的比較作圖可為多個種點繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進化線索。廣泛的比較作圖可為多個種所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。WWW.Ggene.Cn基因組比對軟件基因組比對軟件 Mauve/vista/index.shtml VISTAWWW.Ggene.Cn一個最基本的假設是地球上所有物種都一個最基本的假設是地球上所有物種都有一個共同的祖先，從這個祖先開始以有一個共同的祖先，從這個祖先開始以數(shù)狀形式發(fā)展，通常稱為生命之樹數(shù)狀形式發(fā)展，通常稱

7、為生命之樹（tree of life）。）。分子進化研究的目的：通過序列同源性分子進化研究的目的：通過序列同源性的比較，分析序列間的變化進而了解基的比較，分析序列間的變化進而了解基因的進化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。因的進化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。分子進化有兩個主要研究對象，以全基分子進化有兩個主要研究對象，以全基因組序列為研究對象分析物種進化；以因組序列為研究對象分析物種進化；以某基因在多個物種的同源序列為研究對某基因在多個物種的同源序列為研究對象分析基因的進化象分析基因的進化分子進化分子進化WWW.Ggene.Cn末端末端物種物種中間枝條中間枝條根根末端分支末端分支節(jié)點節(jié)點理論上，一個

8、理論上，一個DNA序列在物種形成或基因復制序列在物種形成或基因復制時，分裂成兩個子序列，因此系統(tǒng)發(fā)育樹一般時，分裂成兩個子序列，因此系統(tǒng)發(fā)育樹一般是二歧的；是二歧的；如果是一棵有根樹，則樹根代表在進化歷史上如果是一棵有根樹，則樹根代表在進化歷史上是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系的分類單元，反映時間順序；的分類單元，反映時間順序；如果找不到可以作為樹根的單元，則系統(tǒng)發(fā)生如果找不到可以作為樹根的單元，則系統(tǒng)發(fā)生樹是無根樹，反映距離；樹是無根樹，反映距離；從根節(jié)點出發(fā)到任何一個節(jié)點的路徑指明進化從根節(jié)點出發(fā)到任何一個節(jié)點的路徑指明進化時間或者進化距離。

9、時間或者進化距離。系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì)：系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì)：WWW.Ggene.Cn基因分子進化分析步驟基因分子進化分析步驟（1）以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列）以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列WWW.Ggene.Cn（2 2）將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，）將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，Clustal XWWW.Ggene.Cn（3）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA，PHYLIP，PAUPhttp:/ WWW.Ggene.Cn（4 4）評價所建立的樹，分析其生物學意義）評價所建立的樹，分析其生物學意義實驗目的實驗目的學習從動物組織

10、中提取學習從動物組織中提取DNA及其含量、純度測定的原理和方法及其含量、純度測定的原理和方法 掌握離心機及島津掌握離心機及島津UV-120的使用方法的使用方法第二部分：兔肝脫氧核糖核酸（第二部分：兔肝脫氧核糖核酸（DNA）的提取和測定）的提取和測定利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者分離，在利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者分離，在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核氯化鈉中

11、溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉淀除去，而淀除去，而DNA則溶解。則溶解。實驗原理實驗原理實驗操作實驗操作1. 棄上清留沉淀棄上清留沉淀兔肝兔肝稱取稱取4 g 加加8ml 1X SSC1X SSC洗洗兩次兩次取取8ml勻漿液勻漿液離離 心心勻漿、過濾勻漿、過濾2.棄上清留棄上清留沉沉淀淀加至加至8ml 1X SSC離離 心心加至加至 8ml 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA離離 心心3.棄上清留沉淀棄上清留沉淀（脫氧核糖核蛋白

12、）（脫氧核糖核蛋白）加約加約2倍倍體積體積95% 乙醇乙醇沉淀沉淀加加 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA至至4ml攪拌攪拌10min逐滴加入逐滴加入0.5ml 15% SDS加加1ml5M NaCl去塞！離心去塞！離心加塞反復加塞反復倒置抽提倒置抽提10min吸取上清液吸取上清液勿吸到中間層！勿吸到中間層！等體積氯仿等體積氯仿-異異丙醇混合液丙醇混合液DNA析出析出用玻棒挑出用玻棒挑出挑取挑取DNA至一離至一離心管心管(小燒杯小燒杯)用用10ml 0.01N NaOH溶解溶解重復重復一次一次輕攪輕攪10min注意事項注意事項盡可能避免盡可能避免DNADNA的斷裂的斷裂 1. 1. 勻

