《法醫(yī)物證鑒定動(dòng)物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范》

1、ICS點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類(lèi)號(hào)DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 34/ XXXXXXXXX法醫(yī)物證鑒定動(dòng)物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范點(diǎn)擊此處添加標(biāo)準(zhǔn)英文譯名點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)XXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實(shí)施安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB/ XXXXXXXXX前 言本技術(shù)規(guī)范按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。 本技術(shù)規(guī)范由安徽省司法廳提出。 本技術(shù)規(guī)范由安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局歸口。 本技術(shù)規(guī)范起草單位：安徽新萊蒂克司法鑒定中心、安徽仁吉康生物

2、技術(shù)有限責(zé)任公司、安徽省司法鑒定協(xié)會(huì)。 本技術(shù)規(guī)范主要起草人：張黎黎、鮑加琪、趙莎莎、王陳成、余春曉、王彪、許云斐、劉慧。法醫(yī)物證鑒定動(dòng)物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范1 范圍本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了安徽省司法鑒定機(jī)構(gòu)法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA種屬鑒定的基本要求、檢驗(yàn)程序、質(zhì)量控制、鑒定意見(jiàn)和鑒定文書(shū)。本技術(shù)規(guī)范適用于安徽省法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室對(duì)含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）的物種來(lái)源進(jìn)行確認(rèn)，確認(rèn)范圍為獸類(lèi)（包括人）、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，

3、其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GA/T 382-2014 法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范GA/T 383-2014 法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范SF/Z JD0105008-2018 法醫(yī)物證鑒定線粒體DNA檢驗(yàn)規(guī)范SF/T 0069-2020 法醫(yī)物證鑒定實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范SN/T 4626-2016 DNA條形碼物種鑒定操作規(guī)程CNAS-CL08:2018 司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則CNAS-CL08-A002:2018 司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則在法醫(yī)物證 DNA 鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1 法醫(yī)物證鑒定鑒定人運(yùn)用法醫(yī)物證學(xué)

4、的科學(xué)技術(shù)或者專(zhuān)門(mén)知識(shí)，對(duì)各類(lèi)生物檢材進(jìn)行鑒別和判斷并提供鑒定意見(jiàn)的活動(dòng)。3.2 DNA種屬鑒定DNA種屬鑒定指的是通過(guò)DNA序列分析對(duì)生物檢材的種屬來(lái)源進(jìn)行鑒定。廣義上的種屬鑒定包括動(dòng)植物的類(lèi)屬確定，狹義的種屬鑒定指的是動(dòng)物的生物檢材的種屬來(lái)源鑒定，即確定檢材是否屬于人體所有，有時(shí)還要確定檢材屬于何種動(dòng)物。3.3 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記是指在DNA序列分析中用作標(biāo)記的基因，也稱(chēng)為標(biāo)記基因。3.4 線粒體 DNA 線粒體DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）是指位于線粒體中的DNA，呈雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。常用的遺傳標(biāo)記有控制區(qū)、12SrRNA、16SrRNA、細(xì)胞色

5、素c氧化酶亞基（Cytochrome c oxidase subunit I gene, CO I）以及細(xì)胞色素b（Cytochrome b, Cyt b）等。3.5 BLAST比對(duì)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是基于局部序列比對(duì)，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行快速搜索，其特點(diǎn)是僅搜索序列之間高度相似的區(qū)域，可以兼顧到搜索的精確性和搜索速度，是目前應(yīng)用最廣泛的序列相似性搜索工具之一。 BLAST 的運(yùn)行方式是先用目標(biāo)序列建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)里面的每一條序列為目標(biāo)序列，然后用查詢(xún)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的目標(biāo)序列做兩兩序列局部比對(duì)，從而得到全部比對(duì)結(jié)果。包括BLASTN和BL

6、ASTP，BLASTN是將給定的核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較；BLASTP是使用蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較。本規(guī)范應(yīng)用的是BLASTN。3.6 基因序列相似度基因序列相似度（Sequence similarity）是指進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，檢測(cè)序列與目標(biāo)序列之間相同DNA堿基數(shù)與檢測(cè)序列全部堿基數(shù)的比值。3.7 MSPMSP（Maximum-scoring segment pair）代表在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast檢索時(shí)，與被檢測(cè)序列相似度最高的序列。3.8 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Phylogenetic trees）是表明被認(rèn)為具有共同祖先的各物種間演化關(guān)系的樹(shù)。4 基本要求4.

