轉(zhuǎn)基因分析的全球會議

1、第1次關(guān)于轉(zhuǎn)基因分析的全球會議“需要在國際和區(qū)域間協(xié)調(diào)統(tǒng)一“ Roger Wood 和和 Andrew Damant WC2B 6NH ，倫敦，帝國大道125號，民航大廈，食品標準局談及到廣義的、而不僅僅是轉(zhuǎn)基因生物時，應(yīng)包括以下幾點：食品法典和歐盟的實驗室質(zhì)量標準可接受的標準分析方法食品法典審議的方法，檢測和確定來自于生物技術(shù)的食品一般方法和標準方法測量不確定度方面（取樣和分析） 采用歐洲網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)基因生物實驗室轉(zhuǎn)基因檢測分析方法定義的最低性能要求（弊）從事控制進出口食品檢測實驗室評估能力的準則第8步在1997年6月的食品法典委員會上通過（見CAC/GL 27-1997)要求3 .下列標準應(yīng)被參

2、與食品進出口監(jiān)測的實驗室采納： ISO / IEC導則25 ： 1990規(guī)定了檢測實驗室應(yīng)遵守的一般標準“校準和監(jiān)測實驗室職權(quán)范圍的一般要求“ ; 注：現(xiàn)在改為英文的ISO / IEC 17025:2005 參加適當?shù)姆稀皣H統(tǒng)一議定書的（化學）分析實驗室的能力測試 “理論與應(yīng)用化學65 （1993）21322144;在1995年7月的第21屆會議上，已被食品法典委員會采納 規(guī)定要求的食品分析水平測試計劃 注：最新議定書理論與應(yīng)用化學， 2006，78 （ 1 ），145-196現(xiàn)已通過了食品法典委員會 凡提供、使用的分析方法應(yīng)該有以食品法典已審定的原則規(guī)定的根據(jù) 使用內(nèi)部質(zhì)量控制程序，如這

3、里所講的“分析化學實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制統(tǒng)一準則，“理論與應(yīng)用化學67（ 1995 ）649-6664 .上文提到參與評估的實驗室機構(gòu)應(yīng)遵守一般實驗室認可標準，如ISO / IEC導則58:1993中規(guī)定了 “校準和檢驗實驗室認可系統(tǒng)的通用操作與認可標準” 。 歐洲議會和2004年4月29 國會制定（ EC ）882/2004條例 官方控制以確保核查遵守飼料和食品法、動物健康和動物福利法規(guī)第11條 取樣和分析方法使用的采樣和分析方法應(yīng)遵守官方控制或相關(guān)社區(qū)的規(guī)則（ a ）如果沒有這樣的規(guī)則存在，以國際公認的規(guī)則或協(xié)議為準。例如歐洲標準委員會（CEN）已接受或在國家立法中商定的準則（ b ）若上述情

4、況均不存在，按與目的相符的其他方法或按照發(fā)達國家科學議定書執(zhí)行 凡第1款不適用的， 驗證的分析方法可采取發(fā)生在單個實驗室的符合國際公認協(xié)議的準則。 3 .附件三詳細列出了符合標準的所有可能的分析方法第12條 官方實驗室 1 .主管部門應(yīng)指定在官方控制可進行樣品分析的實驗室 然而，主管當局可能只指定實驗室，運營、評估以及認可按照以下歐洲標準執(zhí)行： EN ISO / IEC 17025 “能力測試和校準實驗室的一般規(guī)定” EN 45002 “評估測試實驗室的一般標準” EN 45003 “校準和測試實驗室認可制度通用的運作和認可準則”， 考慮到不同標準的測試辦法規(guī)定了通用的飼料和食品法。 （注：這

5、些提法現(xiàn)已更新與關(guān)于認證機構(gòu)的新的歐盟條例( 2008年6月23日通過 ？) )一致附件三：分析方法的特征分析方法應(yīng)符合以下標準特點： 準確性; 適用性（矩陣和濃度范圍內(nèi)） ; 檢測限; 限制度; 精度; 可重復性; 再現(xiàn)性; 恢復性; 選擇性; 敏感性; 線性; 測量不確定度; 可根據(jù)需要選擇的其他標準。 第1 （ e ）中提到的精確值應(yīng)通過一個已按國際認可的協(xié)議執(zhí)行的合作試驗賦予（例如：ISO 5725:1994或化學的國際統(tǒng)一協(xié)議）或按已有的依據(jù)標準兼容性測試的分析方法執(zhí)行。 重復性和有效值應(yīng)表示為國際公認的形式（如95 置信區(qū)間按ISO5725:1994或理論與應(yīng)用化學定義） 。協(xié)作實

