05 微生物農(nóng)藥(講義5）

1、第三章 微生物農(nóng)藥一、概述1 概念與定義 即傳統(tǒng)概念上的生物農(nóng)藥，而且主要是指殺蟲的微生物。現(xiàn)代概念的微生物農(nóng)藥是指以活體微生物或者以微生物的代謝產(chǎn)物來作為農(nóng)藥，不僅是指殺蟲活性，還包括殺菌、除草和植物生長調(diào)節(jié)活性等。微生物農(nóng)藥的概念可進一步擴展，定義為用來防治病、蟲、草等有害生物的微生物活體及其代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，并可以制成商品上市流通的微生物源制劑。因此按功能作用來分，有殺蟲、殺菌、除草和植物生長調(diào)節(jié)劑4大類；按有效成分分為：抗生素類、細菌類、真菌類、病毒類、原蟲類、線蟲類、微生物產(chǎn)生的植物生長調(diào)節(jié)劑類等七大類。轉(zhuǎn)微生物基因的植物，應(yīng)該視為活體的植物農(nóng)藥，但活性成分是來自于微生物的。線蟲

2、，有人也把這類動物列為微生物農(nóng)藥，實際上線蟲是屬于動物類的。動物界的線蟲門，有4萬多種，1981才有人提出應(yīng)用線蟲防治害蟲，因此，研究比較少。原蟲，又叫原生動物，是單細胞動物或有單細胞組成的群體。傳統(tǒng)上屬于動物界，1980年以后屬于原生生物界的一個亞界。也可以看成是微生物，目前有3-4萬種，寄生在昆蟲體內(nèi)的就有1500多種，如錐蟲、滴蟲、變形蟲、微孢子蟲等。從已上市的生物制劑對防治目標對象的作用機理來看，微生物農(nóng)藥最終起作用的物質(zhì)根本都為具有一定化學結(jié)構(gòu)的生物化學物質(zhì)，如Bt和抗蟲棉的(內(nèi)毒素蛋白，白僵菌的白僵素，病毒分泌的酶，以及防治病蟲草害的抗生素和植物生長調(diào)節(jié)劑等，都具特定的化學結(jié)構(gòu)。按

3、擴展概念來計算，我國微生物農(nóng)藥的產(chǎn)量或防治面積已占農(nóng)藥總產(chǎn)量或防治面積的l0左右，如井岡霉素一個品種的年產(chǎn)量(100有效成份04萬噸)，就占殺菌劑總產(chǎn)量(45萬噸)的9左右，加上其它品種如阿維菌素、赤霉素、Bt、農(nóng)抗120、多氧霉素、白僵菌及一些病毒制劑的產(chǎn)量，它們占農(nóng)藥總產(chǎn)量的比例已接近l0。 2 微生物農(nóng)藥的特點1對人畜平安、對病蟲害的特異性強，不殺傷天敵和有益生物；2易被其它生物或自然因素所分解破壞，在環(huán)境中不易積累，對使用環(huán)境的污染少；3作用效果一般比較緩慢，作用機理比較復(fù)雜，常常有多種因素和成分發(fā)揮作用，害蟲和病原物難以產(chǎn)生抗性。4可進行規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)原料大多為農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣，易

4、生產(chǎn)；5各種品種生產(chǎn)工藝相似、設(shè)備相同，建一個工廠就可生產(chǎn)多品種。6可利用現(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程技術(shù)對微生物和毒力基因進行改造，不斷改進性能和提高質(zhì)量。3 細菌類微生物農(nóng)藥我國對以Bt為主的細菌類農(nóng)藥品種的研究開發(fā)，一直比較活潑。如對Bt，除研究其作用機理、發(fā)酵工藝外，還研究Bt的工程菌和轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因的植物。目前Bt制劑的生產(chǎn)廠家已達64家，年產(chǎn)量8萬多噸制劑，年應(yīng)用面積到達5千萬畝次以上；轉(zhuǎn)Bt基因的農(nóng)作物并產(chǎn)業(yè)化的品種已有抗蟲棉和抗蟲玉米、水稻等，年推廣應(yīng)用面積到達300萬畝左右。除Bt外，開發(fā)成功的細菌制劑還有亞寶(枯草桿菌)、力寶(假單胞桿菌)、增產(chǎn)菌(蠟質(zhì)芽胞桿菌)、康地蕾得多粘類