7、1 鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)具有從事法醫(yī)物證的執(zhí)業(yè)范圍，且應(yīng)滿(mǎn)足如下要求： a) 對(duì)所有影響鑒定結(jié)果的人員崗位規(guī)定相應(yīng)的能力要求，包括教育、資質(zhì)、培訓(xùn)、專(zhuān)業(yè)知識(shí)、技能等，并保留相關(guān)記錄；制定適宜的培訓(xùn)計(jì)劃并組織實(shí)施； b) 依據(jù)鑒定方法和要求對(duì)鑒定人以及參與鑒定工作的人員進(jìn)行監(jiān)督，以評(píng)價(jià)其鑒定工作的符合性和滿(mǎn)意程度；監(jiān)督的結(jié)果應(yīng)作為培訓(xùn)需求評(píng)價(jià)的依據(jù)之一； c) 具有能識(shí)別樣本的標(biāo)識(shí)系統(tǒng)，并確保樣本在鑒定過(guò)程期間能得到持續(xù)的識(shí)別； d) 建立樣本的運(yùn)輸、接收、處置、保護(hù)、存儲(chǔ)、保留和/或清理的規(guī)定，應(yīng)對(duì)接收、內(nèi)部傳遞、處置、保留、返還和清理等過(guò)程進(jìn)行記錄，確保記錄的完整性和可追溯性。 4.2 鑒定人應(yīng)具有法

8、醫(yī)物證鑒定執(zhí)業(yè)資格，熟悉并掌握線粒體DNA檢驗(yàn)的方法和原理，并能正確評(píng)價(jià)結(jié)果。 4.3 鑒定活動(dòng)應(yīng)包括檢驗(yàn)（采樣、DNA提取和純化、DNA定量分析、DNA測(cè)序、遺傳信息分析）、鑒定意見(jiàn)判斷、鑒定文書(shū)撰寫(xiě)等環(huán)節(jié)。鑒定活動(dòng)完畢后，應(yīng)將各個(gè)環(huán)節(jié)的記錄進(jìn)行歸檔。5 檢驗(yàn)程序5.1 采樣要求5.1.1 含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）均可采集。5.1.2 樣本應(yīng)分別包裝，注明編號(hào)、采樣日期等。5.1.3 樣本采集后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或冷凍保存（注：冷凍保存溫度為-20，時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月）。5.2 DNA 提取和純化按照GA/T 383-2014中附錄A的方法執(zhí)行。5.

9、3 DNA 定量分析按照GA/T 383-2014中6.16.3的方法執(zhí)行。5.4 MtDNA測(cè)序根據(jù)需要，可選擇單個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記，通過(guò)Primer數(shù)據(jù)庫(kù)獲取通用引物，或自行設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。本技術(shù)規(guī)范提供了兩個(gè)通用引物的體系示例供參考，操作如下：a) PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增體系：反應(yīng)組分原濃度終濃度10× PCR Buffer10×1×MgCl2（mmol/L）251.25dNTPs（mmol/L）100.2Taq 酶（U/L）20.05引物（mol/L）1.250.25模板DNA（ng/L）5-251-5ddH2O12SrRNA引物對(duì)：F：5&

10、#39;-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'R：5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'CO I引物對(duì)：F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR 擴(kuò)增條件：95，5 min；95 30 s，55 40 s，72 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72，7 min。b) 測(cè)序利用遺傳分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，得到DNA序列信息。5.5 遺傳信息分析5.6.1 BLAST比對(duì)獲得的DNA序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的在

11、線序列Blast工具()，在數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。5.6.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 根據(jù)Blast搜索結(jié)果，當(dāng)MSP有多個(gè)物種序列時(shí)，下載這些物種的基因序列，同時(shí)下載遠(yuǎn)源物種的基因序列作為外群序列。利用專(zhuān)業(yè)分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。6 質(zhì)量控制從事DNA種屬鑒定的實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)該包括以下質(zhì)量控制措施： 6.1 對(duì)照設(shè)置 為保證DNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求每次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：PCR擴(kuò)增添加Control DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照包括：（1）提取試劑的空白對(duì)照，用于監(jiān)控從提取到分析環(huán)節(jié)是否存在污染；（2）PCR試劑的空白

12、對(duì)照，用于監(jiān)控從擴(kuò)增到分析環(huán)節(jié)是否存在外源DNA污染。6.2 雙向測(cè)序 為避免潛在的異質(zhì)性影響和保證結(jié)果的可靠性，宜進(jìn)行正、反鏈雙向測(cè)序。 6.3 污染防控 根據(jù)CNAS-CL08-A002:2018法醫(yī)物證DNA實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)要求，從事DNA種屬鑒定實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采?。ǖ幌抻冢┮韵麓胧┮苑乐刮廴荆篴)檢材在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)間的單向流動(dòng)；b)做好實(shí)驗(yàn)人員的自身防護(hù)，如使用個(gè)人防護(hù)裝備，包括作業(yè)服、一次性使用手套、一次性使用口罩和一次性使用發(fā)罩，并根據(jù)具體情況及時(shí)更換；c)做好設(shè)備、設(shè)施的定期清理和消毒；d)具備實(shí)驗(yàn)區(qū)的外部屏障，能有效阻止無(wú)關(guān)人員未經(jīng)許可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)。 7 鑒定意見(jiàn)7.1 根據(jù) DNA 檢驗(yàn)結(jié)果的遺傳信息分析進(jìn)行鑒定意見(jiàn)判斷。 7.2 鑒定意見(jiàn)判斷可參考以下原則： a） 當(dāng)檢測(cè)序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動(dòng)物為單個(gè)物種時(shí)，可認(rèn)為MSP所代表動(dòng)物與檢材所屬動(dòng)物為同一種； b） 當(dāng)檢測(cè)序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動(dòng)物為多個(gè)物種時(shí)，