電壓鉗制和膜片鉗制技術(shù)

1、Voltage clamp technique 利用微電極技術(shù)，雖然記錄到細(xì)胞內(nèi)的電利用微電極技術(shù)，雖然記錄到細(xì)胞內(nèi)的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機(jī)制，必須應(yīng)用明跨膜電變化機(jī)制，必須應(yīng)用電壓鉗制技術(shù)電壓鉗制技術(shù)。這一技術(shù)首先是由這一技術(shù)首先是由ColeCole及其同事設(shè)計(jì)，在經(jīng)及其同事設(shè)計(jì)，在經(jīng)HodgkinHodgkin等人加以改進(jìn)，用于神經(jīng)電生理研究，等人加以改進(jìn)，用于神經(jīng)電生理研究，弄清了神經(jīng)纖維在興奮時(shí)離子流的情況。弄清了神經(jīng)纖維在興奮時(shí)離子流的情況。 一、細(xì)胞膜的生物物理特性(Biophysical propertie

2、s of cell membrane) 細(xì)胞膜上以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同細(xì)胞膜上以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質(zhì)。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的特性的蛋白質(zhì)。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜電纜性質(zhì)電纜性質(zhì)(cable properties)(cable properties)的反映。的反映。( (軸漿電阻與膜電阻、軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對(duì)膜電位的影響起著依距離而膜電容的組合，使電流對(duì)膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時(shí)間上的延緩作用衰減以及在時(shí)間上的延緩作用神經(jīng)的神經(jīng)的“電纜電纜”性性質(zhì)

3、質(zhì)) )。細(xì)胞膜的電纜特性從它的等效電路及其時(shí)間常細(xì)胞膜的電纜特性從它的等效電路及其時(shí)間常數(shù)和空間常數(shù)得到證實(shí)。數(shù)和空間常數(shù)得到證實(shí)。 (一) 細(xì)胞膜的等效電路 從電學(xué)特點(diǎn)上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為從電學(xué)特點(diǎn)上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為電阻電容器。它具備電阻電容器。它具備細(xì)胞漿電阻細(xì)胞漿電阻（縱向電阻，（縱向電阻，RoRo），），膜電阻膜電阻（橫向電阻，（橫向電阻，RmRm），），膜電容膜電容（CmCm）和和膜電位膜電位（EmEm）四方面的電學(xué)特性，根據(jù)這四）四方面的電學(xué)特性，根據(jù)這四方面特性即可構(gòu)成其方面特性即可構(gòu)成其等效電路等效電路（Equivalent Equivalent Circu

4、itCircuit）。）。outsideinside膜電位等效電路的簡化圖膜電位等效電路的簡化圖Cm Cm 膜電容膜電容RmRm 膜電阻膜電阻EmEm 離子平衡電位離子平衡電位Ro Ro 細(xì)胞外液的縱向電阻（細(xì)胞外液的縱向電阻（/cm/cm） RiRi 軸漿的縱向電阻（軸漿的縱向電阻（/cm/cm）RoCmRmEm+-離子通道等效電路 細(xì)胞膜的細(xì)胞膜的等效電路等效電路是一個(gè)并聯(lián)的阻容是一個(gè)并聯(lián)的阻容電路，膜活動(dòng)時(shí)既有電壓的改變，同時(shí)又電路，膜活動(dòng)時(shí)既有電壓的改變，同時(shí)又有電流的改變。有電流的改變。電位的改變可引起電容器電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流的充、放電，也可用

5、于電阻器上的電流流動(dòng)。動(dòng)。通過電容器的電流為通過電容器的電流為IcIc ，通過電阻，通過電阻的電流為的電流為IrIr。1 縱向電阻縱向電阻（Ro、Ri） 由胞漿的性質(zhì)所決定由胞漿的性質(zhì)所決定，具有較高的電阻率，具有較高的電阻率，它與直徑呈反比關(guān)系它與直徑呈反比關(guān)系（直徑大、電阻小，直（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電由于它的存在，使生物電的傳導(dǎo)主要沿細(xì)胞膜所包圍的容積導(dǎo)體進(jìn)行。的傳導(dǎo)主要沿細(xì)胞膜所包圍的容積導(dǎo)體進(jìn)行。它是單位長度的電阻，單位是它是單位長度的電阻，單位是/cm /cm ，細(xì)胞細(xì)胞外間質(zhì)的容積很大，其單位長度電阻（外間質(zhì)的容積很大，其單位長度