13、漿時應保持低溫，且勻漿時間應短；勻漿時應保持低溫，且勻漿時間應短； 2. 2. 實驗中使用的吸取實驗中使用的吸取DNADNA水溶液的滴管口應粗短并成鈍口。水溶液的滴管口應粗短并成鈍口。保持保持DNADNA活性，避免酸堿或其他變性因素使活性，避免酸堿或其他變性因素使DNADNA變性。變性。攪動不要太大，以免使攪動不要太大，以免使DNADNA斷裂。斷裂。整個實驗過程應在低溫條件下進行。整個實驗過程應在低溫條件下進行。攪拌時動作要輕，反復倒置抽提，不可激烈振蕩。攪拌時動作要輕，反復倒置抽提，不可激烈振蕩。加入加入15% SDS時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。SDS的溫

14、度不能太低，易凝固。吸過的溫度不能太低，易凝固。吸過SDS的吸管要及時清洗。的吸管要及時清洗。加入加入CHCl3/IAA液離心后，分為三層，由上到下為：無機相液離心后，分為三層，由上到下為：無機相-蛋白相蛋白相-有機相。有機相。DNA溶解在無機相中，吸取無機相時動作要輕，不要吸到蛋白相。溶解在無機相中，吸取無機相時動作要輕，不要吸到蛋白相。CHCl3/IAA會溶解有機玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。會溶解有機玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。離心機的使用離心機的使用打開電源開關；打開電源開關；平衡放置離心管；蓋上蓋子。平衡放置離心管；蓋上蓋子。調(diào)節(jié)時間旋鈕至調(diào)

15、節(jié)時間旋鈕至10min；緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至9檔，每檔，每5-10s上升上升1檔；檔；離心完畢后機器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。離心完畢后機器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。離心管必須平衡后，才能啟動離心機；離心管必須平衡后，才能啟動離心機；離心機的蓋子必須蓋緊；離心機的蓋子必須蓋緊；離心過程中不要用重物撞擊離心機；離心過程中不要用重物撞擊離心機；要等離心機完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子。要等離心機完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子。二苯胺顯色法測定二苯胺顯色法測定DNA含量含量DNA的的-脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成-羥基羥基-r酮基戊醛，

16、與二苯胺共熱后酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍色化合物，該化合物在形成藍色化合物，該化合物在595nm處最大吸收。處最大吸收。每每ml含含20400g范圍內(nèi)光密度與范圍內(nèi)光密度與DNA的濃度成正比。反應液中加入少量乙的濃度成正比。反應液中加入少量乙醛，可提高反應的靈敏度。醛，可提高反應的靈敏度。實驗原理實驗原理取取8支試管，按實驗指導的表格加入試劑。支試管，按實驗指導的表格加入試劑。加畢置沸水浴加畢置沸水浴10分鐘，取出冷卻；以分鐘，取出冷卻；以0號管（空白管）調(diào)零點，于號管（空白管）調(diào)零點，于595nm波長比色。波長比色。以光密度為縱坐標，以光密度為縱坐標，DNA含量（含量（g/ml）為橫坐標

17、，繪制標準曲線）為橫坐標，繪制標準曲線.將實驗中所得到的兔肝將實驗中所得到的兔肝DNA溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標“U”和和“B”，按，按表加入試劑。表加入試劑。混勻，置沸水中混勻，置沸水中10min, 取出冷卻。取出冷卻。在在595nm處，以處，以B管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標準曲線上查出相當于該光密度管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標準曲線上查出相當于該光密度值值DNA的含量。的含量。實驗操作實驗操作核酸在核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在處呈特征性吸收，在260nm處有最大吸收，測處有最大吸收，測A260/A280可可得知核酸的大

