愛(ài)玉種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

1、寧德師范學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）愛(ài)玉種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析ISSR Analysis on Genetic Diversity of Ficus pumila var.awkeotsang Germplasm Resources院 系 ：生物系專(zhuān)業(yè)（班級(jí)）：2010級(jí)生物技術(shù)2班姓 名：吳澤江學(xué) 號(hào):B2010072205指導(dǎo)教師：史輝職 稱(chēng)：副教授完成日期： 2014年 5 月 1 日寧德師范學(xué)院教務(wù)處制摘 要 研究愛(ài)玉品種分類(lèi)、起源進(jìn)化關(guān)系，為育種工作提供理論基礎(chǔ)。采用ISSR-PCR分子標(biāo)記方法對(duì)24個(gè)愛(ài)玉品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。從100 條ISSR引物中篩選出17條擴(kuò)增清晰、重

2、復(fù)性和多態(tài)性好的引物，從中選取4條多態(tài)性最強(qiáng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和遺傳聚類(lèi)分析。結(jié)果表明：4條引物共擴(kuò)增出48個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)43個(gè)，多態(tài)性百分率為89.6%，這4條引物可以將愛(ài)玉品種之間遺傳差異完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。利用聚類(lèi)分析和主坐標(biāo)分析，可以將24個(gè)愛(ài)玉種質(zhì)資源聚分為4大類(lèi)，為愛(ài)玉種質(zhì)的鑒定奠定良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：愛(ài)玉；ISSR；遺傳多樣性；親緣關(guān)系A(chǔ)bstract We study cultivars classification of Ficus pumila var.awkeotsang, and relationship of origin and evoluti

3、on relationship, which will provide a theoretical basis for breeding work. ISSR-PCR was used to detect the genetic diversity and relationship of 24 Ficus pumila var.awkeotsang cultivars. 17 primers that are amplified clear, good repeatability and polymorphism were screened from100 ISSR primers. And

4、then 4 polymorphic primers were selected from the strongest of amplification, and their amplification results were used to do statistical analysis and analysis of genetic clustering. It was found that the 48 sites were found by 4 primers, and 43 sites showed polymorphism, the percentage of polymorph

5、ism loci was 89.6%, and the difference of Ficus pumila var.awkeotsang cultivars can be completely separated by the 4 ISSR primers. 24 Ficus pumila var.awkeotsang cultivars can be divided into four groups by Cluster analysis and principal coordinate analysis, which lays a good foundation for the iden

6、tification of Ficus pumila var.awkeotsang germplasm.Key words: Ficus pumila var.awkeotsang; ISSR; Genetic diversity; Genetic relationship目 錄1 引 言11.1 愛(ài)玉簡(jiǎn)介11.2 ISSR在植物遺傳多樣性研究中的運(yùn)用11.2.1 品種鑒定和親緣關(guān)系分析11.2.2 物種群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究21.3 本研究的目的及意義22 材料與方法32.1 材料32.1.1 試材32.1.2 試劑32.1.3 儀器32.2 方法32.2.1 基因組DNA提取和純度檢

7、測(cè)32.2.2 ISSR引物的篩選和退火溫度優(yōu)化42.2.3 愛(ài)玉群體的ISSR-PCR分析42.2.4 數(shù)據(jù)分析43 結(jié)果與分析43.1 愛(ài)玉基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)43.2 ISSR引物篩選及退火溫度優(yōu)化53.3 愛(ài)玉ISSR-PCR遺傳分析63.3.1 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析63.3.2 愛(ài)玉品系遺傳多樣性分析83.3.3 愛(ài)玉品系遺傳分化的主坐標(biāo)分析94 討 論11致 謝13參 考 文 獻(xiàn)14愛(ài)玉種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析1 引 言1.1 愛(ài)玉簡(jiǎn)介愛(ài)玉（Ficus pumila L.var.awkeotsang）是一種桑科榕屬常綠大藤本野生植物，雌雄異株。愛(ài)玉的主要產(chǎn)地為臺(tái)灣