5、芽孢桿菌等。 4 病毒類農(nóng)藥我國病毒資源豐富，“七五、“八五期間研究出了十幾株具有較好開發(fā)應(yīng)用前景的病毒株，其中棉鈴蟲核多角體病毒已登記注冊，并形成年產(chǎn)百噸制劑的生產(chǎn)線，“九五期間注冊登記了斜紋葉蛾多角體病毒和粘病毒，使用面積每年到達百萬畝以上。2002年，武漢大學生命科學學院與武大綠洲生物技術(shù)合作，研制成功的6個“武大綠洲菜園系列病毒殺蟲劑，分別是菜青蟲、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、苜蓿銀紋夜蛾的顆粒體和核多角體病毒利用生物工程技術(shù)獲得的基因修飾及含有增效蛋白因子的病毒株系已處于開發(fā)生產(chǎn)階段，從而使昆蟲病毒產(chǎn)品的作用譜更廣、防治效果更好。5 真菌類微生物農(nóng)藥昆蟲病原真菌有700多種，而其中只有

6、10余種用于害蟲防治。目前，已經(jīng)有50多個真菌殺蟲劑品種。我國開展真菌制劑的研究開發(fā)已有30多年的歷史，其中以白僵菌為最。目前雖然還未開發(fā)成功白僵菌制劑產(chǎn)品，但每年應(yīng)用白僵茵防治松毛蟲和玉米螟等的面積達1000萬畝次以上。本霉菌已開發(fā)成功，取得農(nóng)藥登記注冊，用于防治蔬菜灰霉病具有較理想的效果和應(yīng)用前景主要有哈次木霉T. harzianum對立枯病、菌核病等有效)。目前，處于小試和中試階段的真菌制劑還有綠僵菌(防治蝗蟲)，淡紫擬育霉(防治植物線蟲)、毒力蟲霉(防治蚜蟲)和蠟蚧輪枝菌(防治白粉虱)等。球孢白僵菌的研究也取得很大進展，主要是增強了球孢白僵菌侵染昆蟲體壁過程中降解昆蟲體壁蛋白酶和幾丁質(zhì)

7、酶的能力。6 微生物產(chǎn)生的植物生長調(diào)節(jié)類農(nóng)藥我國開展植物生長調(diào)節(jié)劑研究的歷史可追溯到50年代初，從5406細胞分裂素土法生產(chǎn)到赤霉素的開發(fā)成功和大面積應(yīng)用，說明植物生長調(diào)節(jié)劑在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。特別是赤霉素促進雙季雜交水稻的分蘗、齊穗、早熟的作用，使其需求量急增，生產(chǎn)廠家到達40多個，成為植物生長調(diào)節(jié)劑中的當家品種。目前開發(fā)成功的由微生物產(chǎn)生的植物生長調(diào)節(jié)劑品種還有細胞分裂素、脫落酸等。 8 微生物除草劑比較復(fù)雜，現(xiàn)在人們的概念是可以象農(nóng)藥一樣防治特定的農(nóng)田雜草的微生物?，F(xiàn)在已經(jīng)在國外廣泛應(yīng)用的微生物除草劑已經(jīng)有10多種，但從登記的情況來看，主要是微生物的代謝產(chǎn)物，如：Fusar