6、電阻（RoRo）較較RiRi小。小。 2.橫向電阻（橫向電阻（redial resistance） 即即細(xì)胞膜本身具有的膜電阻細(xì)胞膜本身具有的膜電阻。細(xì)胞膜。細(xì)胞膜由雙層脂質(zhì)構(gòu)成，厚度很薄，但具有很高由雙層脂質(zhì)構(gòu)成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜電阻表示離子通過膜的有限能力。膜的有限能力。 膜電阻反映了離子是否膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（容易通透膜的情況。膜電阻（RmRm）的大?。┑拇笮》从沉四そY(jié)構(gòu)電學(xué)方面的差異。反映了膜結(jié)構(gòu)電學(xué)方面的差異。2.橫向電阻（橫向電阻（redial resistance） 膜電位、膜電流膜電位、膜電流

7、和和膜電阻膜電阻的關(guān)系遵循的關(guān)系遵循歐姆定律歐姆定律： Em = Im . RmEm = Im . Rm I = V/R I = V/R 膜電阻越大，對(duì)電流的導(dǎo)通能力越小。膜電阻越大，對(duì)電流的導(dǎo)通能力越小。 膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（阻（RmRm）的倒數(shù)）的倒數(shù)膜電導(dǎo)膜電導(dǎo)（G G，g g）。）。I = g VI = g V（膜電位（膜電位恒定的情況下，膜電導(dǎo)越大，膜電流也越大。恒定的情況下，膜電導(dǎo)越大，膜電流也越大。 不同的離子有不同的電導(dǎo)不同的離子有不同的電導(dǎo)。 電導(dǎo)的單位是電導(dǎo)的單位是Siemens( S ).Siemens(

8、 S ).3.膜電容膜電容（capacity） 表示膜的絕緣及儲(chǔ)存電荷的性質(zhì)表示膜的絕緣及儲(chǔ)存電荷的性質(zhì)。任何一任何一種裝置使兩個(gè)導(dǎo)體中間插入一個(gè)絕緣體并安排種裝置使兩個(gè)導(dǎo)體中間插入一個(gè)絕緣體并安排在一起，稱為電容器。在一起，稱為電容器。細(xì)胞外液及細(xì)胞內(nèi)液均細(xì)胞外液及細(xì)胞內(nèi)液均為含電解質(zhì)的溶液，可看作為兩個(gè)導(dǎo)體；細(xì)胞為含電解質(zhì)的溶液，可看作為兩個(gè)導(dǎo)體；細(xì)胞膜是含脂質(zhì)的膜，可視作為絕緣體。細(xì)胞外液膜是含脂質(zhì)的膜，可視作為絕緣體。細(xì)胞外液- -細(xì)胞膜細(xì)胞膜- -細(xì)胞內(nèi)液三者組成了電容。細(xì)胞內(nèi)液三者組成了電容。3.膜電容膜電容（capacity） 電容大小與細(xì)胞體積和細(xì)胞膜表面積有關(guān)。電容大小與細(xì)胞

9、體積和細(xì)胞膜表面積有關(guān)。膜電容和膜面積呈正比，與膜的厚度呈反比。膜電容和膜面積呈正比，與膜的厚度呈反比。 電容的單位是法拉第（電容的單位是法拉第（F F）。）。 膜電容的測量可用于膜電容的測量可用于細(xì)胞膜表面積細(xì)胞膜表面積的測定，的測定，對(duì)推算某種對(duì)推算某種離子通道在單位膜面積上的密度離子通道在單位膜面積上的密度有有一定幫助。一定幫助。4 膜電位膜電位 （membrane potential） 當(dāng)膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流當(dāng)膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動(dòng)時(shí)，就相當(dāng)于在電容器上充電或放電而產(chǎn)生電動(dòng)時(shí)，就相當(dāng)于在電容器上充電或放電而產(chǎn)生電位差，即跨膜電位。位差，即跨膜電位。膜電位