8、嘉義縣和南投縣，1996年臺(tái)灣林業(yè)專(zhuān)家胡大維教授首次將其引種至福建1。主要分布于我國(guó)的福建省東北部、浙江南部和臺(tái)灣。愛(ài)玉瘦果制成的愛(ài)玉凍是一種高貴的天然食品，富含果膠、維生素和礦質(zhì)元素，而且低脂、低糖、低熱量，符合當(dāng)代人的飲食風(fēng)尚，故可作為低脂低熱食品研發(fā)的重要資源，具有良好的應(yīng)用前景。1.2 ISSR在植物遺傳多樣性研究中的運(yùn)用ISSR（Inter-simple sequence repeats，ISSR）又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增，是一種新型的分子標(biāo)記，由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz于1994年創(chuàng)立。ISSR技術(shù)是在微衛(wèi)星（Simple sequence repeats，SSR）

9、標(biāo)記技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高和產(chǎn)物特異性強(qiáng)等特點(diǎn)2，廣泛應(yīng)用于物種鑒定、遺傳作圖、基因定位、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化等領(lǐng)域3-7 。1.2.1 品種鑒定和親緣關(guān)系分析 ISSR標(biāo)記因其有操作簡(jiǎn)單，多態(tài)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)作物的品種及其野生近緣種的鑒定方面獲得良好地應(yīng)用，如在葡萄8、柑橘9、棗樹(shù)10 -11、芒果 12、石榴13等品種研究中都取得了很好的結(jié)果。Huang等14采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)番薯屬（Ipomoea）植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明與常見(jiàn)栽培種番薯（Ipomoea batatas）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是I.umbraticola和I.ra

10、mosissima，而最為接近的是I.trifida。薛藝敏等15用ISSR指紋圖譜鑒定了九節(jié)茶（Sarcandra glabra(Thunb) Nakai）不同品種，通過(guò)17條引物產(chǎn)生的ISSR標(biāo)記可用于區(qū)分37個(gè)九節(jié)茶品種。由此可見(jiàn)，ISSR是一種行之有效的基因型鑒定手段，在品種鑒定、品種注冊(cè)等方面將會(huì)發(fā)揮重要作用。1.2.2 物種群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究 繆橫彬等16采用22條引物研究了85個(gè)大菊品種，共獲得160條清晰可辨普帶，其中多態(tài)性條帶148條，多態(tài)位點(diǎn)百分率高達(dá)92.5%，多態(tài)性較高。Jian等17利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了華南地區(qū)銀葉樹(shù)（Heritiera&

11、#160;littoralis）6個(gè)自然種群的遺傳多樣性，使用11個(gè)ISSR引物，獲得了119個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)95個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)83.19%。總的基因多樣度為0.233，基因分化系數(shù)為0.239，種群間的遺傳相似性平均為0.919。表明銀葉樹(shù)有較高的遺傳變異水平，大部分遺傳變異在種群內(nèi)。Li等18用ISSR標(biāo)記研究了我國(guó)西北地區(qū)固沙植物沙鞭（Psammochloa villosa）7個(gè)自然種群共157份個(gè)體的遺傳變異。該研究采用12個(gè)引物共擴(kuò)增出173個(gè)位點(diǎn)，其中122個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)百分率為70.5%。結(jié)果表明遺傳多樣性在物種中的水平較高；而在種群內(nèi)水平較低，

12、多態(tài)位點(diǎn)百分率僅為6.1%26.8%。沙鞭絕大部分遺傳變異分布在種群間（87.46%），僅有12.54%的遺傳變異存在于種群內(nèi)的個(gè)體間。以上這些實(shí)驗(yàn)事實(shí)都表明ISSR在研究作物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性方面發(fā)揮著巨大的作用，可以作為植物育種研究有力的輔助工具。通過(guò)與目標(biāo)基因連鎖的ISSR標(biāo)記來(lái)輔助育種在小麥（Triticum aestivum）、椰子（Cocos nucifera）、鷹嘴豆（Cicerarietinum）等已經(jīng)有相關(guān)研究的報(bào)道19 。綜上所述，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在研究植物遺傳多樣性的研究具有重要作用。1.3 本研究的目的及意義近年來(lái)愛(ài)玉栽培面積不斷擴(kuò)大，對(duì)優(yōu)良品

