DB44∕T 2340.4-2021 諸氏鯔蝦虎魚 毒理學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：生殖毒性

1、 ICS 13.020.40CCS Z 1044廣 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB44/T 2340.42021諸氏鯔蝦虎魚毒理學(xué)評(píng)價(jià)第4部分：生殖毒性Mugilogobius chulaeToxicology evaluationPart 4: Reproduction toxicity2021-10-18發(fā)布2022-01-18實(shí)施 DB44/T 2340.42021目次前言. II1范圍. 1規(guī)范性引用文件 . 1術(shù)語(yǔ)和定義 . 1原理. 2方法. 2器材. 3評(píng)價(jià)步驟 . 3質(zhì)量控制 . 5結(jié)果與報(bào)告 . 5諸氏鯔蝦虎魚安樂(lè)死 . 6實(shí)驗(yàn)室廢棄物的處理 . 6234567891011附錄A

2、（資料性）諸氏鯔蝦虎魚雌雄鑒別方法. 7附錄B（資料性）諸氏鯔蝦虎魚生殖毒性評(píng)價(jià)原始記錄表. 8附錄C（規(guī)范性） VTG mRNA和AR mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定方法 . 16I DB44/T 2340.42021前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。DB44/T 2340諸氏鯔蝦虎魚毒理學(xué)評(píng)價(jià)分為四個(gè)部分：第1部分：急性毒性；第2部分：攝食抑制；第3部分：生長(zhǎng)抑制；第4部分：生殖毒性。本文件是DB44/T 2340的第4部分。II DB44/T 2340.42021諸氏鯔蝦虎魚毒理學(xué)評(píng)價(jià)第 4部分：生殖毒性1范圍本文件規(guī)定了諸氏鯔蝦

3、虎魚毒理學(xué)評(píng)價(jià)中生殖毒性的原理、方法、器材、評(píng)價(jià)步驟、質(zhì)量控制、結(jié)果與報(bào)告、安樂(lè)死和實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理等要求。本文件適用于直接或間接排入海洋、入海河口的污染物及受納水體的生殖毒性評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 35517-2017化學(xué)品魚類生殖毒性短期試驗(yàn)方法SN/T 3592實(shí)驗(yàn)室化學(xué)藥品和樣品廢棄物處理的標(biāo)準(zhǔn)指南DB44/T 2340.1-2021諸氏鯔蝦虎魚毒理學(xué)評(píng)價(jià)第1部分：急性毒性3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定

4、義適用于本文件。生殖毒性 reproductive toxicity指外源物質(zhì)對(duì)雄性和雌性生殖功能或能力以及對(duì)后代產(chǎn)生的不良效應(yīng)。卵黃蛋白原 vitellogenin, VTG一種磷脂糖蛋白，卵黃蛋白的前體，通常存在于卵生動(dòng)物性成熟雌性個(gè)體中。來(lái)源：GB/T 35517-2017，2.1.3，有修改雄激素受體 androgen receptor, AR一種配體依賴性的反轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，介導(dǎo)脊椎動(dòng)物雄激素的多向效應(yīng)，對(duì)性別分化、性成熟和精子發(fā)生起重要作用。最大耐受濃度 maximum tolerated concentration, MTC受試物引起小于10%死亡率的最高試驗(yàn)濃度。來(lái)源：GB/T

5、35517-2017，2.1.4無(wú)可見(jiàn)影響濃度 no observed effect concentration, NOEC實(shí)驗(yàn)生物暴露在一組不同濃度的試驗(yàn)溶液一定時(shí)間后，通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)生物的不良影響，并比較試驗(yàn)組與對(duì)照組統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，判定出對(duì)實(shí)驗(yàn)生物無(wú)顯著影響（p0.05）的最大濃度。來(lái)源：GB/T 18420.22009，3.21 DB44/T 2340.42021最低可觀察效應(yīng)濃度 lowest observed effect concentration, LOEC與對(duì)照相比，對(duì)受試生物產(chǎn)生顯著(p<0.05)效應(yīng)的最低受試物濃度。來(lái)源：GB/T 21828-2008，2.4性腺指數(shù)

