第五章減壓柱色譜分離技術(shù)

1、第五章第五章減壓柱色譜減壓柱色譜分離技術(shù)分離技術(shù)為加快柱分離的速度和/或增加分離度，通常采用在柱前加壓和柱后減壓的方法進(jìn)行柱層析與分離。柱前加壓法通常稱(chēng)為加壓柱色譜柱后減壓法通常稱(chēng)為減壓柱色譜第一節(jié)第一節(jié)真空液相色譜技術(shù)真空液相色譜技術(shù)VacuumLiquidChromatography第二節(jié)第二節(jié)半干柱液相色譜半干柱液相色譜Semi-DryColumnChromatographySDC第一節(jié)第一節(jié)真空液相色譜技術(shù)真空液相色譜技術(shù)VacuumLiquidChromatography真空液相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)VLC，也稱(chēng)減壓液相色譜法。是近幾年來(lái)國(guó)外實(shí)驗(yàn)室迅速發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，它是利用柱后減壓使洗脫劑

2、迅速通過(guò)固定相從而很好的分離樣品的色譜技術(shù)。VLC具有快速，簡(jiǎn)易，高效，價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功的應(yīng)用于有機(jī)制備以及天然產(chǎn)物如萜類(lèi)，類(lèi)酯，雙萜及多種生物樣品的分離。由于經(jīng)典的柱層析費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要大量的固定相和洗脫液，工作效率低，為此人們相繼建立了離心薄層、VLC、FCC等快速層析分離的方法。其中VLC在天然產(chǎn)物分離中應(yīng)用最多。該法1969年由澳大利亞CollJ.C提出，1977年首次應(yīng)用于分離澳洲軟珊瑚中2個(gè)新的二萜化合物(Cembrenoids).1979年美國(guó)Targett.NM將該法命名為Vacuumliquidchromatography(VLC),并且詳細(xì)報(bào)道了實(shí)驗(yàn)裝置和操作方法。從此

3、以后，VLC便逐漸為廣大化學(xué)家所接受，并且在實(shí)驗(yàn)裝置上作了進(jìn)一步改進(jìn)。一、一、VLC特點(diǎn)特點(diǎn)V L C 實(shí) 質(zhì) 上 是 柱 色 譜 ， 它 綜 合 了 制 備 薄 層（PreparativePTLC）和真空抽濾技術(shù)。VLC不同于常壓柱層析和快速柱層析Fcc，因?yàn)楹髢烧呦疵搫┦沁B續(xù)的，在操作中不會(huì)間斷；而VLC進(jìn)行溶劑洗脫時(shí)，在加洗脫劑后，在柱后減壓下全部抽出，每一次洗脫收集一次，抽干后，再更換溶劑，并再進(jìn)行下一個(gè)流分的收集，所以在這一點(diǎn)上VLC與PTLC多次展開(kāi)極為相似。（展開(kāi)一次后吹干，再展）。FCC采用柱前加壓，而VLC采用柱后加壓。VLC可分離樣品量達(dá)幾十克，而FCC只能分離幾克。VLC

4、吸附劑經(jīng)處理后可反復(fù)使用。二、實(shí)驗(yàn)裝置與操作二、實(shí)驗(yàn)裝置與操作1986年，Coll和Bowden曾介紹過(guò)一種十分簡(jiǎn)單的用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的減壓液相色譜法裝置（圖a,b）。Pelletier在1986年，介紹可使用于較大規(guī)模的分離的裝置（圖2）1.固定相；常采用TLC用硅膠、Al2O3,（粒度：10um40um硅膠60H或60G）聚酰胺等2.裝柱：干法裝柱法。將吸附劑裝入漏斗或短柱中，輕輕拍緊或減壓拍打或從頂端擠壓，直至吸附劑緊密，最后變得堅(jiān)硬。吸附劑的高度一般不超過(guò)5cm。3，吸附劑用量：（1）對(duì)于微量分離，樣品100mg,可采用直徑為0.51cm色譜柱或漏斗，吸附劑高度為5cm，一般固定相用量