13、系的需求越來(lái)越多。目前，對(duì)愛(ài)玉種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性研究的報(bào)道很少，對(duì)其遺傳背景不是很了解，為防止因偽劣品系或品系混亂造成的生產(chǎn)損失，對(duì)愛(ài)玉優(yōu)良品系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別尤為重要。傳統(tǒng)的品種區(qū)分方法主要依據(jù)其葉型、隱頭花序等形態(tài)學(xué)特征，而這些特征須待到性成熟時(shí)方可確定，因此性狀鑒定周期較長(zhǎng)，且這些性狀的表現(xiàn)常受環(huán)境的影響，精確度低。DNA分子標(biāo)記是在基因水平上直接反映遺傳多樣性，能對(duì)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、組織器官甚至細(xì)胞做檢測(cè)，不受壞境與基因表達(dá)與否的限制，數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，多態(tài)性高，遺傳穩(wěn)定，而被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析等方面。本研究采用ISSR標(biāo)記技術(shù)初步對(duì)福建引種的

14、24份愛(ài)玉品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，以期為愛(ài)玉優(yōu)良品種的鑒定和資源保護(hù)提供技術(shù)參考， 為這種新型經(jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源引種栽培和遺傳改良提供理論依據(jù)。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 試材供試材料為斗1、太6、樂(lè)野6、里19、日野20、新25、臺(tái)60等24份愛(ài)玉種質(zhì)（下文中C1-C4分別代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分別代表：太2，太6，太7，特選A1，石光文1，石光文2，石光文B1，樂(lè)野6，樂(lè)野8，里19，日野20，新25，臺(tái)60，A，B，太謝3（），太和11（），紅9（），W13（），臺(tái)1（吳國(guó)政），采自福州閩侯南嶼鎮(zhèn)愛(ài)玉生態(tài)研究園。取新鮮葉片組織，放冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用

15、去離子水滌洗，液氮速凍后- 70 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.2 試劑 復(fù)雜植物基因組提取試劑盒、rTaq、Marker（DM2000）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，瓊脂糖為西班牙Biowest進(jìn)口，上海Gene Tech公司分裝，其他試劑均為國(guó)藥分析純。2.1.3 儀器 梯度PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Biometra C-412），超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)ACTGene Nanodrop 1000），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 3-30K），臺(tái)式小型高速離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 1-14），移液槍?zhuān)ǚ▏?guó)吉爾森 Ppetman系列），超低溫冰箱（日本SANY

16、O MDF-382E），制冰機(jī)（Scotsman AF100-AS)，超純水系統(tǒng)（美國(guó)MILLI-Q），渦旋振蕩器（德國(guó)IKA MS3digital)，電泳儀（北京六一 DYY-10C型），凝膠透射分析儀( 上海嘉鵬 ZF型) ，相機(jī)（Nikon 3200D），全自動(dòng)凝膠電泳成像儀（Gel DocTM EZ型）。2.2 方法2.2.1 基因組DNA提取和純度檢測(cè) 采用北京康為世紀(jì)復(fù)雜植物基因組提取試劑盒提取，1%瓊脂糖電泳和超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提DNA的純度與濃度。2.2.2 ISSR引物的篩選和退火溫度優(yōu)化在前期實(shí)驗(yàn)建立的愛(ài)玉ISSR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，以遺傳差異較大的兩個(gè)愛(ài)玉品種（A和

17、W13）的DNA為模板，對(duì)100 條ISSR引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增篩選，退火溫度參考引物合成報(bào)告單上的Tm，從中篩選出擴(kuò)增清晰、重復(fù)性和多態(tài)性好的引物。篩選出的引物以Tm為中心，1為梯度，設(shè)置退火溫度，用梯度PCR儀上自動(dòng)生成的退火溫度進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增條帶多、清晰度高、背景淺的溫度為引物最適退火溫度。2.2.3 愛(ài)玉群體的ISSR-PCR分析選用808、811、861和864引物（不同的引物Tm值不一樣，808為53.0、811為51.1、861為65.5、864為49.7），對(duì)24個(gè)愛(ài)玉進(jìn)行ISSR-PCR分析。ISSR-PCR擴(kuò)增體系（20uL）：1ng模板DNA，1.0U