8、ium solani,主要是用來防治大豆和棉花田的除草劑我國1963年即開發(fā)出真菌黑盤孢目炭疽病屬魯保一號，防治菟絲子；1978年利用鏈霉菌新種篩選出的農(nóng)抗除草劑A和B，具有選擇性除草和高效防治水稻白葉枯病的雙重作用。 微生物殺蟲藥劑活體微生物殺蟲劑主要包括： 1 細菌性殺蟲劑概述 昆蟲病原細菌根據(jù)它們的寄主的專一性和作用的特殊方式而分為三種類型：專性病原菌 是一類專性寄生的芽孢桿菌，在自然界，只在寄主昆蟲體內(nèi)繁殖，對特定的昆蟲寄主有很強的致病力，經(jīng)消化道易傳染。芽孢桿菌的金龜子乳狀病原菌和梭狀芽孢桿菌屬細菌就屬于這一類。 兼性病原菌 這是一類營腐生生活，也可寄生于昆蟲體內(nèi)的病原細菌，它們的寄

9、主范圍較廣。細菌在昆蟲宿主消化道內(nèi)增殖，并侵入消化道內(nèi)，造成寄主染病死亡。 潛在病原菌 多數(shù)為腐生菌，普遍存在于昆蟲的消化道中，這類病原菌由于缺乏侵入昆蟲腸壁的能力，很少造成昆蟲的疾病。 細菌殺蟲劑的種類 細菌殺蟲劑Bacterial insecticide是利用對某些昆蟲有致病或致死作用的殺蟲細菌所含有的活性成分或菌體本身制成的，用于防治和殺死目標昆蟲的生物殺蟲制劑。殺蟲細菌主要來自芽孢桿菌科Bacteriaceae、假單孢菌科Pseudomonadaceae、腸桿菌科Enteaobacteriaceae、乳桿菌科Lactobacillaceae 和微球菌科Micrococcaceae等細菌

10、類群。目前的殺蟲細菌約有100多種，但被研制出產(chǎn)品并投入使用的主要是其中的4種，即蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) 、日本金龜子芽孢桿菌(Bacillus popilliae)和緩病芽孢桿菌(bacillus lentimorbus)。前兩種屬兼性殺蟲芽孢桿菌，它們既能在人工培養(yǎng)基上生長，亦能在昆蟲體內(nèi)繁殖；后2者屬專性殺蟲芽孢桿菌，它們一般要在昆蟲寄主體內(nèi)才能生長并形成有侵染力的芽孢。另外，也有少數(shù)其它芽孢桿菌及個別芽孢的細菌開展成產(chǎn)品。 2 蘇云金桿菌類殺蟲劑 蘇云金桿菌Bacillus thuringi

11、ensis是一種革蘭氏陽性細菌，產(chǎn)生伴胞晶體，并能寄生于昆蟲體內(nèi)引起蟲體發(fā)病的芽胞桿菌。1901年日本石渡Ishiwate首次從病死的蠶體中別離出這類病原體，命名為猝到桿菌Bacillus sotto)1911年Berliner在?糧業(yè)雜志?上報道從德國蘇云金的一個面粉廠1909年寄出的一批染病的地中海粉斑螟Anagasta kuehnilla) 幼蟲體內(nèi)別離到這種產(chǎn)伴孢晶體的芽孢桿菌。1915年4月，他詳細描述了該菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征，并定名為蘇云金桿菌Bacillus thurmgiensis Berliner)，簡稱Bt。1938年，世界上第1個蘇云金芽孢桿菌制劑Sporeine在法國問世