6、 gonad somatic index，GSI性腺重量相對(duì)去內(nèi)臟體重的比例，是性成熟度的一個(gè)指標(biāo)。參見(jiàn)：GSI=（GW/SW）x 100 %式中：GW性腺重，單位為克（g）；SW去內(nèi)臟體重（凈重），單位為克（g）。相對(duì)生殖力 relative fecundity指一尾雌魚在一定產(chǎn)卵周期內(nèi)單位體重或單位體長(zhǎng)產(chǎn)出的卵子數(shù)量。孵化率 hatching rate從卵內(nèi)破膜而出的仔魚數(shù)量與總卵數(shù)的百分比。不投餌存活系數(shù) survival activity index，SAI衡量仔魚活力的重要指標(biāo)。參見(jiàn)：SAI =Ki=1(N hi) × i/N式中：N起始的仔魚數(shù)量；K仔魚全部死亡所需的天數(shù)

7、；Hi第i天時(shí)仔魚的累計(jì)死亡數(shù)。4原理VTG是包括性成熟魚類在內(nèi)的卵生雌性動(dòng)物肝臟產(chǎn)生的一種特有蛋白前體，由血液循環(huán)進(jìn)入卵巢，但在外源類雌激素物質(zhì)的刺激下，雄魚肝臟也能產(chǎn)生該蛋白前體；雄激素通過(guò)AR激活下游信號(hào)通路來(lái)行使其功能，外源類雄激素物質(zhì)的暴露可誘導(dǎo)AR mRNA的表達(dá)。魚類在污染物中暴露后，通過(guò)測(cè)定肝臟組織VTG mRNA和AR mRNA表達(dá)水平，可表征水污染物對(duì)魚類的早期生殖毒性效應(yīng)。此外，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過(guò)干擾魚類性激素水平進(jìn)而導(dǎo)致魚類性腺指數(shù)、生殖力、孵化率、不投餌存活系數(shù)等生殖器官發(fā)育和生殖能力指標(biāo)異常，這些指標(biāo)可用于評(píng)估受試物的生殖毒性。5方法根據(jù)試液更換頻次可分為靜態(tài)毒

8、性試驗(yàn)、半靜態(tài)毒性試驗(yàn)和流水毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)期間受試物實(shí)測(cè)濃度與配制濃度偏差超過(guò)20%或受試物穩(wěn)定性不明確時(shí)，宜采用半靜態(tài)毒性試驗(yàn)或流水毒性試驗(yàn)。根據(jù)暴露時(shí)間可分為期生殖毒性試驗(yàn)和期生殖毒性試驗(yàn)。5.2.1期生殖毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)周期為21 d，以VTG mRNA和AR mRNA的表達(dá)量為主要檢測(cè)指標(biāo)。2 DB44/T 2340.420215.2.2期生殖毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)周期為90 d，其中包含持續(xù)暴露染毒期30 d，轉(zhuǎn)移至清水飼養(yǎng)期60d，以性腺指數(shù)、生殖力、孵化率、仔魚不投餌存活系數(shù)作為主要檢測(cè)指標(biāo)。6器材主要儀器設(shè)備6.1.16.1.26.1.3飼養(yǎng)諸氏鯔蝦虎魚以及餌料生物的養(yǎng)殖箱、水處理設(shè)備等

9、。測(cè)定環(huán)境因子的溶氧儀、鹽度計(jì)、pH計(jì)、溫度計(jì)等。用化學(xué)惰性材料制成的試驗(yàn)容器。期生殖毒性試驗(yàn)試驗(yàn)容器體積為2.0 L3.0 L；期生試驗(yàn)容器體積為5.0 L10.0 L。6.1.4電子天平、高速攪拌器、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、熒光定量 PCR 儀、生物顯微鏡、解剖鏡、血球計(jì)數(shù)板、超凈工作臺(tái)、量筒、膠頭滴管、移液管、手抄網(wǎng)等。諸氏鯔蝦虎魚6.2.1性別、規(guī)格選擇根據(jù)試驗(yàn)要求選擇雌雄魚。諸氏鯔蝦虎魚雌雄鑒別方法見(jiàn)附錄A。期生殖毒性試驗(yàn)應(yīng)選擇在水溫25.0±2.0、其它條件適宜的環(huán)境下培育的（16±2）周齡雄魚，其個(gè)體體長(zhǎng)宜在平均體長(zhǎng)的±20%內(nèi)。期生殖毒性試驗(yàn)應(yīng)選擇在水