18、Taq酶，0.4mol/L引物，0.18mmol/L dNTPs；PCR擴(kuò)增程序：94預(yù)變性4 min；94變性45s，相應(yīng)引物的退火溫度下45s，72延伸2.5min，共30個(gè)循環(huán)；72延伸7min，4保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，紫外成像拍照記錄數(shù)據(jù)。2.2.4 數(shù)據(jù)分析ISSR擴(kuò)增結(jié)果分別由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照后，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶并進(jìn)行賦值，有帶為“1”， 無(wú)帶為“0”，根據(jù)Nei-Li相似系數(shù)法計(jì)算出24份供試品種之間ISSR數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)，并用NTSYS軟件進(jìn)行UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Me

19、an)聚類(lèi)分析和主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis）。3 結(jié)果與分析3.1 愛(ài)玉基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的愛(ài)玉基因組DNA質(zhì)量，結(jié)果如圖3-1 所示，DNA 電泳條帶整齊，點(diǎn)樣孔內(nèi)無(wú)雜質(zhì)，電泳條帶大部分無(wú)拖尾，表明所得的DNA沒(méi)有降解，大小在15000bp左右，純度較高，質(zhì)量較好。紫外檢測(cè)結(jié)果表明（表3-1），所抽提樣品DNA的OD260/ OD280比值平均為1.86 左右，說(shuō)明蛋白質(zhì)、RNA去除干凈，OD260/OD230比值平均在3.16左右，說(shuō)明多糖和其他雜質(zhì)去除干凈，所得DNA純度較高，可以滿(mǎn)足后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。表3-1 2

20、4個(gè)愛(ài)玉品系基因組DNA的平均純度和產(chǎn)量材料名稱(chēng)濃度(ng/µL)A230A260A280A260/A280A260/A230產(chǎn)率(ug.gFW-1)24份愛(ài)玉37.10.2340.7410.4011.863.1655.59bp15000100007500500025001000M C1 C2 C3 C4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 V24注：C1-C4分別代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分別代表：太2，太6，太7，特選A1，石光文1，石光文2，石光文B1，樂(lè)野

21、6，樂(lè)野8，里19，日野20，新25，臺(tái)60，A，B，太謝3（），太和11（），紅9（），W13（），臺(tái)1（吳國(guó)政）圖3-1 愛(ài)玉24個(gè)樣品的基因組DNA電泳圖3.2 ISSR引物篩選及退火溫度優(yōu)化利用在預(yù)實(shí)驗(yàn)中差異較大的兩個(gè)愛(ài)玉材料A和W13對(duì)ISSR的100個(gè)引物進(jìn)行引物的初篩（圖3-2），共選出17條擴(kuò)增譜帶清晰、多態(tài)性高，可用于愛(ài)玉遺傳多樣性分析的引物，分別是UBC807、808、810、811、821、825、827、829、834、840、861、864、866、867、868、876、880。其余引物擴(kuò)增條帶較少或者擴(kuò)增條帶模糊。M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6

22、 7 7 8 8 9 9 10 10 11 1120001000500bp750500250100M: DM 2000; 1-11: UBC869、873、876、880、864、868、883、882、875、863、879圖3-2 引物篩選篩選出的引物以引物合成報(bào)告單上面的Tm為中心，1為梯度，設(shè)置退火溫度，用梯度PCR儀上自動(dòng)生成的退溫度進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，結(jié)果如圖3-3，其中17條引物的最適退火溫度只有7條引物和引物合成報(bào)告單上的退火溫度基本保持一致，其余10引物和引物合成報(bào)告單中的Tm都有不同程度上的偏差，平均偏低2.04，（表3-2）。bp20001000750500250100M

23、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10(a) 圖 (b)圖 22 23注：M: DM 2000; (a)圖: UBC827:1-10:62.1,61.0,59.7,58.9,57,8,56.5,54.9,53.8,52.5,51.2; (b)圖: UBC829; 1-10:51.4,52.5,53.6,54.6,55.9,56.9,58.1,59.2,60.4, 61.4. 圖3-3 引物退火溫度優(yōu)化表3-2 退火溫度優(yōu)化結(jié)果編號(hào)引物理論最適溫度（）優(yōu)化退火溫度（）偏差（）編號(hào)引物理論最適溫度（）優(yōu)化退火溫度（）偏差（）1UBC80751.535