10、的高低決定于跨膜電膜電位的高低決定于跨膜電化學(xué)梯度；膜電位的高低與膜兩側(cè)的電荷成正比化學(xué)梯度；膜電位的高低與膜兩側(cè)的電荷成正比。 在膜兩側(cè)離子濃度不變的情況下，膜電位則在膜兩側(cè)離子濃度不變的情況下，膜電位則取決于膜電導(dǎo)的改變（離子通透性的改變）。反取決于膜電導(dǎo)的改變（離子通透性的改變）。反過來，膜電導(dǎo)的大小又受到膜電位的控制（離子過來，膜電導(dǎo)的大小又受到膜電位的控制（離子通透性的電壓依賴性）。通透性的電壓依賴性）。5 膜電流膜電流（membrane current） 任何電流都是電容電流（任何電流都是電容電流（IcIc）和電阻）和電阻電流（電流（IrIr）兩種形式通過細(xì)胞膜，）兩種形式通過細(xì)胞

11、膜，前者導(dǎo)前者導(dǎo)致膜電荷的改變，后者實(shí)際上是由離子攜致膜電荷的改變，后者實(shí)際上是由離子攜帶流經(jīng)細(xì)胞膜的。帶流經(jīng)細(xì)胞膜的。 I m = Ic + IrI m = Ic + Ir5 膜電流膜電流（membrane current） 電位的變化引起膜電容的充電或放電，電位的變化引起膜電容的充電或放電，而電流的變化則表現(xiàn)在膜電阻上的電流流而電流的變化則表現(xiàn)在膜電阻上的電流流動(dòng)。動(dòng)。IcIc只在膜電位發(fā)生變化的一瞬間出現(xiàn)，只在膜電位發(fā)生變化的一瞬間出現(xiàn)，若將膜電位固定在一定水平，記錄到的僅若將膜電位固定在一定水平，記錄到的僅為為IiIi（IrIr），這是電壓鉗制技術(shù)的電學(xué)基），這是電壓鉗制技術(shù)的電學(xué)基礎(chǔ)

12、之一。礎(chǔ)之一。(二) 細(xì)胞膜的時(shí)間常數(shù)細(xì)胞膜的時(shí)間常數(shù)（time constant） 時(shí)間常數(shù)是指膜電壓隨時(shí)間而改變的過程，用一時(shí)間常數(shù)是指膜電壓隨時(shí)間而改變的過程，用一常數(shù)表示之。它反映膜電位在細(xì)胞膜上隨時(shí)間而改常數(shù)表示之。它反映膜電位在細(xì)胞膜上隨時(shí)間而改變的（緩慢）程度。也就是變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜膜電位通過膜電阻和膜電容充電到電容充電到63%63%或放電到或放電到37 %37 %所需的時(shí)間。所需的時(shí)間。 = Rm = Rm Cm Cm = = 膜的時(shí)間常數(shù)膜的時(shí)間常數(shù) (ms(ms）;Rm;Rm= =膜電阻（膜電阻（kk） Cm=Cm=膜電容（膜電容（FF）的大小與

13、膜的電學(xué)性質(zhì)有關(guān)，與膜的形狀無關(guān)。的大小與膜的電學(xué)性質(zhì)有關(guān)，與膜的形狀無關(guān)。 (三) 細(xì)胞膜的空間常數(shù)細(xì)胞膜的空間常數(shù)（space constant）空間常數(shù)，是度量電壓的空間衰減，即標(biāo)志電壓依距離而衰減的程度的一個(gè)常數(shù)。即:膜電位通過膜電阻和縱向電阻所組成的分流電路隨距離的增大而按指數(shù)曲線規(guī)律衰減的速度.或表示膜電位按指數(shù)曲線規(guī)律衰減到37%所需要的距離。細(xì)胞直徑越大，空間常數(shù)越大。 (一)、定義定義 利用負(fù)反饋原理將膜電位在空間和時(shí)間上固定利用負(fù)反饋原理將膜電位在空間和時(shí)間上固定于某一恒定的測定值，以研究動(dòng)作電位產(chǎn)生過程中于某一恒定的測定值，以研究動(dòng)作電位產(chǎn)生過程中的離子通透性與膜電位之間