10、溫25.0±2.0、其它條件適宜的環(huán)境下培育的（22±2）周齡實(shí)驗(yàn)魚，其個(gè)體體長(zhǎng)宜在平均體長(zhǎng)的±20%內(nèi)。6.2.2質(zhì)量按DB44/T 2340.1-2021中6.2.1的規(guī)定執(zhí)行。受試物按DB44/T 2340.1-2021中6.3的規(guī)定執(zhí)行。7評(píng)價(jià)步驟樣品準(zhǔn)備7.1.1稀釋水按DB44/T 2340.1-2021中7.1.1的規(guī)定執(zhí)行。7.1.2貯備液配制按DB44/T 2340.1-2021中7.1.2的規(guī)定執(zhí)行。預(yù)試驗(yàn)可采用較大的等比系數(shù)設(shè)置5個(gè)等比濃度組和1個(gè)陰性對(duì)照組。若使用助溶劑應(yīng)增設(shè)助溶劑對(duì)照組，助溶劑的濃度應(yīng)與試驗(yàn)組中助溶劑的最高濃度一致，試驗(yàn)溶

11、液中助溶劑的最高濃度不得超過(guò)0.1?？? DB44/T 2340.42021不設(shè)平行組。應(yīng)記錄試驗(yàn)溶液配制過(guò)程，試驗(yàn)溶液配制原始記錄表見(jiàn)附錄B中表B.1。觀察諸氏鯔蝦虎魚96 h的死亡情況，確定諸氏鯔蝦虎魚的最大耐受濃度（MTC）范圍。正式試驗(yàn)7.3.1試驗(yàn)溶液配制期生殖毒性試驗(yàn)：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以0.1 MTC為最高試驗(yàn)濃度設(shè)定至少3個(gè)等比濃度組，等比系數(shù)310之間，并設(shè)陰性對(duì)照組、0.1g/L 17-雌二醇陽(yáng)性對(duì)照組和0.1g/L-甲基睪酮陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)容器試液體積1.0 L。各試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。期生殖毒性試驗(yàn)：參考期生殖毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定至少3個(gè)等比濃度組，等比系數(shù)310之間，設(shè)陰性對(duì)

12、照組、0.1g/L17-雌二醇陽(yáng)性對(duì)照組和0.1g/L-甲基睪酮陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)容器試液體積3.0 L6.0 L。各試驗(yàn)組設(shè)2個(gè)平行。若使用助溶劑應(yīng)增設(shè)助溶劑對(duì)照組，助溶劑濃度應(yīng)與試驗(yàn)組中助溶劑最高濃度一致，試驗(yàn)溶液中助溶劑的最高濃度不得超過(guò)0.1。應(yīng)記錄試驗(yàn)溶液配制過(guò)程，試驗(yàn)溶液配制原始記錄表見(jiàn)附錄B中表B.1。7.3.2諸氏鯔蝦虎魚移入試驗(yàn)開(kāi)始前諸氏鯔蝦虎魚停食5 h24 h，用手抄網(wǎng)在馴養(yǎng)箱中隨機(jī)撈取，移入試驗(yàn)容器。期生殖毒性試驗(yàn)每個(gè)容器放雄魚5尾。期生殖毒性試驗(yàn)每個(gè)容器放雌雄魚各10尾。在30 min內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)魚分放。7.3.3試驗(yàn)環(huán)境條件按DB44/T 2340.1-2021中7.4