24、1.100.4310UBC84053.8948.405.492UBC80856.6953.003.6911UBC86165.4665.500.043UBC81050.0350.000.0312UBC86449.7049.700.004UBC81151.3551.100.2513UBC86660.2455.804.445UBC82155.6453.901.7414UBC86781.8080.501.306UBC82556.5655.101.4615UBC86849.2749.000.277UBC82758.5554.903.6516UBC87643.8143.800.018UBC82958.23

25、55.902.3317UBC88049.7946.103.699UBC83455.8650.005.8618-3.3 愛(ài)玉ISSR-PCR遺傳分析3.3.1 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析4條引物對(duì)全部愛(ài)玉24個(gè)品系進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出48條清晰且可重復(fù)的DNA條帶，其中43條屬于多態(tài)性條帶，每個(gè)引物擴(kuò)增出來(lái)的DNA條帶數(shù)不等，在1015條之間，平均為12條，總多態(tài)率為89.6，其中引物UBC861擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶的百分率最高，為92.3。4條引物所擴(kuò)增的DNA片段的大小范圍在1002000bp，符合分子標(biāo)記對(duì)擴(kuò)增條帶的要求。所篩選的100條ISSR引物中，引物Tm值在40以下經(jīng)擴(kuò)增程序調(diào)整未

26、見(jiàn)擴(kuò)增條帶，Tm值大于65 擴(kuò)增效率也較差，Tm值在5056擴(kuò)增效率較高；共篩選出有多態(tài)性條帶的引物17條，其中有10條引物的核心序列為AG、GA。核心序列為AT、TA、GT、TC的引物基本無(wú)擴(kuò)增。說(shuō)明愛(ài)玉的微衛(wèi)星序列主要是AG和GA。而其中4條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶較多、清晰且穩(wěn)定重復(fù)性好，其中核心序列為ATG 的引物，864擴(kuò)增效果最為清晰，多態(tài)性條帶最多(圖3-4)。bp選取有擴(kuò)增效果較好的4條引物進(jìn)行多態(tài)性條帶統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)條帶進(jìn)行賦值（把電泳譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字化的DNA指紋，以引物811為例）如（表3-3）所示。4條引物的序列及擴(kuò)增條帶數(shù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3-4。2000100075050025010

27、0圖(a):UBC864M C1 C2 C3 C4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 V24圖(b):UBC861圖(c):UBC811圖(d):UBC808注：C1-C4分別代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分別代表：太2，太6，太7，特選A1，石光文1，石光文2，石光文B1，樂(lè)野6，樂(lè)野8，里19，日野20，新25，臺(tái)60，A，B，太謝3（），太和11（），紅9（），W13（），臺(tái)1（吳國(guó)政）圖3-4 UBC808、811、861和864對(duì)愛(ài)玉24個(gè)品種ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)

28、果3.3.2 愛(ài)玉品系遺傳多樣性分析以24個(gè)愛(ài)玉品系和48個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，利用NTSYS軟件進(jìn)行遺傳相似性分析。并構(gòu)建了24個(gè)愛(ài)玉品種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和遺傳距離圖譜( 圖2-5) 。結(jié)果表明: 4個(gè)ISSR標(biāo)記引物可明顯區(qū)分24個(gè)愛(ài)玉品種的遺傳差異，由于檢測(cè)方法的差異，所構(gòu)建的聚類(lèi)圖也不相同。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)所構(gòu)建的遺傳聚類(lèi)圖，其遺傳相似系數(shù)范圍在0.69-0.92之間，如果以0.74為最高遺傳相似系數(shù)，可以將24個(gè)檢測(cè)品種分成4個(gè)大類(lèi)（1、2、3和4），以0.77為最低遺傳相似系數(shù)，可以將24個(gè)檢測(cè)品種分成7個(gè)亞類(lèi)。其中薜荔單獨(dú)劃分為1類(lèi)，按照1、2、3、4的順序，24個(gè)愛(ài)玉品