14、的依從關(guān)系的技術(shù)。的離子通透性與膜電位之間的依從關(guān)系的技術(shù)。 電壓鉗制術(shù)是利用負(fù)反饋電路，在一定時(shí)間內(nèi)電壓鉗制術(shù)是利用負(fù)反饋電路，在一定時(shí)間內(nèi)將跨膜電位（將跨膜電位（TransmembraneTransmembrane Potential Potential， V Vm m），），保持在某個(gè)選定的電位水平，此電位稱為保持在某個(gè)選定的電位水平，此電位稱為保持電位保持電位（Holding potentialHolding potential，V Vh h），或者使保持電位突然），或者使保持電位突然變到某個(gè)特定的幅值的方波電位，稱為變到某個(gè)特定的幅值的方波電位，稱為鉗制電位鉗制電位（Clamping

15、 potentialClamping potential）或）或指令電位指令電位（Command Command potentialpotential，VcVc）。 (二)電壓鉗方法 電容器電流 Ic=d（CmV）/dt電阻器上電流 IR流過膜的電流總量 Idv / dt = 0 所有的電流將都是流過膜電阻的，這種電流將能反映離子的流動(dòng)。 電壓源（SG）使膜電位固定在特定的水平，并以放大器（AV）記錄，該放大器與一個(gè)反饋放大器（AFB）連接，這一反饋電流通過膜，正好抵消因加電壓而引起的離子電流，通過電流監(jiān)視器測量電流。（三）電壓鉗技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)： 很容易將膜電容電流與離子電流分開；很容易將膜電容

16、電流與離子電流分開； 可將膜電流分成不同的成分一可將膜電流分成不同的成分一I INaNa、I IK K、 Ica Ica 等（在灌流液中加入或去除某種離子）等（在灌流液中加入或去除某種離子） 能精確反映由離子通道的開放和關(guān)閉，引起能精確反映由離子通道的開放和關(guān)閉，引起的膜電導(dǎo)的改變，能把離子通透性變化的時(shí)間關(guān)的膜電導(dǎo)的改變，能把離子通透性變化的時(shí)間關(guān)系加以描述。系加以描述。 能分析離子通透性變化與膜電位的關(guān)系，在能分析離子通透性變化與膜電位的關(guān)系，在研究電壓調(diào)節(jié)通道的行為方面有很大價(jià)值。研究電壓調(diào)節(jié)通道的行為方面有很大價(jià)值。 1 1 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 必須在細(xì)胞內(nèi)插入兩個(gè)電極，對(duì)細(xì)胞必須在細(xì)胞內(nèi)插入兩

17、個(gè)電極，對(duì)細(xì)胞損傷很大；損傷很大； 對(duì)體積小的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)難以實(shí)現(xiàn)；對(duì)體積小的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)難以實(shí)現(xiàn)； 對(duì)形態(tài)復(fù)雜的細(xì)胞，很維保持細(xì)胞膜對(duì)形態(tài)復(fù)雜的細(xì)胞，很維保持細(xì)胞膜各處電位一致；各處電位一致； 只研究一個(gè)細(xì)胞上眾多通道的綜合活只研究一個(gè)細(xì)胞上眾多通道的綜合活動(dòng)規(guī)律，無法反映單個(gè)通道活動(dòng)的特點(diǎn)動(dòng)規(guī)律，無法反映單個(gè)通道活動(dòng)的特點(diǎn)。 2 缺點(diǎn)缺點(diǎn) :蛙坐骨神經(jīng)元單個(gè)蛙坐骨神經(jīng)元單個(gè)Ranvier結(jié)的電壓鉗記錄結(jié)的電壓鉗記錄（四）幾種電壓鉗方法 雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Doub