6、驗的結(jié)果應(yīng)公開發(fā)表或免費提供。 分析方法只能在單一的實驗室予以審定的情況下，他們應(yīng)當按照化學統(tǒng)一的指導方針審定，或按依據(jù)標準兼容性測試已確定績效標準的分析方法執(zhí)行。 （單個實驗室驗證分析方法的化學統(tǒng)一指導方針（MichaelThompson, Stephen L R Ellison and Roger Wood,理論與應(yīng)用化學。 2002，74 （ 5 ），835-355 ）現(xiàn)已被歐盟和食品法典接受。 ）什么是標準的分析方法？為什么要引入？傳統(tǒng)的方法（具體的分析方法） 分析師被剝奪了選擇的自由，因此，某些情況下，不得不使用一些不恰當?shù)姆椒? 程序抑制了自動化的使用; 想改變無法令人滿意的或劣于

7、另一目前可用方法的分析方法，在行政上很難實施。標準方法（方法的表型特征） 這個“標準”的做法與目前食品法典和歐盟采用的程序相比，擁有更大的靈活性 在食品分析的某些領(lǐng)域中，提供了許多分析方法，其中有一些符合有關(guān)法規(guī)特點、但由于時間的限制還未經(jīng)食品法典或歐盟審議。 如:沒有具體規(guī)定的方法 但是， “標準法”也可能意味著接受由食品法典，歐盟等設(shè)定的單個標準 如:方法是否不夠好？法典委員會的分析和取樣方法 審議檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因食品的方法 一般方法和標準方法 （論文CX/MAS 08/29/8)）轉(zhuǎn)基因食品分析的審定和質(zhì)量控制要求指南考慮到： 標準的做法和已確定的特征（ LOD技術(shù)， LoQ等） 實驗室

8、質(zhì)量測量的不確定度基于DNA分析方法的附加要求 -擴增長度-是否有該方法的具體操作規(guī)則-定性和定量PCR檢測方法是否有區(qū)別 -是否能開展單一或多重P CR擴增基于蛋白質(zhì)方法的附加要求： -試劑應(yīng)與反應(yīng)時間所需耗試劑等量附件一：當一種轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法CCMAS表示贊同時，該信息可提供給食品法典方法的說明-該方法的目的和意義-科學依據(jù)-該方法所需要的規(guī)范的預測模型/數(shù)學模型方法的優(yōu)化信息-引物對/熒光寡核苷酸探針測試-選擇性測試-穩(wěn)定性測試-靈敏度測試-穩(wěn)定性測試-交叉反應(yīng) 實際應(yīng)用的方法-適用性-操作特點和實用性的方法-操作技能要求 分析控制需要指出的方法驗證/性能 -擴增長度-該方法是否是

9、儀器化的或化學特異性的 -是否需進行單一或多重P CR擴增-基于PCR技術(shù)和免疫學方法驗證的標準是否有差別附件二:適用于分析轉(zhuǎn)基因食品法典定義-精度-適用性-動態(tài)范圍-范圍的量化-檢測限（ LOD值） -定量限（ LOQ） -實用性-重復性標準偏差（ RSDr） -再現(xiàn)性標準偏差（ RSDR） -回復-穩(wěn)定性 -靈敏度-選擇性-真實性附件三：定量PCR審定法 每個特征給定和預期值的信息， 如：重復性標準偏差和再現(xiàn)性標準偏差信息分析控制驗收標準和給出結(jié)果的解釋信息 重復性標準偏差（ RSDr ） 建議：重復性相對標準偏差25 或接近這個值在該方法的整個動態(tài)范圍是可行的。 再現(xiàn)性標準偏差（ RSD

10、R ） 建議：再現(xiàn)性相對標準偏差35 或接近該值在標準濃度及大多數(shù)的動態(tài)范圍內(nèi)是可行的。 RSDR 50 左右是可行的極限的定量下限。 附件四：定性聚合酶鏈反應(yīng)方法的審定 附件五：基于蛋白質(zhì)方法的審定 定性和定量方法的審議 附件六：轉(zhuǎn)基因食品的水平測試 得分標準信息來自logtransformed 數(shù)據(jù)庫 注：問卷分析方法技術(shù)委員會/lap/rsccom/amc/amc_index.htm下載法典準則的測量不確定度(CAC/GL 54-2004) 引言使用ISO / IEC 17025:1999，分析師能意識到相關(guān)的每個分析結(jié)果的不確定性、并估計該不確定性，這是重要和必須

11、的。 測量的不確定性可能來自一些程序。為了達到食品法典的控制目的，食品分析實驗室被要求使用可行的通用的檢測或驗證方法，并在納入日常使用之前，驗證他們的程序。因此，這些實驗室提供了一系列可以用來估算其測量不確定度的分析數(shù)據(jù)。只適用于定量分析的準則 大多數(shù)定量分析結(jié)果采取 “a 2u 或 a U”的形式記錄 其中“a”是被測量濃度真實值（分析結(jié)果）的最優(yōu)估計，“u ”是 標準的不確定性，而“ U ” （相當于2u）是擴大 的不確定性。 “a 2u”代表了置信區(qū)間為95 的范圍， 即在該范圍內(nèi)找到的真實值可信度是95 。 “ U ” 或“的2 u” 常見于分析師的報告中， 以下簡稱“計量不確定性“