29、系之間的遺傳相似程度逐漸升高。表3-3 UBC811擴(kuò)增條帶賦值示例12345678910111213141516171819202122232400000000000000000100000011111111011111111001111000001000000010110011111101110111111101111101111111111111111111111111111010111000000000100100000111111100111111111111111000001100000000111100001111111111111111111111111111111111111

30、111111010101000111100000111111100101111111111111111111111110XIII111110110111100010101111XIV000100010000000000010000XV010000000000000010100000注：1、2、3、4表示24個(gè)愛(ài)玉品種，、表示顯示的條帶表3-4 ISSR引物及擴(kuò)增條帶數(shù)編號(hào)引物序列Tm/ 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶數(shù) 多態(tài)性條帶數(shù) 1UBC808(AG)8C53.015132UBC811(GA)8C51.11083UBC861(ACC)665.513124UBC864(ATG)649.7109注

31、：Tm表示退火溫度。3.3.3 愛(ài)玉品系遺傳分化的主坐標(biāo)分析主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis）是以品種間相似系數(shù)矩陣為基礎(chǔ)，建立新的坐標(biāo)系，不同的品種在主坐標(biāo)圖中的位置能反應(yīng)出它們之間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。品種間相對(duì)位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關(guān)系越近，反之則相反20 。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NTSYS軟件對(duì)24個(gè)愛(ài)玉品種進(jìn)行主坐標(biāo)分析，分別建立24個(gè)愛(ài)玉品種的主坐標(biāo)二維散點(diǎn)圖（圖3-6）和三維散點(diǎn)圖（圖3-7）。從主坐標(biāo)二維散點(diǎn)圖和三維散點(diǎn)圖中可以清楚地看出，斗1、斗2、斗3、樂(lè)野6、石光文2、太和11、W13、太2、新25、臺(tái)1、太謝3親緣關(guān)系較近，可以

32、聚為一類(lèi)；斗4、特選A1、石光文1、石光文B1、臺(tái)60、紅9、A、樂(lè)野8、里19、日野20親緣關(guān)系較近，聚為一類(lèi)。太6、太7兩個(gè)品種的親緣關(guān)系相對(duì)還是較遠(yuǎn)的。品種B為薜荔是和其他23個(gè)品種相比親緣關(guān)系相差很遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一類(lèi)，這也恰恰證實(shí)了愛(ài)玉和薜荔分別屬于不同的藤本植物。4231圖3-5 24個(gè)愛(ài)玉品系相似性聚類(lèi)圖注：C1-C4分別代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分別代表：太2，太6，太7，特選A1，石光文1，石光文2，石光文B1，樂(lè)野6，樂(lè)野8，里19，日野20，新25，臺(tái)60，A，B，太謝3（），太和11（），紅9（），W13（），臺(tái)1（吳國(guó)政）圖3-6 24份愛(ài)玉種質(zhì)資源主坐標(biāo)

33、分析二維散點(diǎn)圖注：C1-C4分別代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分別代表：太2，太6，太7，特選A1，石光文1，石光文2，石光文B1，樂(lè)野6，樂(lè)野8，里19，日野20，新25，臺(tái)60，A，B，太謝3（），太和11（），紅9（），W13（），臺(tái)1（吳國(guó)政）圖3-7 24份愛(ài)玉種質(zhì)資源主坐標(biāo)分析三維散點(diǎn)圖4 討 論本實(shí)驗(yàn)首次采用ISSR技術(shù)對(duì)愛(ài)玉的遺傳多樣性展開(kāi)研究，結(jié)果顯示出了較大的可行性和優(yōu)越性，而且篩選出的引物都可以擴(kuò)增出條帶，這說(shuō)明ISSR引物具有物種通用性。我們常規(guī)實(shí)驗(yàn)引物退火溫度都是在引物合成報(bào)告單最適退火溫度基礎(chǔ)上再降低5，這只是經(jīng)驗(yàn)心得，并沒(méi)有定論。對(duì)于每個(gè)引物的最適退火