13、.3的規(guī)定執(zhí)行。7.3.4諸氏鯔蝦虎魚投喂每天每尾魚投喂鹵蟲約30個(gè)，每個(gè)試驗(yàn)容器每次投喂體積不超過(guò)0.2 mL。7.3.5試驗(yàn)溶液更換靜態(tài)毒性試驗(yàn)不更換試驗(yàn)溶液。半靜態(tài)毒性試驗(yàn)每48 h至少更換一次試液，每次更換量不少于原試液體積的3/4。宜采用虹吸方式吸出原液，緩慢加入新液，操作過(guò)程中應(yīng)避免觸碰諸氏鯔蝦虎魚。流水毒性試驗(yàn)每24 h至少更換一次貯備液。一個(gè)試驗(yàn)容器24 h的流量至少為該容器內(nèi)試驗(yàn)溶液體積的5倍。試驗(yàn)期間流速變幅不大于10%。觀察和記錄7.4.1水質(zhì)因子測(cè)定和行為、體表特征觀察試驗(yàn)溶液加入前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別測(cè)量溶解氧、pH值、鹽度等水質(zhì)因子，每天測(cè)量水溫、觀察諸氏鯔蝦虎魚死亡、

14、游泳、呼吸、攝食、體色、身體彎曲、鱗片脫落等異常情況，及時(shí)移出死亡個(gè)體。觀測(cè)結(jié)果記錄于原始記錄表中，見(jiàn)附錄B中的表B.2。7.4.2 VTG mRNA和AR mRNA相對(duì)表達(dá)量4 DB44/T 2340.42021期生殖毒性試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集同一試驗(yàn)容器內(nèi)所有存活的諸氏鯔蝦虎魚肝臟組織混合為一個(gè)樣品，液氮中保存。3個(gè)平行組為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品。肝臟組織取樣按GB/T 35517的規(guī)定執(zhí)行。按附錄C的方法測(cè)定各樣品VTG mRNA和AR mRNA相對(duì)表達(dá)量，測(cè)定結(jié)果分別記錄于附錄B中的表B.3和表B.4。7.4.3性腺指數(shù)期生殖毒性試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，100 mg/L MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚，逐一稱量性腺

15、（精巢或卵巢）重量和實(shí)驗(yàn)魚凈重（去內(nèi)臟體重），結(jié)果記錄于原始紀(jì)錄表中，見(jiàn)附錄B中的表B.5。7.4.4生殖力期生殖毒性試驗(yàn)轉(zhuǎn)移至清水飼養(yǎng)期間每天觀察諸氏鯔蝦虎魚產(chǎn)卵情況。雌魚產(chǎn)卵后，計(jì)數(shù)產(chǎn)卵量，測(cè)量雌魚體長(zhǎng)，結(jié)果記錄于原始紀(jì)錄表中，見(jiàn)表B.6。7.4.5孵化率期生殖毒性試驗(yàn)轉(zhuǎn)移至清水飼養(yǎng)期間，每批魚卵產(chǎn)出后，置于稀釋水中，在水溫25±2、光照54 lx524 lx、溶氧大于5 mg/L的條件下孵化，觀察孵出魚苗數(shù)測(cè)結(jié)果記錄于原始紀(jì)錄表中，見(jiàn)表B.7。，測(cè)定試驗(yàn)期間測(cè)定水質(zhì)，觀7.4.6不投餌存活系數(shù)期生殖毒性試驗(yàn)轉(zhuǎn)移至清水飼養(yǎng)期間，每批仔魚孵出后，隨機(jī)取100尾初孵仔魚（出膜2小時(shí)內(nèi)

16、），在DB44/T 2340.1-2021 B.2環(huán)境條件下不投餌飼養(yǎng)，測(cè)定試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束的水質(zhì)環(huán)境因子，并每天觀察仔魚的存活數(shù)，直至仔魚全部死亡。試驗(yàn)結(jié)果記錄于原始紀(jì)錄表中，見(jiàn)表B.8。計(jì)算不投餌存活系數(shù)SAI值及半數(shù)致死時(shí)間。8質(zhì)量控制有效的試驗(yàn)應(yīng)符合以下條件：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組（包括陰性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組）諸氏鯔蝦虎魚死亡率不大于 10%；在2327條件下，與陰性對(duì)照組相比，0.1g/L的17-雌二醇陽(yáng)性對(duì)照組暴露21d后，雄性諸氏鯔蝦虎魚肝臟VTG mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高（p0.05）；0.1g/L的-甲基睪酮陽(yáng)性對(duì)照組暴露21 d后，雄性諸氏鯔蝦虎魚肝臟AR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯

17、著提高（p0.05）；期生殖毒性試驗(yàn)對(duì)照組產(chǎn)卵次數(shù)低于2次占比不超過(guò)50%；原始記錄應(yīng)完整，包括樣品名稱、編號(hào)、試驗(yàn)時(shí)間、評(píng)價(jià)依據(jù)、馴養(yǎng)記錄等。9結(jié)果與報(bào)告結(jié)果計(jì)算應(yīng)對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組、試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組之間的生殖毒性效應(yīng)進(jìn)行比較分析，計(jì)算NOEC或LOEC。如使用了溶劑對(duì)照，應(yīng)比較分析陰性對(duì)照組和溶劑對(duì)照組之間的毒性效應(yīng)顯著性差異。5 DB44/T 2340.42021采用Shapiro-Wilk法和Bartletts法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊次檢驗(yàn)。如果試驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布和方差齊次檢驗(yàn)，則采用單因素方差分析（ANOVA）或多重比較分析（Dunnett's法），判定陰性

18、對(duì)照組和不同濃度組之間是否存在顯著性差異，確定NOEC或LOEC；如果試驗(yàn)結(jié)果不符合正態(tài)分布或方差齊次檢驗(yàn)，則采用非參數(shù)方法（Jonckheere法）確定NOEC或LOEC。評(píng)價(jià)報(bào)告評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：a)b)c)受試樣品的名稱、來(lái)源、保存方法、保存時(shí)間等；諸氏鯔蝦虎魚來(lái)源、體長(zhǎng)、馴養(yǎng)和配對(duì)情況；試驗(yàn)條件：1)2)3)4)試驗(yàn)方式，如半靜態(tài)毒性試驗(yàn)或流水毒性試驗(yàn)，以及曝氣、密度等；貯備液和試驗(yàn)溶液配制方法、濃度；各試驗(yàn)容器諸氏鯔蝦虎魚的數(shù)量；試驗(yàn)溶液配制后和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的環(huán)境指標(biāo)，如水溫、溶氧、鹽度、pH等。d)結(jié)果：1)2)3)4)對(duì)照組和各濃度組諸氏鯔蝦虎魚的死亡率；試驗(yàn)期間，受試物對(duì)諸

19、氏鯔蝦虎魚的毒性效應(yīng)（行為和體表特征等）；陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照21 d的VTG mRNA和AR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性分析結(jié)果；試驗(yàn)組與陰性對(duì)照 21 d的 VTG mRNA和 AR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性分析結(jié)果，NOEC或LOEC及其計(jì)算方法；5)6)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照90 d的性腺指數(shù)、生殖力、孵化率、不投餌存活系數(shù)顯著性分析結(jié)果；試驗(yàn)期間，可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的因素。1011諸氏鯔蝦虎魚安樂(lè)死按照DB44/T 2340.1-2021第10章的規(guī)定執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)室廢棄物的處理實(shí)驗(yàn)室樣品及廢棄物按SN/T 3592的規(guī)定執(zhí)行。6 DB44/T 2340.42021AA附錄 A（資料性）諸氏鯔蝦