12、，并用于防治地中海粉螟。從而掀開了蘇云金芽孢殺蟲劑生產(chǎn)的序幕。1953年，Hannay第一次發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌的殺蟲活性與伴孢晶體有關(guān)，伴孢晶體主要由分子質(zhì)量130 KD da的-內(nèi)毒素蛋白組成。McConnell等1959發(fā)現(xiàn)Bt的局部菌株在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生一種熱穩(wěn)定的-外毒素蘇云金素，并證明該物質(zhì)具有一定的殺蟲活性。Heimpel于1967年將蘇云金桿菌產(chǎn)生的幾種毒素它們劃分為四類，即外毒素、外毒素(蘇云金素)、外毒素、內(nèi)毒素(伴孢晶體蛋白消化激活后產(chǎn)生的毒性肽)。Zakharyan等1976年最先提出，質(zhì)?？赡軐Π殒呔w的編碼起作用。接著，Debabov等和Galushka等1977年證實，

13、蘇云金桿菌含有質(zhì)粒，它與伴抱晶體的形成有關(guān)。從而激起了蘇云金桿菌遺傳學研究的熱潮。通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、融合等傳遞系統(tǒng)、使控制伴孢晶體形成的基因不僅在蘇云金桿菌亞種之間，而且在不同種細菌之間，甚至與高等植物進行了轉(zhuǎn)移或克隆，并獲得了表達。 1981年，Schnept和Whiteley首次將HD-1菌株伴孢晶體的基因克隆到大腸桿菌中，并得到表達。1987年，美國Monsanto公司用自己構(gòu)建的Sev載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移Kurstaki的內(nèi)毒素基因，獲得抗鱗翅目害蟲的番茄轉(zhuǎn)化株。到目前為止，已別離出4萬多個Bt菌種，報道了51個血清型根據(jù)菌體細胞鞭毛抗原的特異性結(jié)合生理生化特性的區(qū)別特征分出血清型 ，50

14、多個亞種，已克隆出60多個毒素基因，我國目前已經(jīng)報道有17個血清型26個亞種。 蘇云金桿菌的生長蘇云金桿菌是好氣性細菌，對溫度發(fā)要求不嚴格，pH值最適宜。其生活周期分為3個發(fā)育階段芽孢休眠期：芽孢又稱孢子，是休眠階段，在枯燥、高溫或低溫冷凍的條件下，能保存相當長的時間，它是保持種存活的形式。營養(yǎng)體時期：芽孢在適宜條件下，24小時萌發(fā)成營養(yǎng)體，46小時橫裂增殖，610小時分裂增殖最旺盛。菌細胞以對數(shù)速度增長。810小時之后，營養(yǎng)體進入原生質(zhì)凝集階段，細胞分裂減慢，芽孢開始形成。孢子囊時期：在這一個時期，包括許多細胞學和生物化學的變化，結(jié)果在菌體細胞內(nèi)形成卵圓形的芽孢。在芽孢的另一端那么產(chǎn)生蛋白質(zhì)

15、伴胞晶體。 蘇云金桿菌產(chǎn)生的毒素內(nèi)毒素 細胞體內(nèi)含有的；外毒素 菌細胞在其生長過程中分泌于細胞外的代謝產(chǎn)物外毒素 卵磷酯或磷酸酯酶C，是一種對昆蟲腸道有破壞作用的酶；外毒素 熱穩(wěn)定外毒素、耐熱外毒素。由于這種毒素對家蠅有特異的致病作用，故也稱蠅毒素。其產(chǎn)生與菌體的生長一致，在細菌生長過程中不斷累積到培養(yǎng)基中。當細菌生長達最大時，毒素的產(chǎn)生也達最大量。芽孢開始形成時，毒素的產(chǎn)生也就完成。這一外毒素又叫蘇云金素，有A、B兩種。具有廣譜的殺蟲活性。對鱗翅目、雙翅目、直翅目、鞘翅目的30多種昆蟲有不同程度的毒殺作用，對桔全爪螨等一些螨類也有效；外毒素 是一種或幾種未經(jīng)鑒定的酶，能使卵黃瓊酯澄清。其毒力