34、溫度不僅和引物本身具有相關(guān)性，還與要擴(kuò)增的模板相關(guān)聯(lián)。引物退火溫度對(duì)于PCR擴(kuò)增結(jié)果具有重大影響：溫度過(guò)高時(shí)引物與模板結(jié)合不牢固，引物容易從模板上掉下來(lái)，減少有效的擴(kuò)增譜帶；但退火溫度過(guò)低，又會(huì)使一些不完全配對(duì)的引物在低溫下比較穩(wěn)定的與模板結(jié)合，增加了非特異性擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)中，高的退火溫度明顯減少擴(kuò)增的譜帶數(shù)量。大片段（500bp）明顯減少，而小片段（250-500bp）不僅未受影響，反而擴(kuò)增效果更好，這是因?yàn)榇笃涡枰^長(zhǎng)的擴(kuò)增時(shí)間，溫度過(guò)高，引物容易掉下來(lái)；而小片段的擴(kuò)增只需要很短的時(shí)間就可以完成，由于沒(méi)有大片段與小片段競(jìng)爭(zhēng)引物和底物，所以小片段得到較好的擴(kuò)增。因此引物退火溫度的優(yōu)化在ISS

35、R分子標(biāo)記中具有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果中，ISSR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性好，條帶多而且清晰。選取4條ISSR引物，對(duì)24份愛(ài)玉種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶43條，占總條帶的89.6%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出10.75條多態(tài)性譜帶，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。引物擴(kuò)增譜帶的數(shù)目與模板上出現(xiàn)的引物同源序列的頻率有關(guān)；引物擴(kuò)增譜帶的清晰度與模板和引物的同源程度（互補(bǔ)配對(duì)）有關(guān)。大多數(shù)引物沒(méi)有擴(kuò)增，是因?yàn)榕c愛(ài)玉基因組DNA沒(méi)有同源序列，不能配對(duì)。一些引物擴(kuò)增譜帶模糊，是因?yàn)榕c愛(ài)玉基因組DNA同源性低，配對(duì)不牢固，在擴(kuò)增過(guò)程中容易脫落，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。24份愛(ài)玉種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性較為豐富，這可能是由于長(zhǎng)

36、期的無(wú)性繁殖，基因沒(méi)有融合，依然保留著各自獨(dú)立的遺傳信息，為育種提供豐富的遺傳資源。其結(jié)果說(shuō)明采用不同類(lèi)型之間種質(zhì)雜交可以獲得較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，可避免近親雜交，選配遺傳相似系數(shù)低即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的優(yōu)異愛(ài)玉種質(zhì)作為雜交親本，有利于育成綜合遠(yuǎn)親優(yōu)異性狀的新品種。前人在形態(tài)性狀等指標(biāo)研究的基礎(chǔ)上，認(rèn)為薜荔是愛(ài)玉的變種，屬于種間差異21。但也有研究認(rèn)為愛(ài)玉和薜荔歸為同一物種，屬于種內(nèi)差異。我們?cè)囼?yàn)結(jié)果表明薜荔和愛(ài)玉差異較大，遺傳相似系數(shù)為0.69，經(jīng)聚類(lèi)分析和主坐標(biāo)分析把薜荔單獨(dú)劃分為1類(lèi)，試驗(yàn)結(jié)果支持薜荔是愛(ài)玉的變種。利用主坐標(biāo)分析法對(duì)愛(ài)玉遺傳分化進(jìn)行分析，通過(guò)以品種間的相似系數(shù)為舉證，建立二維和三維坐

37、標(biāo)我們可以一目了然的看出斗1、斗2、斗3、樂(lè)野6、石光文2、太和11、W13、太2、新、25、臺(tái)1、太謝3親緣關(guān)系較近，可以聚為一類(lèi)；斗4、特選A1、石光文1、石光文B1、臺(tái)60、紅、A樂(lè)野、里19、日野20、親緣關(guān)系較近，聚為一類(lèi)。而太6、太7雖為統(tǒng)一命名系統(tǒng)的品種，但是可能由于其進(jìn)化過(guò)程中基因發(fā)生大量交流，所以如今其差異性較大，相似系數(shù)僅為0.75。此外這個(gè)品種也于其他21個(gè)品系存在明顯的差異，相似系數(shù)僅0.70，這與愛(ài)玉同薜荔的相似系數(shù)相近，這充分證明其在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了大量的基因突變的可能性。目前，愛(ài)玉種質(zhì)資源分子鑒定以及遺傳多樣性的研究仍處在初步探索階段，基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探索