18、le Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Double Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 圖1-2 心肌雙微電極 電壓鉗法示意圖Em ：膜電位； Ec：控制電位； Vo：鉗制電位； I：輸出電流雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Double Sucrose Gap

19、Double Sucrose Gap）法）法 圖1-3 單蔗糖間隙法原理圖 圖1-4 雙蔗糖間隙法原理圖 Em ：膜電位； Ec：控制電位； Em ：膜電位； Ec：控制電位； Vc：鉗制電位； I：輸出電流 Vc：鉗制電位； I：輸出電流電極接觸細(xì)胞電極接觸細(xì)胞負(fù)壓吸引形成負(fù)壓吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起電極，囊泡與細(xì)胞脫離提起電極，囊泡與細(xì)胞脫離ABCD第三節(jié)第三節(jié) 膜片鉗制技術(shù)膜片鉗制技術(shù) 膜片鉗制技術(shù)膜片鉗制技術(shù)（patch clamp technique)patch clamp technique)是對(duì)一塊單獨(dú)的細(xì)胞膜片（或整個(gè)細(xì)胞）的是對(duì)一塊單獨(dú)的細(xì)胞膜片（或整個(gè)細(xì)胞）的電位進(jìn)行鉗

20、制的一項(xiàng)電生理技術(shù)。電位進(jìn)行鉗制的一項(xiàng)電生理技術(shù)。 通過對(duì)膜電位的鉗制可以觀察通過離子通過對(duì)膜電位的鉗制可以觀察通過離子通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電壓的恒定而測出這種電流。運(yùn)用膜片鉗技術(shù)壓的恒定而測出這種電流。運(yùn)用膜片鉗技術(shù)記到的最小電流可達(dá)到記到的最小電流可達(dá)到pApA級(jí)級(jí)(10(10-12-12 A) A)。一一 基本原理基本原理 膜片鉗的本質(zhì)屬于電壓鉗范疇，其基本膜片鉗的本質(zhì)屬于電壓鉗范疇，其基本工作原理是：工作原理是：采用經(jīng)典的負(fù)反饋放大技術(shù)作采用經(jīng)典的負(fù)反饋放大技術(shù)作電壓固定，但改用細(xì)胞外微吸管作電極，將電壓固定，但改用細(xì)胞外微吸管作電

21、極，將微電極管尖端與細(xì)胞膜表面接觸，經(jīng)負(fù)壓抽微電極管尖端與細(xì)胞膜表面接觸，經(jīng)負(fù)壓抽吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值高達(dá)高達(dá)10-10010-100千歐（即千歐（即G=10G=109 9）。只有在這）。只有在這種封接存在時(shí)，通過膜電極引導(dǎo)記錄的電流種封接存在時(shí)，通過膜電極引導(dǎo)記錄的電流才是通過該膜的離子通道電流。才是通過該膜的離子通道電流。 膜片鉗技術(shù)原理示意圖 Rs是膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（輸入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常為15M，如果Rseal高達(dá)10G（1010）以上時(shí)，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可為

22、在IV轉(zhuǎn)換器（點(diǎn)線）內(nèi)的高阻抗負(fù)反饋電阻(Rf)的電壓降而被檢測出。 膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別 膜電位鉗制的方法不同；膜電位鉗制的方法不同； 電位固定的細(xì)胞面積不同；電位固定的細(xì)胞面積不同； 研究的離子通道數(shù)目不同；研究的離子通道數(shù)目不同； (1)測量部分： (2)串聯(lián)電阻補(bǔ)償部分： (3)電容補(bǔ)償部分： (4)指令信號(hào)控制部分： (5)電源部分：膜片鉗放大器主要組成:電極電流監(jiān)視器、靈敏度開關(guān)、濾波器開關(guān)、方式選擇開關(guān) 。用于校正全細(xì)胞記錄時(shí)，由于電極和細(xì)胞內(nèi)之間的通路電阻所造成的膜電位誤差 。用來補(bǔ)償電壓突然改變 時(shí)引起的電容電流 。將一定的電壓加入到刺激信號(hào)中，形成一指令信號(hào)的保持電壓。進(jìn)行