16、尚未證明。 內(nèi)毒素 即伴胞晶體，又稱晶體毒素，是一種蛋白質(zhì)毒素，是蘇云金菌的各類毒素中，研究得最多，又最為詳盡的毒素。與芽孢形成同時生成，對熱有一定的穩(wěn)定性。65可保持1小時，80處理20min也不致破壞；晶體的形態(tài)多種，菱形較為常見。近年來人們又進一步從該菌發(fā)酵上清液中別離出Vips和具協(xié)同毒性作用的Zwittermicin A等活性成分。 在這些殺蟲活性成分中，-內(nèi)毒素亦稱 為“殺蟲晶體蛋白，Insecticidal crystal protein,ICPs是最主要的 內(nèi)毒素的致毒機理內(nèi)毒素作為伴胞晶體亞單位存在時是無毒的。經(jīng)溶解或蛋白水解酶水解后才變成有毒的多肽。伴胞晶體被敏感昆蟲食入后

17、，在中腸被強堿性的腸液PH8.9以上溶解，釋放出一個或多個分子量為27000-140000Da的晶體蛋白，即為-內(nèi)毒素。 -內(nèi)毒素并被腸道蛋白酶水解釋放出分子量更小的毒性多肽 。這些毒素被激活后，首先攻擊的是中腸上皮細胞，并使中腸發(fā)生麻痹。影響中腸上皮的葡萄糖和離子吸收，可以作為神經(jīng)毒素起作用，干擾寄主中腸細胞膜的運載過程，是中腸上皮細胞自溶的起動劑。另外，作為解偶聯(lián)劑，破壞了中腸上皮細胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化的正常功能。值得注意的是，伴胞晶體和芽孢對哺乳動物是沒有毒性和致病性的。主要原因是哺乳動物的消化道缺乏溶解晶體的適宜條件強堿性PH。另外昆蟲腸液中的主要蛋白酶胰蛋白酶與哺乳動物的蛋白酶胃

18、蛋白酶相比較，有一定差異。對于蛋白質(zhì)的水解作用不同。胃蛋白酶對于變性晶體的作用是將之降解為無毒多肽。 鱗翅目敏感昆蟲中毒后的開展過程第一階段：030min。外形及運動正常，停止取食，血淋巴PH和K+輕度上升，中腸上皮不出現(xiàn)明顯的組織病理變化；第二階段：30120分鐘。輕度遲鈍，幼蟲運動緩慢，足部偶爾發(fā)生痙攣，心跳漸漸變慢，中腸停止蠕動，但是麻痹僅局限于中腸。此階段末，幼蟲嘔吐和腹瀉；第三階段：23小時。極度遲鈍，幼蟲受到機械刺激時，不能自由運動。中腸上皮前段發(fā)生病變的部位達整個中腸的20%30%；第四階段：晶體進入34小時。全身麻痹，幼蟲無反射活動，心跳完全停止。這一階段之后1224小時，蟲體

19、皮膚出現(xiàn)許多斑點。解剖中腸也有許多黑色斑點，但沒有出現(xiàn)穿孔。最后幼蟲死亡。臨死時蟲體伸展，不久發(fā)黑，并呈腐爛狀。 4 蘇云金桿菌在害蟲防治中的應(yīng)用在全世界范圍內(nèi)大約有800多種害蟲有效。其中僅鱗翅目昆蟲就有570多種。在我國可對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等5個目33個科共125個種以上的昆蟲有毒殺效果。蔬菜害蟲：菜粉蝶、小菜蛾糧食作物：稻縱卷葉螟、玉米螟、三化螟經(jīng)濟作物：棉鈴蟲、棉卷葉野螟、煙青蟲、油桐尺蠖等果林及果樹害蟲：棗尺蠖、蘋掌舟蛾等森林害蟲：松毛蟲、天幕毛蟲、柳毒蛾等衛(wèi)生害蟲：殺滅蚊幼蟲內(nèi)毒素基因的克隆與表達 內(nèi)毒素蛋白基因的定位 內(nèi)毒素蛋白基因(結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因)是定