20、虎魚雌雄鑒別方法A.1形態(tài)特征諸氏鯔蝦虎魚雄魚和雌魚形態(tài)特征比較見(jiàn)表A.1。表A.1諸氏鯔蝦虎魚雄魚和雌魚形態(tài)特征比較雄魚雌魚頭略平扁、中大，腹部扁平。頭稍鈍圓，腹部膨大。第一背鰭第2根4根鰭棘末端延長(zhǎng)呈絲狀，最長(zhǎng)鰭棘可延第一背鰭第2根4根鰭棘末端延長(zhǎng)呈絲狀，最長(zhǎng)鰭棘僅延伸伸至第二背鰭第五鰭條基部。至第二背鰭第一鰭條基部。上頜骨延伸至瞳孔中心的垂直線。成熟個(gè)體胸鰭基部有一個(gè)棕黑色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)外邊界呈黃色尾鰭膜呈淺灰黑色。上頜骨延伸至眼眶前緣的垂直線。成熟個(gè)體胸鰭基部有一個(gè)棕黑色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)外邊界呈灰白色。尾鰭膜呈淺灰白色。A.2生殖突特征諸氏鯔蝦虎魚生殖突位于泄殖孔尾端。解剖鏡下觀察，成熟雄魚個(gè)體

21、生殖突較小，表面色素沉淀多，呈三角形，末端尖；成熟雌魚個(gè)體生殖突明顯較膨大，表面色素沉積少，呈半透明狀，基部較寬，末端鈍圓。7 DB44/T 2340.42021BB附錄 B（資料性）諸氏鯔蝦虎魚生殖毒性評(píng)價(jià)原始記錄表B.1試驗(yàn)溶液配制記錄表試驗(yàn)溶液配制記錄見(jiàn)表B.1。表B.1試驗(yàn)溶液配制記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：記錄時(shí)間：樣品表觀性狀：稀釋水：曝氣24 h以上的自來(lái)水，pH值：；天然海水，鹽度：，pH值：。稱量樣品g/mL；加入 mL稀釋水溶解，定容至mL；配制成濃度為mg/L的貯備液。稱量陰性對(duì)照品，g；加入g；加入g；加入mL；加入mL稀釋水溶解，定容至mL稀釋水溶解

22、，定容至mL稀釋水溶解，定容至mL稀釋水溶解，定容至mL；配制成mL；配制成mL；配制成mL；配制成濃度為mg/L的陰性對(duì)照溶液。稱量陽(yáng)性樣品1，濃度為mg/L的貯備液。稱量陽(yáng)性樣品2，濃度為mg/L的貯備液?？诹咳≈軇?，濃度為mg/L的助溶劑貯備液。濃度總體積貯備液稀釋水組別mg/LmLmLmL陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組1陽(yáng)性對(duì)照組2試驗(yàn)組1試驗(yàn)組2試驗(yàn)組3評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.2試驗(yàn)觀察和環(huán)境因子測(cè)定原始記錄表試驗(yàn)觀察和環(huán)境因子測(cè)定原始記錄見(jiàn)表B.2。8 DB44/T 2340.42021表B.2試驗(yàn)觀察和環(huán)境因子原始記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：樣品表觀性狀：毒

23、性效應(yīng)（a）毒性效應(yīng)（c）記錄時(shí)間：毒性效應(yīng)（b）毒性效應(yīng)（d）注：根據(jù)觀察結(jié)果，可增加毒性效應(yīng)編號(hào)?？陬A(yù)試驗(yàn) 口期生殖毒性試驗(yàn) 口期生殖毒性試驗(yàn)（在相應(yīng)選項(xiàng)前的口內(nèi)劃“”）水溫鹽度DO流速組別存活數(shù)pH毒性效應(yīng)mg/LL/sABCABCABCABCABCABCABC陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組 1陽(yáng)性對(duì)照組 2助溶劑對(duì)照組組 1：組 2：組 3：mg/Lmg/Lmg/L注：“毒性效應(yīng)”列填入的數(shù)字和字母分別表示改組出現(xiàn)死亡以外的毒性效應(yīng)的魚數(shù)及相應(yīng)效應(yīng)的編號(hào)。評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.3 VTG mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄表VTG mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄

24、見(jiàn)表B.3。9 DB44/T 2340.42021表B.3 VTG mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)日期：記錄時(shí)間：樣品表觀性狀：評(píng)價(jià)依據(jù)：組別陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組 1 陽(yáng)性對(duì)照組 2 組 1mg/L組 2mg/L組 3mg/LABCABC內(nèi)參-actinVTG基因評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.4 AR mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄表AR mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄見(jiàn)表B.4。10 DB44/T 2340.42021表B.4 AR mRNA相對(duì)表達(dá)量（熒光閾值Ct）原始記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：樣品表觀