18、致純度。得知核酸的大致純度。 A260/A280 1.8 表示表示DNA純純 1.8 RNA含量高含量高 1.8 蛋白含量高蛋白含量高核酸紫外吸收光譜的測定核酸紫外吸收光譜的測定雙波長分光光度計，該種機采用兩個光源，可在可見光和紫外區(qū)對物質(zhì)進行雙波長分光光度計，該種機采用兩個光源，可在可見光和紫外區(qū)對物質(zhì)進行分析，鎢絲燈發(fā)出光的適宜范圍在分析，鎢絲燈發(fā)出光的適宜范圍在3601000nm，氘燈發(fā)出光的適宜范圍在，氘燈發(fā)出光的適宜范圍在150400nm。 通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內(nèi)使用。通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內(nèi)使用。使用石英杯作為比色杯。使用石英杯作為比色杯。島津島津

19、UV-120分光光度計分光光度計打開電源，指示燈亮，調(diào)至打開電源，指示燈亮，調(diào)至UV，打開樣品室蓋，打開樣品室蓋打開氘燈（向下按至打開氘燈（向下按至Heat幾秒后扳至幾秒后扳至ON）預熱預熱10min調(diào)節(jié)波長、靈敏度調(diào)節(jié)波長、靈敏度旋扭調(diào)至旋扭調(diào)至“0-100%T”，放入空白管與樣品，調(diào)，放入空白管與樣品，調(diào)0% T蓋上蓋子，旋扭調(diào)至蓋上蓋子，旋扭調(diào)至“ABS 0-2”，調(diào)，調(diào)0% A 拉出樣品，讀數(shù)。開蓋，記錄。拉出樣品，讀數(shù)。開蓋，記錄。島津島津UV-120使用方法使用方法以以0.01N NaOH 為空白管，在為空白管，在260nm和和280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣波長處測定樣

20、品液的吸光度，求出樣品液的品液的A260/A280比值和比值和DNA濃度。濃度。實驗操作實驗操作WWW.Ggene.Cn第三部分：目的基因第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義位點的鑒定及其意義SNP(single nucleotide polymophism) 即單核苷酸多態(tài)，是指群體中變異頻率大于即單核苷酸多態(tài)，是指群體中變異頻率大于1 %的單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)，包括置換、顛換、缺失和插入。的單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)，包括置換、顛換、缺失和插入。一般來說，一個一般來說，一個 SNP 位點只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因。位點只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基

21、因。SNP在人基在人基因組中的發(fā)生頻率比較高，大約平均每因組中的發(fā)生頻率比較高，大約平均每1000個堿基中就有一個多態(tài)位點。個堿基中就有一個多態(tài)位點。WWW.Ggene.CnSNP對基因功能影響對基因功能影響根據(jù)在基因中的位置，根據(jù)在基因中的位置，SNP 可分為基因編碼區(qū)可分為基因編碼區(qū)SNP(coding SNP, cSNP)、基因內(nèi)含子區(qū)、基因內(nèi)含子區(qū)SNP和基因調(diào)控區(qū)和基因調(diào)控區(qū)SNP(regulatory SNP, rSNP)。其中。其中cSNP根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義可分為同義cSNP (synonymous cSNP)和非同義和非同義cSNP

22、(non-synonymous cSNP)。非同義非同義cSNP：，蛋白激酶：，蛋白激酶PRKCH基因內(nèi)的一個非同義基因內(nèi)的一個非同義cSNP(1425G/A)，等位位點從，等位位點從G到到A 的改變可導致激酶的活力增強，進而激活其信號通路，使患腦梗塞的風險增加。的改變可導致激酶的活力增強，進而激活其信號通路，使患腦梗塞的風險增加。同義同義cSNP：多向性耐藥基因：多向性耐藥基因1(MDR1)第第3435 位的一個同義位的一個同義SNP(3435C/T)可改變可改變MDR1 基因產(chǎn)物的功能。這種機制不是通過改變基因產(chǎn)物的功能。這種機制不是通過改變mRNA 及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變mRNA 的構(gòu)象、蛋白的折疊及細胞定位，進而影響基因功能的發(fā)揮。的構(gòu)象、蛋白的折疊及細胞定位，進而影響基因功能的發(fā)揮。內(nèi)含子區(qū)內(nèi)含子區(qū)SN