20、位于染色體以外的復(fù)制子質(zhì)粒上的。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白Insecticidal crystal proteins 簡稱ICPs的基因已有100多個，依據(jù)殺蟲特異性和序列同源性的差異將ICP劃分為cry1- cry28和cyt1-2兩大類型。現(xiàn)在研究的重點是控制殺蟲晶體蛋白的毒素基因 cry基因。 內(nèi)毒素蛋白基因的分類 蘇云金桿菌晶體毒素基因分為兩個類型:一類是編碼殺蟲的晶體毒素蛋白的基因,稱為晶體毒素基因(cry基因);另一類基因編碼的內(nèi)毒素蛋白對各種脊椎動物和無脊椎動物離體細胞有溶解活性,稱為細胞溶解毒素基因(cryA基因),為以色列亞種(H14)所特有不同基因型殺蟲譜不同，

21、毒蛋白的大小及形狀也不一樣。根據(jù)殺蟲譜的不同，將殺蟲基因分成四大類，統(tǒng)稱為cry基因，用羅馬數(shù)字、等來命名，分別代表幾類殺蟲范圍。在每一類型下根據(jù)氨基酸序列的同源性，又分為 A,B,C等不同的基因型。在同一基因型下根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為a,b,c等不同的基因亞型。其分類如下： 蘇云金桿菌內(nèi)毒素蛋白基因的分類基因類型基因編碼毒素蛋白的基因的其他名稱殺蟲譜氨基酸數(shù)目推算的分子量（103DaCryIA（a）L1176133.24.5-kb基因,cry1-1CryIA(b)L1155131.05.3-kb基因,Kurhd1,btz,cry1-2CryIA(c)L1178133.3

22、6.6-kb基因cryIBL1207138.0CryA4,typeBcryICL1189134.8TypeC,BTV1,BtacryIDL1165132.5cryAL/D63370.9P2基因, cryB1cryBL63370.8CryB2cryAC64473.1CryCcryAD1180134.4130KDa內(nèi)毒素基因,125KDa蛋白基因,ISRH3cryBD1136127.8130KDa內(nèi)毒素基因, ISRH4,Bt8,135KDa蛋白基因cryCD67577.8ORF1cryDD64372.4CryDacytAD/cytol.24827.427KDa毒素基因cryI基因：編碼分子量13

23、0000-140000 Da的晶體蛋白cryI蛋白在芽孢形成過程中累積在棱形的伴胞晶體中，蛋白的毒性局部位于端段cryI基因又可分為cryIA(a、b、c)、cryIB、cryIC和cryID六種基因，對于所有cryI基因來說，基因的5端編碼毒性蛋白，而3端對于編碼蛋白的毒性不是絕對需要的。cryII基因：編碼65000Kd的毒素蛋白又稱P2蛋白，這類蛋白形成立方形的伴胞晶體。cryII基因與其它cry基因的同源性很有限。cryIII基因：為對鞘翅目幼蟲有毒性的擬步甲亞種和蘇云金桿菌ZG2158菌株所特有，它們都為血清型H8a8b。cry基因編碼對雙翅目昆蟲有特異毒性的橢圓形伴孢晶體。cryA

24、, 135 KD; cryB,128 KD; cryC,78 KD; cryD, 72 KD, cryA和 cryB基因在結(jié)構(gòu)上與cry相似，毒性核心區(qū)段為5378KD,位于原毒素蛋白的N端. -內(nèi)毒素蛋白基因的克隆與表達1981年，Schnepf和 Whiteley首先對斯庫塔克亞種的HD-1菌株晶體毒素蛋白基因進行克?。恢饕窃诖竽c桿菌HB101中得到表達；1987年Whiteley等對8個亞種的晶體毒素蛋白基因在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌中得到表達；Sekar和Carlton1985)將以色列亞種的伴孢晶體基因轉(zhuǎn)入到巨大芽孢桿菌，得到產(chǎn)不規(guī)那么行晶體的菌株VB131，該菌株形成芽孢的培養(yǎng)物能