5、為1015：1倍，如圖4-a,可在小試管中收集流分。（2）對(duì)于0.51.0g樣品，柱中裝有2.54cm高度的吸附劑較合適。（3）對(duì)于110g樣品的分離，可在柱中裝入55cm的吸附劑。（4）較大樣品分離，最好采用250ml砂芯漏斗中進(jìn)行。吸附劑的高度為5cm。（如圖b）可用三角燒瓶收集之。加大吸附劑與樣品比例，可提高分離度。常用比例為30：1300：1三、上樣三、上樣放掉真空后，常壓下加入低極性溶劑于吸附劑表面上，減壓使溶劑均勻流過(guò)吸附劑。如有空隙，需要重裝。使柱子抽干后，重復(fù)12次，即可準(zhǔn)備上樣。A用低極性溶劑或洗脫劑（如石油醚、用低極性溶劑或洗脫劑（如石油醚、正己烷）溶解樣品正己烷）溶解樣品

6、。常壓下小心加入柱頂端，再加入洗脫劑或溶劑覆蓋吸附劑表面，慢慢減壓，使樣品在柱頂端形成樣品層。B可也采用固體上樣法可也采用固體上樣法。即先將樣品溶于極性溶劑，加入510份吸附劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加到吸附劑的表面上，然后進(jìn)行洗脫。四，四，VLC流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇與柱層析相同，先用TLC來(lái)選擇條件。VLC更適用于梯度洗脫，可用二元，三元混合溶劑系統(tǒng)。一般先用極性較小溶劑，如石油醚、正己烷、環(huán)己烷，然后逐漸加大極性（CH2Cl2、Et2O、AcOEt、CH3OH）極性溶劑的增加開(kāi)始要緩慢（1%，2%，3%等），然后增加的幅度可逐漸增大（5%10%20%等），通常收集2025個(gè)流分可將所有成分洗脫。

7、五、洗脫與收集五、洗脫與收集用適當(dāng)溶劑系統(tǒng)洗脫或用梯度洗脫（gradientelution）。在常壓下，加入溶劑后，將柱抽干，收集為一個(gè)流分。真空度要求2070mmHg；抽干后再更換溶劑和容器，重復(fù)以上操作，并用TLC跟蹤每一個(gè)流分的分離情況（先摸一摸再行動(dòng)）。為避免每一流分拆卸漏斗，可采用圖B的方法，該抽濾甁底部為磨口，減去負(fù)壓后，更換接受甁。六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例1.VLC法可用于合成反應(yīng)混合物的分離法可用于合成反應(yīng)混合物的分離delphinine(翠雀花堿)于220，01mmHg下發(fā)生裂解反應(yīng)，生成Pyrodelphine(焦翠雀靈)兩者的混臺(tái)物用甲苯：丙酮24：1洗脫，得到896mg

8、Pyrodelphinines;甲苯：丙19：1洗脫，得到108mgDelphinine分離全程僅僅花費(fèi)2小時(shí)2.VLC法用于多種天然化合物的分離法用于多種天然化合物的分離（1）曾有人用）曾有人用VLC法對(duì)姜中辛辣成分的分離法對(duì)姜中辛辣成分的分離先將冷凍干燥的姜粉用丙酮提取，經(jīng)過(guò)一系列溶劑分先將冷凍干燥的姜粉用丙酮提取，經(jīng)過(guò)一系列溶劑分配后，得所需部位。配后，得所需部位。選用一內(nèi)徑為選用一內(nèi)徑為3.5cm的的100ml的布氏漏斗內(nèi)裝硅膠的布氏漏斗內(nèi)裝硅膠60（4063m,Merck公司）公司）9.5g,高度高度3cm.300mg姜提取物的溶液與硅膠姜提取物的溶液與硅膠60混和，蒸發(fā)除去溶劑混和

9、，蒸發(fā)除去溶劑后，均勻分布于硅膠柱床表面上，并在樣品表面上覆后，均勻分布于硅膠柱床表面上，并在樣品表面上覆蓋一張與漏斗內(nèi)徑相同的濾紙，緩緩加入蓋一張與漏斗內(nèi)徑相同的濾紙，緩緩加入25ml的己烷。的己烷。待溶劑透過(guò)柱床后，開(kāi)始減壓抽干柱床，得第一流分。待溶劑透過(guò)柱床后，開(kāi)始減壓抽干柱床，得第一流分。繼續(xù)用極性增大的溶劑（己烷乙醚乙醚甲醇）繼續(xù)用極性增大的溶劑（己烷乙醚乙醚甲醇）洗脫，每份洗脫，每份25ml，共得共得20份洗脫液，利用該法可將姜份洗脫液，利用該法可將姜醇與姜烯酚完全分開(kāi)。醇與姜烯酚完全分開(kāi)。（2）l0克pH9-12的Acontiumcolumbianum粗提生物堿混合物，使用65g

