實(shí)驗(yàn)六 DNA重組技術(shù)

1、1、什么是DNA重組技術(shù)？ 2、重組DNA操作的一般流程3、DNA重組所需要的基本工具 1、獲得目的基因；2、與表達(dá)載體連接，形成新的重組DNA分子；3、用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；4、對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；5、對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 3、DNA重組所需要的基本工具（1） 準(zhǔn)確切割DNA的工具，“” 限制酶；（2） DNA片段的連接工具，“” DNA連接酶；（3） 基因轉(zhuǎn)移工具，“” 載體質(zhì)粒。 自身不能互補(bǔ)的黏性末端（用兩種以上不同的酶處理）（平末端酶處理）帶有相同的黏性末端（用相同的酶或同尾酶處理）自身能互

2、補(bǔ)的黏性末端（僅用一種酶處理）帶有不同的黏性末端（用不同的酶處理）對(duì)不同末端間連接的方法亦不同：對(duì)不同末端間連接的方法亦不同：帶有相同的黏性末端自身能互補(bǔ)的黏性末端自身不能互補(bǔ)的黏性末端帶有不同的黏性末端 根據(jù)其所需求的輔助因子的不同，可分為兩大類(lèi)：DNA連接酶類(lèi)型連接酶類(lèi)型1）需要ATP參與的 T4 DNA連接酶被T4 噬菌體感染的E.coli , 表達(dá)基因的來(lái)源為T(mén)4 噬菌體。催化DNA上相鄰堿基的5磷酸與3羥基間之間形成磷酸二酯鍵；具有連接親和（相互匹配）黏性末端DNA以及平末端DNA的作用，加入PEG（聚乙二醇）可促進(jìn)平末端DNA間的連接速度。酶先與ATP形成酶-ATP共價(jià)復(fù)合物，再與

3、DNA作用，AMP轉(zhuǎn)移至DNA缺口5-磷?；闲纬山沽姿釅A而活化5-磷酰基，然后再與3-羥基形成磷酸酯堿，完成連接過(guò)程。 根據(jù)其所需求的輔助因子的不同，可分為兩大類(lèi)：DNA連接酶類(lèi)型連接酶類(lèi)型1）需要ATP參與的 T4 DNA連接酶2）需要NAD（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）參與的E.coli DNA連接酶1967年從 E.coli 中能夠發(fā)現(xiàn)分離催化帶互補(bǔ)5磷酸或3羥基突出的雙鏈DNA間催化連接，連接平末端的效率極低（只補(bǔ)缺口，不能封閉裂口）。 1）連接酶的用量2）作用的時(shí)間與溫度3）底物濃度 一般情況下，酶濃度高，反應(yīng)快，產(chǎn)量高；但：酶是保存在50%甘油里的 高濃度甘油會(huì)嚴(yán)重影響連接效果！反應(yīng)速度隨溫度的提高而增加；DNA連接酶的最適溫度是37但：37時(shí)，黏性末端間的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，因此，常采用較低的溫度反應(yīng)，如： 16，連接1216h；一般采用提高DNA的濃度來(lái)增加重組比例；但：反應(yīng)體積太大，連接效果也很差；因此，載體與目的基因宜采用等物質(zhì)的量進(jìn)行連接。經(jīng)BamH和Xho酶切過(guò)的pBI121質(zhì)粒和加有BamH和Xho酶切末端的銀杏CHS基因恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、移液器、制冰機(jī)、PCR離心管、吸頭、一次性手套等3）混勻后利用離心機(jī)