25、100%殺死蚊幼蟲?？赡茉诨蚩寺∨c表達過程中會表現(xiàn)出毒性增加的現(xiàn)象。5 -內(nèi)毒素蛋白基因的遺傳操縱1986年，Shivakumar等將庫斯塔克亞種的晶體毒素蛋白克隆到枯草芽孢桿菌中，克隆的片段上有晶體毒素蛋白基因的啟動子，轉(zhuǎn)錄時，晶體毒素基因是用自身的 啟動子，在菌體形成芽孢前的營養(yǎng)體時期表達了晶體蛋白。這說明，晶體毒素蛋白基因的表達可從芽孢形成的控制中解脫出來。1987年，王憲和范云六通過庫斯塔克亞種HD-1菌與以色列亞種的原生質(zhì)體的融合，得到了既殺鱗翅目又殺雙翅目幼蟲的穩(wěn)定融合子。這說明可以對其毒素蛋白基因進行遺傳操縱。Obukowics等學者在1986年將cryA(b)基因經(jīng)轉(zhuǎn)座子Tn

26、5介導(dǎo)引入到植物的假單孢桿菌中，使植物具有抗蟲性，從而創(chuàng)造了第一代Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物。這也是 Bt毒蛋白基因使植物獲得抗蟲性的最早報道。真正的Bt毒蛋白轉(zhuǎn)基因植物是第二代Bt抗蟲植物。第一個成功的例子是由比利時的植物遺傳系統(tǒng)公司在1987年6月報道的，他們用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將完整地cry(b)基因和3，5端缺失后只保存5端編碼毒蛋白核心區(qū)的不同長度的cry(b)基因?qū)霟煵莴@得了抗煙草天蛾的轉(zhuǎn)基因煙草植株。自那時起，人們在Bt殺蟲晶體蛋白基因的修飾和改造，表達裁體的構(gòu)建，植物遺傳轉(zhuǎn)化方法及抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育等方面有了大量的研究, Perlak等(1991)比較野生Bt毒蛋白基因和高等植物結(jié)

27、構(gòu)基因的DHA序列發(fā)現(xiàn)其含較多的AT堿基和ATTTA重復(fù)序列，便采用Kunkle的DNA點突變法，對野生型Bt毒蛋白基因CRYAD的AT富含區(qū)進行點突變，改變了63個Nt，使CC的含量從37增加到41，ATTA重復(fù)序列從13個減少到7個，改變編碼95，故使轉(zhuǎn)Bt基因植物中-內(nèi)毒素提高10倍又通過不改變原Aa編碼的前提下改變DNA，使390個堿基對60密碼子改變，使GC含量增加到49，但不含ATTA序列。這樣全修飾后的Bt毒蛋白基因?qū)胫参锖?，使植株體內(nèi)的各毒素含量提高100倍，并表現(xiàn)出較強的殺蟲效果，199I年用這種修飾過的Bt毒蛋白基因?qū)朊藁ǘ傻霓D(zhuǎn)基系在11個點次的田間接種試驗中殺蟲效

28、果強。其棉鈴蟲和煙青蟲的為害率不到1，紅鈴蟲在百鈴中的活幼蟲數(shù)僅0.3頭，而對照的棉鈴蟲和煙青蟲為害率幾乎為100，紅鈴蟲在百鈴蟲中的活幼蟲數(shù)為25一50頭。 1993年Fujimsto等對cryA(b)進行了廣泛的修飾，在水稻中得到高效表達。Adang等用經(jīng)過修飾的cryA轉(zhuǎn)化馬鈴薯， Koziel等用經(jīng)過修飾的Cry1A(b)轉(zhuǎn)化玉米，都得到高表抗蟲效果的轉(zhuǎn)基因植物。到目前為止國內(nèi)外已有許多實驗室和科研單位用不同的Bt毒基因和轉(zhuǎn)化方法獲得50多種不同的抗蟲植物。有的已進入大田試驗和商品化生產(chǎn)階段。到1997年，全世界已發(fā)放Bt轉(zhuǎn)基因玉米品種11個，棉花和馬鈴薯品種各5個，主要種植于8個國家