38、愛(ài)玉種質(zhì)資源遺傳多樣性目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究表明用ISSR標(biāo)記進(jìn)行愛(ài)玉種質(zhì)遺傳多樣性分析是可行的。SSR和AFLP是精確度高重復(fù)性較好的分子標(biāo)記，但是本研究中沒(méi)有選用該類(lèi)標(biāo)記，主要是由于SSR分子標(biāo)記需要獲得研究物種基因組序列，然而目前對(duì)愛(ài)玉基因組序列我們還一無(wú)所知，引物開(kāi)發(fā)成本高、效率低和工作量大。AFLP操作復(fù)雜有一定難度，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，每一步條件都需要大量精密優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)成本高。RAPD標(biāo)記雖然實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便但重復(fù)性差。比較其他幾種標(biāo)記方法，ISSR分子標(biāo)記不僅結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性和多態(tài)性強(qiáng)，而且產(chǎn)物多態(tài)性也相對(duì)豐富。然而，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)

39、也存在一些問(wèn)題，當(dāng)條件不適宜時(shí)很可能造成部分非特異性擴(kuò)增、拖帶嚴(yán)重等現(xiàn)象22-23 。此外部分條帶較弱，在進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，由于沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于弱帶的統(tǒng)計(jì)主觀性較強(qiáng)，造成在進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳圖譜建立和品種鑒定時(shí)結(jié)果往往出現(xiàn)不穩(wěn)定性， 這些弱帶的原因可能是由于存在其他一些較亮的條帶，從而抑制了這些弱帶的擴(kuò)增或引物在此結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合效率較低等24。因此，針對(duì)這些問(wèn)題，我們還需要在以后的試驗(yàn)中繼續(xù)探討，以促進(jìn) ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)的成熟。致 謝歷時(shí)將近1年多的時(shí)間終于將完成這篇畢業(yè)論文，在論文前期的實(shí)驗(yàn)操作以及后期的論文寫(xiě)作過(guò)程中遇到了無(wú)數(shù)的困難和障礙，都在同學(xué)們和老師們的幫助下順利

40、克服了。在此尤其要特別感謝我的論文指導(dǎo)老師史輝老師，他對(duì)我進(jìn)行了細(xì)心地指導(dǎo)和幫助，不厭其煩的幫助進(jìn)行論文的修改和改進(jìn)。另外，在做實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們生物系的許多老師也給我提供了很多方面的支持與幫助。在此向幫助和指導(dǎo)過(guò)我的各位老師表示最衷心的感謝！感謝這篇論文所涉及到的各位學(xué)者。本文引用了數(shù)位學(xué)者的研究文獻(xiàn)，如果沒(méi)有各位學(xué)者的研究成果的幫助和啟發(fā)，我將很難完成本篇論文的寫(xiě)作。 感謝我的同學(xué)和朋友，在我寫(xiě)論文的過(guò)程中給予我了很多份素材，還在論文的撰寫(xiě)和排版過(guò)程中提供熱情的幫助。由于我的學(xué)術(shù)水平有限，所寫(xiě)論文難免有不足之處，懇請(qǐng)各位老師和學(xué)友批評(píng)和指正！參 考 文 獻(xiàn)1 徐俊森,許信玲,羅美娟.臺(tái)灣愛(ài)玉

41、研究與開(kāi)發(fā)及福建引種栽培的現(xiàn)況J. 防護(hù)林科技, 2004, 6: 52-54.2 Ziet K E, Rafal S A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplificationJ. Genomes,1994, 20(2): 176-183.3 溫文婷,賈定洪,郭勇,等.中國(guó)主栽銀耳配對(duì)香灰菌的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(3): 552-558. 4 李曉玲,李寧,楊進(jìn),等.湖北中華蚊母ISSR遺傳

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