25、性狀：記錄時(shí)間：組別陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組1陽(yáng)性對(duì)照組2組1 mg/L組2 mg/L組3 mg/LABCABC內(nèi)參-actinAR基因評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.5性腺指數(shù)原始紀(jì)錄表性腺指數(shù)原始紀(jì)錄見(jiàn)表B.5。11 DB44/T 2340.42021表B.5性腺指數(shù)原始紀(jì)錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：記錄時(shí)間：樣品表觀性狀：實(shí)驗(yàn)魚編號(hào)性腺重凈重性腺指數(shù)實(shí)驗(yàn)魚編號(hào)性腺重凈重性腺指數(shù)評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.6生殖力原始記錄表生殖力原始記錄見(jiàn)表B.6。12 DB44/T 2340.42021表B.6生殖力原始記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：產(chǎn)卵量評(píng)價(jià)日期：樣品表觀

26、性狀：記錄時(shí)間：開(kāi)始時(shí)體長(zhǎng)mm結(jié)束時(shí)體長(zhǎng)mm雌魚編號(hào)粒第1次第2次第3次第4次第5次第6次第7次組組組評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.7孵化率原始記錄表孵化率原始記錄見(jiàn)表B.7。13 DB44/T 2340.42021表B.7孵化率原始記錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：記錄時(shí)間：樣品表觀性狀：批次總卵數(shù)水溫鹽度0 hpH溶解氧mg/L24 h48 h水溫水溫水溫72 h96 h孵出數(shù)水溫孵出數(shù)水溫鹽度pH120 h溶解氧mg/ L孵出數(shù)孵化率評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：B.8不投餌存活系數(shù)原始紀(jì)錄表不投餌存活系數(shù)原始紀(jì)錄見(jiàn)表B.8。14 DB44/T 2340.42021表

27、B.8不投餌存活系數(shù)原始紀(jì)錄表樣品名稱：樣品編號(hào)：評(píng)價(jià)依據(jù)：評(píng)價(jià)日期：樣品表觀性狀：仔魚出膜時(shí)間：時(shí)間水溫A組B組C組項(xiàng)目d仔魚數(shù)鹽度0溶解氧mg/LpH12345678存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)存活仔魚數(shù)鹽度9溶解氧mg/LpH評(píng)價(jià)人（簽名）：復(fù)核人（簽名）：15 DB44/T 2340.42021C附錄 C（規(guī)范性）VTG mRNA和AR mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定方法C.1肝臟樣品制備按50 mg/mL100 mg/mL加入TRIzol至含有肝臟組織的離心管，組織體積不超過(guò)TRIzol體積的10%，用電動(dòng)勻漿器勻漿1 min2 min。C

28、.2核酸提取C.2.1 TRIzol勻漿后的肝臟組織室溫放置5 min，使其充分裂解。12000 g離心5 min，棄沉淀。按每毫升TRIzol加入200L氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min，禁用渦旋振蕩器。4，12000 g離心15 min。C.2.2C.2.3吸取上層水相，至另一離心管中，按每毫升TRIzol加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置5 min10 min。4，12000 g離心10 min。C.2.4棄上清，RNA沉于管底，按每毫升TRIzol加入1 mL 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4，8000 g離心5 min。C.2.5C.2.6C.2.7盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5 min10 min。用50 L去離子水溶解RNA樣品，去離子水必須用DEPC處理并高壓滅菌。測(cè)OD值定量RNA濃度和純度。C.3反轉(zhuǎn)錄按SYBR GREEN法，具體操作按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒執(zhí)行。熒光定量PCR擴(kuò)增C.4C.4.1擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表C.1。表C.1 PCR擴(kuò)增引物序列引物名稱引物序列VTG-F:AATGCCATGTTCCTCAGCGAVTG-R:TCAGCTTCTCTGCACCCTTGAR-F: GTGGCGTACAACGAGTCCAGAR-R: TCATCGGAGCAGATCAGGCAACT-F:GGAAGGTGGACAG