12、，可用不同方式進行估計。.結(jié)果在不確定度外，高于檢測限.結(jié)果高于檢測限，檢測限在不確定度內(nèi).結(jié)果低于檢測限，檢測限在不確定度以內(nèi).結(jié)果在不確定范圍內(nèi)，低于檢測限檢測上限 這意味著法典的規(guī)定和執(zhí)法界限是不同的 規(guī)范的制定應(yīng)該受到贊賞測量的不確定性是否同時適用于采樣和分析？ 測量不確定性適用于整個測量過程。 對于分析者來說，一直考慮單一的“分析” 測量不確定性，但現(xiàn)在越來越多地認識到必須對整個系統(tǒng)加以考慮，并且“抽樣” 測量不確定性的重要性正在日益增加。 法典委員會的分析和取樣方法 第29次會議，布達佩斯，匈牙利，2008，10/3-14/3 測量不確定性指導 （論文 CX/MAS 08/29/9

13、 ） 取樣不確定性指導 （論文 CX/MAS 08/29/9- Add 1.)同意： 準備分析測量確定性的近一步指導意見 進一步進行基于以下論文的討論： 歐洲分析化學組織 /國際分析化學溯源性合作組織 /波蘭華沙分析測量技術(shù)展/北歐技術(shù)試驗協(xié)作機構(gòu)指南關(guān)于“取樣測量不確定性的評估“和做好準備北歐技術(shù)試驗協(xié)作機構(gòu)報告604 （不是將來，現(xiàn)在立即行動 ） 目的的實施在于認真仔細的考慮- 難點在于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品部門的執(zhí)行！統(tǒng)一標準“一種歐洲的觀點” Andrew Damant英國食品標準局立法-1條例（ EC ）No 1829/2003- CRLGMFF法律規(guī)定第32條 CRL GMFF的操作按照條例（

14、 EC ）No 641/2004執(zhí)行-附件一規(guī)定給申請授權(quán)者提供檢測方法類型的參考信息 - 包括分析方法的信息-申請人還提供了與寄主側(cè)翼序列相鄰的完整插入序列以便構(gòu)建一種特異性事件檢測方法 還提供食品和飼料樣品以及對照樣品立法-2CRL - GMFF開展的活動與歐洲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇业木W(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)一致 ENGL“定義轉(zhuǎn)基因檢測分析方法的最低執(zhí)行需求” （ EC ）No 1981/2006條例-第6條和附件二提供一些國家實驗室關(guān)于協(xié)助CRL測試和驗證檢測與鑒定方法的參考細節(jié)驗證過程申請者/EFSA檢測方法不可信的潛在要求細節(jié)補充信息潛在要求” 測試停止“潛在要求EFSA接受對照樣品方法相關(guān)數(shù)據(jù)（第一步）科

15、學評估方法樣品文獻（第二步）CRL試驗測試樣品和方法（第三步）共同研究探討（第四步）結(jié)果報告（第五步）轉(zhuǎn)基因測試分析方法最低執(zhí)行需求的定義最初發(fā)表于2005年第一階段（步驟2和3 ） - 由申請人提交的執(zhí)行方法數(shù)據(jù)和部分官員檔案的評估;第二階段（第4步） 協(xié)作試驗之后的全面確認研究的執(zhí)行，方法、數(shù)據(jù)的評估 目前正在修訂第一階段 接受標準的方法實用性 方法的實用范圍，分析方法的參考等可行性 設(shè)備 時間 實際困難特異性 特異性事件活動范圍 包括1/10th和至少和至少5目標濃度目標濃度 精確度 在參照值 25%以內(nèi)以內(nèi) R2系數(shù)系數(shù) 0.98 PCR效率 -3.1斜坡 -3.6RSDr 超過整個動

16、力學范圍 25 LOQ 1/10th的目標濃度,并且RSDr 25 LOD值 1/20th的目標濃度的目標濃度 穩(wěn)定性 偏離不超過30第二階段 執(zhí)行需求的方法 RSDR 35 的目標濃度， 50 終濃度 0.2 真實性 超出整個范圍在公認的參考 值值 25%以內(nèi)以內(nèi)標準是否滿足？適用性 ？可行性 特異性 動態(tài)范圍 精確性 ？ R2的系數(shù) PCR效率 RSDr LOD LOQ 穩(wěn)定性 ？RSDR 真實性 問題？目前為止，已進行了 32個協(xié)作試驗 -3 花粉（提取+ R T- PCR法） RSDR = 17.7 至43.9 -29的DNA（僅R T- PCR檢測） RSDR = 12 至33.5 獲得的大多數(shù)精確數(shù)據(jù)只涉及RT - PCR檢測（即D