29、和地區(qū)，其中美國的種植面積最大。我國也從1991年起開始了Bt cryA殺蟲基因的局部改造和全合成，并導(dǎo)入棉花、煙草、甘藍等25種以上植物獲得成功。目前全世界已獲得50多種不同的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，技術(shù)趨向成熟，成果向商品化、實用化階段深入，并開展大規(guī)模的田間推廣試驗。從1995年起，cryA類轉(zhuǎn)基因玉米、棉花和馬鈴薯已商品化，性狀有單劑引的抗玉米螟、抗棉鈴蟲和抗馬鈴薯甲蟲，還有玉米和棉花的多基因抗蟲+抗除草劑性狀。 我國Bt轉(zhuǎn)基因植物中，轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉花得到了商品化生產(chǎn)；其中浙江大學原子核農(nóng)業(yè)研究所誘變育種中心通過與加拿大渥太華大學合作，在國際上率先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法于1994年成功的地獲得了

30、轉(zhuǎn)cryA(b)Bt基因的水稻，并于1998年6月通過農(nóng)業(yè)部批準進行環(huán)境釋放試驗。1998年9月通過鑒定，成為國際上最有希望最早實現(xiàn)商品的水稻品種。 2002年荷蘭國際植物研究中心與保加利亞plovdiv大學聯(lián)合將cryBa和cry la組合起來，形成一種混合毒素，并在馬鈴薯上得以表達，可以對馬鈴薯甲蟲和歐洲玉米螟進行控制。3 其它細菌殺蟲劑3、1球形芽孢桿菌迄今已別離到各種球形芽孢桿菌的菌株近700株，但有毒菌株較少，它們分屬于總共48個血清型中的10個血清型。球形芽孢桿菌有毒菌株對庫蚊、按蚊有較高毒力，對伊蚊幼蟲的毒力那么不及蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的菌株，對蚋那么無毒力。但由于球形芽孢桿

31、菌的芽孢和晶體在環(huán)境中持效期較長，并有可能在環(huán)境中再循環(huán)，因此對球形芽孢桿菌高毒菌株的篩選及制劑研究從80年代中后期開始受到重視。我國生產(chǎn)了Bs-10,C3-41等乳劑，曾在野外大面積用于蚊幼蟲的防治。球型芽孢桿菌對蚊幼蟲的致病性或致死作用是通過毒素或與孢子囊體有關(guān)的毒素或芽孢實現(xiàn)的。在產(chǎn)生伴孢體的菌株中，伴孢體具有最大的殺蟲活性。BS毒素與BT的內(nèi)毒素的作用方式有相似之處，即都需要酶的激活才能對細胞有毒性，但BS毒素的受體是糖蛋白，而BT內(nèi)毒素的受體是磷脂球型芽孢桿菌高度的致病力、較長的持效期和在污水期中仍有較強的殺蟲活性，被世界衛(wèi)生組織列為最有希望的生物殺蟲劑之一。3.2 日本金龜子芽孢桿菌和緩病芽孢桿菌日本金龜子芽孢桿菌以及緩病芽孢桿菌能使蠐螬產(chǎn)生A型乳狀病和B型乳狀病。第一個日本金龜子芽孢桿菌制劑Doom 于1950年在美國登記，成為該國政府批準登記的第一個生物防治制劑。由于日本金龜子芽孢桿菌和緩病芽孢桿菌尚不能在人工培養(yǎng)基上生長形成有侵染力的芽孢，因此商品制劑Doom,Japidemic,Grub，Attack及 Milky-spore等都是采用幼蟲活