10、TLC用Al2O360(Merck,Hbasic,TypeE，EM1085)甲苯：氯仿1：4(VV)洗脫，于28-30號(hào)流份中得到talatizamine(3)265mg;氯仿:甲醇19：1洗脫，于35-36號(hào)流份中分離得到cammaconine(4)247mg。從兩個(gè)化臺(tái)物結(jié)構(gòu)來(lái)看，只是在C18位上有細(xì)微差別若采用PTLC法分離，操作極其繁瑣、費(fèi)時(shí)，且消耗大量吸附劑與展開(kāi)劑兩法相比，VLC明顯優(yōu)于PTLC（3）利用VLC成功分離海洋腔腸動(dòng)物的正己烷提取物將在日本沖繩近海采集到的一種軟珊瑚腔腸動(dòng)物Anemoniasulcatas切碎后用丙酮浸出，浸液濃縮后用正己烷提取，得提取物12.5g,溶解

11、于70ml正己烷：乙酸己酯8：2的混合溶劑，用滴管將此溶液均勻添加到硅膠表面抽真空，洗脫溶劑從正已烷開(kāi)始，直至最后用乙酸乙酯，梯度洗脫，每次收集200mL，共收集2L，耗時(shí)2小時(shí)結(jié)合TLC和核磁共振譜，非常滿(mǎn)意地分離和確定了10余種萜類(lèi)、脂肪酸及其酯、甾體化臺(tái)物(見(jiàn)圖)若用常壓柱層橋，需要370g硅膠，費(fèi)時(shí)30小時(shí)，耗用10L溶劑，才得到同樣的效果七七.小小結(jié)結(jié)綜上所述，與常壓柱層析和快速柱層析相比，真空柱層析具有以下特點(diǎn)：a分離操作時(shí)間短，一般僅需數(shù)個(gè)小時(shí)，b裝置簡(jiǎn)單、易得，裝柱方便，且要求不高，c分離效果好，這主要是由于固定相的細(xì)小顆粒(平均10m)、較大的表面積(500m2/g)和合理的

12、裝柱方法的原因，dVLC處理量大分離幾十克的樣品，仍能以較快的速度完成。在FCC中，由于玻璃分離柱的限制，處理6g以上的樣品時(shí)就常困難常壓柱層析雖然沒(méi)有樣品量的限制，但是極其耗時(shí)，所用的固定相的量亦很大，e.VLC特別適用于頻繁的梯度淋洗，并可使固定相抽干，這又是FCC和常壓柱層析無(wú)法做到的，fVLC可以作為進(jìn)行HPLC分離前的較理想的預(yù)處理方法VLC法也有不足在使用低沸點(diǎn)溶劑(如石油醚)時(shí)要嚴(yán)格控制好真空度，防止大劑量溶劑揮發(fā)。第二節(jié)第二節(jié)半干柱液相色譜半干柱液相色譜Semi-DryColumnChromatographySDC半干柱液相色譜半干柱液相色譜即在柱后減壓時(shí)將固即在柱后減壓時(shí)將固

13、定相抽之半干的液相色譜。定相抽之半干的液相色譜。PeterVinezev等1991年報(bào)道利用半干柱液相色譜法對(duì)Wittig反應(yīng)中的差向異構(gòu)體的分離。一、色譜柱的制備一、色譜柱的制備應(yīng)用砂芯漏斗或短層析柱，裝入1：1硅膠60（70230目）與硅膠HF（薄層層析用規(guī)格）的混合物。硅膠床的高度5-8cm，再高對(duì)分離結(jié)果無(wú)明顯提高。對(duì)于較大量樣品的分離可用較大的砂心漏斗，同樣可以得到較好的分離效果。有關(guān)SDC的實(shí)際操作數(shù)據(jù)包括漏斗直徑，裝入硅膠量，每一洗脫劑量及被分離樣品的關(guān)系見(jiàn)表：IIIIIIIVV漏斗直徑200120906540packing：硅膠6070230目5002001003010硅膠HF5002001003010每一流分體積1608060308樣品量（g）30501030110150.11二、洗脫與分離二、洗脫與分離：1.首先用洗脫劑流經(jīng)吸附劑，抽濾至近干，約有1滴/12秒洗脫液流下。或用濕潤(rùn)的硅膠裝柱，吸濾至干，再加40體積的濾液到漏斗中，抽至與吸附劑一直的水平面下。2.樣品溶