第七章 細胞培養(yǎng)及動力學1

1、第七章第七章 細胞培養(yǎng)技術及動力學細胞培養(yǎng)技術及動力學 Operation of bioreactor 反應器操作1. Batch operation 間歇反應 Periods of operation for batch operation1. Batch operation2. Semi-continuous or fed-batch operation 半連續(xù)操作3. Continuous operation 連續(xù)操作 本章主要分析討論間歇培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)這兩種基本方法，然后對其它培養(yǎng)方法進行擴展討論。7.1 微生物反應過程的計量學 化學計量學： 是對化學反應的組成和化學反應轉化程度的數量

2、化研究。 A+B C+D 元素平衡法 化學計量學 反應工程學 反應熱力學 反應動力學 根據化學計量學，可知有關反應過程中各種反應組分的數量關系。 研究化學計量學的目的是對反應過程進行控制和優(yōu)化，爭取獲得最大的經濟收益。 微生物反應過程的計量學：碳源（多種）+氮源（多種）+無機鹽（多種）+有機生長因子（多種）+水+氧氣 細胞+主產物+副產物（多種）+二氧化碳 對于微生物反應過程，由于參加反應的組分多，代謝途徑錯綜復雜，同時微生物在生長，并且微生物菌體也不能用摩爾摩爾的對應關系表示其計量關系。所以要用元素平衡的方法對微生物反應進行計量，將是十分復雜和困難的。 工程上又不能回避這個問題，每一個工業(yè)化

3、的微生物反應過程都需要計量。 人們提出了一個相對簡單的方法，就是引入得率系數（Yield coefficients）的概念，作為描述微生物反應中計量關系的宏觀參數。 得率系數有以下幾種定義：得率系數有以下幾種定義： 1、對基質的細胞得率Yx/s (Monod提出的) Yx/s= =生成細胞的質量生成細胞的質量消耗基質的質量消耗基質的質量x-s 在分批培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的組分在不斷地變化，因此在培養(yǎng)過程中細胞得率系數不能視為常數，在某一瞬時的細胞得率稱為微分細胞得率（或者稱為瞬時細胞得率）。 分批培養(yǎng)過程，總的細胞得率為： Yx/s x0、s0：反應開始時細胞和基質濃度 xt、st：反應結束時細胞和

4、基質濃度xt - x0s0 - st 2、對碳的細胞得率Yc 考慮碳源基質時，無論是需氧還是厭氧培養(yǎng)，宏觀上碳源的一部分被同化為細胞組成物質，其余部分分別被異化、分解為二氧化碳及其它代謝產物。 為了表示由碳源同化為細胞組成物質過程的轉化效益，采用對碳的細胞得率Yc Yc= Yc 1 Log phase x對數增加 =常數 減速生長期 x增加緩慢 4 3 Stationary phase x無凈生長 =0 Death phase x減少 KS) Monod模型是典型的均衡生長模型，其基本假設如下： （1）描述細胞生長的唯一變量是細胞濃度X； （2）培養(yǎng)基中只有一種基質是生長限制性基質，其他組分均

5、過量； （3）細胞的生長視為單一反應，細胞得率為常數，當SKS時， = m ， 與 S是零級動力學關系； 什么是限制性底物 (Limited substrate)？ 可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關的營養(yǎng)物，只要該營養(yǎng)物相對貧乏時，就可能成為限制微生物生長的因子，可以是C源、N源、無機或有機因子。 那么營養(yǎng)物質相對貧乏指的是多少量呢？ 是指該物質的濃度低于比生長速率達m時對應的最低底物濃度Scrit時的情形。 Scrit稱為臨界底物濃度，任一營養(yǎng)物質的濃度若高于Scrit則為非限制性底物，低于Scrit即為限制性底物。 SScrit 所以限制性底物就是在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質中，對微生物的

6、生長起到限制作用的營養(yǎng)物。 = m 莫諾方程表面上與米氏方程同型。但是Monod方程來自于對實驗現象的總結，而米氏方程是根據酶促反應機理推導出的。前者是經驗方程，后者是機理方程。 SKS + S 莫諾方程中的動力學常數m和KS可以用倒數作圖法得出。 Hanes作圖 用前一方程圖解時，可得到相當精確的m值，但在低S值時，的偏差較大，影響KS值的精度。第二方程好用一些，在低S值時精度高。也可用線性回歸方法。1=1m+KSm1SS=1m+KSm S一些典型的m和KS值 可見，典型的ks值很小，實驗時用的底物濃度很小，這樣低的s值，又要快速測出它的變化量，那就要采用極為靈敏的、準確的測定底物和菌體濃度

7、的方法，才能通過測定間歇培養(yǎng)的初速度反應來測定ks值。 Monod方程適用于許多微生物生長過程，但是因該方程表述簡單，不足以完整地說明復雜的生化反應過程，已發(fā)現它在某些情況下與實驗結果不符，因此人們又提出了另外一些方程來描述微生物的生長。 如Powell提出的： = m 考慮到細胞壁的滲透性和基質的擴散性，引入KD因子，稱為擴散阻力常數。 S（KS + KD） + S2.3 有抑制的細胞生長動力學 （1）Substrate inhibition kinetics 與酶促反應類似，有時當培養(yǎng)基中某種基質的濃度高到一定程度時后，細胞的比生長速率隨該基質濃度的升高而下降，表現出基質的抑制，提出了一些

8、描述基質抑制的生長動力學模型。 (S)= K=inhibition constantm SKS + S + S2/K（1）Substrate inhibition kineticsmKSKIS 當S= 細胞的生長速率達最大，其值為：KS KISKS /KISm 1+2KS /KIS舉例：1 乳酸和酒精的雙邊發(fā)酵 2 流加培養(yǎng)(2) Production inhibition kinetic 細胞的一些代謝產物有時會影響細胞的生長，如酵母在厭氧條件下產生的乙醇會抑制酵母的生長，乳酸菌產生的乳酸會抑制乳酸菌的生長。 (S, P)= -P = product concentration -Pm= p

9、roduct concentration where =0m SKS + S1-PPm1-PPm(2) Production inhibition kinetic幾種產物抑制類型 1. 線性； 1a. 一級下降； 2和2a. 先不影響后下降； 3. 突然終止；2.4 基質消耗動力學 在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基質的減少是由于細胞和產物的生成。可以用細胞得率系數Yx/s把基質消耗速率和細胞生長速率相關聯。 如果限制性基質是碳源，消耗的碳源的一部分形成細胞質，一部分形成產物，一部分產生能量供細胞維持生命活動之用。即： 其中YG細胞的生長得率系數g/molm細胞的維持系數mol/gs；YP產物得速率系數mol/gs2.5 產物生成動力學Product formation rates 微生物反應生成的代謝產物多種多樣，其產物生成動力學遠比菌體生長動力學復雜。 發(fā)酵產物的生成速率與菌體生長速率之間大致存在三種不同類型的關聯。 (1)生長偶聯型 Growth associated products (2)部分生長偶聯型Mixed growth associated products (3)非生長偶聯型Nongrowth associated products 以上我們討論了細