23、電壓鉗制時(shí)，它決定膜電位值，作電流鉗制時(shí)，則決定電流值 。貼附式貼附式全細(xì)胞記錄模式全細(xì)胞記錄模式負(fù)壓吸負(fù)壓吸內(nèi)面向外式內(nèi)面向外式外面向外式外面向外式拉拉細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞拉并暴露于空氣中拉并暴露于空氣中四種經(jīng)典記錄模式四種經(jīng)典記錄模式 (Cell-attached or On cell mode) 細(xì)胞貼附式膜片（細(xì)胞貼附式膜片（cell-attached patch） 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不破壞細(xì)胞的完整性，不需要胞內(nèi)灌流，不影響細(xì)胞質(zhì)且調(diào)制系統(tǒng)完整?？裳芯客ㄟ^細(xì)胞對(duì)單通道的調(diào)制，也可在正常離子環(huán)境中研究遞質(zhì)和電壓激活的單通道活動(dòng)。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 不能改變細(xì)胞內(nèi)成分，也不能精確測定膜電位

24、。同時(shí)由于許多細(xì)胞膜上存在有牽張激活的離子通道，細(xì)胞膜與電極間輕微的張力變化往往會(huì)增加記錄的背景噪聲。 于細(xì)胞牢固貼附于微管電極的尖由端而得名。它可用于記錄各種細(xì)胞的單通道電流，而且是在細(xì)胞完整無損的狀態(tài)下研究通道的活動(dòng)。 細(xì)胞細(xì)胞電極電極細(xì)胞膜細(xì)胞膜胞外液胞外液胞內(nèi)液內(nèi)面向外式膜片 (inside-out patch) 細(xì)胞貼附式膜片形后，提起電極時(shí)，與電極尖端相接的細(xì)胞膜被撕脫下來開成小泡，將電極尖端在空氣中暴露幾秒鐘后小泡很快破裂，形成胞漿側(cè)向外的內(nèi)面向外式膜片。 特點(diǎn)特點(diǎn)：較易改變細(xì)胞內(nèi)的離子或物質(zhì)濃度，也能把酶等直接加入膜的內(nèi)側(cè)面，適宜研究胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)通道活動(dòng)的影響。但實(shí)驗(yàn)中改變膜外側(cè)

25、物質(zhì)困難，且需侵入低鈣液中，以免小泡形成。應(yīng)用：應(yīng)用：可研究胞內(nèi)信使物質(zhì)cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等對(duì)受體型通道的調(diào)節(jié)，以及胞內(nèi)激素對(duì)通道的調(diào)節(jié)。這種方式可使通道與細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制脫耦聯(lián)，使第二信使直接作用于膜內(nèi)，引起通道開閉。 電極脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)內(nèi)面面向浴液面面向浴液 外面向外式膜片(outside out patch) 細(xì)胞貼附式膜片形成后，向微管電極內(nèi)給予較強(qiáng)的負(fù)壓將膜片吸破，再將電極從細(xì)胞膜上拔起，但不暴露于空氣中，被撕脫下來的膜便形成外面向外式膜片。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 應(yīng)用：應(yīng)用： 可以任意改變胞外物質(zhì)的濃度，有利于研究遞質(zhì)對(duì)膜離子通道外

26、側(cè)面的作用。 實(shí)驗(yàn)中難以改變胞內(nèi)成分，電極管必須充以低鈣溶液以防小泡形成。 可研究腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶C等活性變化，以及細(xì)胞膜上信使物質(zhì)二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等對(duì)受體型的離子通道研究。 Patch-pipette脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)雙分子層的外外面面向浴液面面向浴液全細(xì)胞記錄構(gòu)型 (whole cell recording) 記錄的電流屬于宏觀電流（macroscopical current），是整個(gè)細(xì)胞離子通道活動(dòng)形成的總和電流。若采用膜片鉗放大器內(nèi)的電流鉗模式，還可以記錄細(xì)胞的靜息電位和動(dòng)作電位。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 電極管內(nèi)與細(xì)胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細(xì)胞內(nèi)液的成分

27、；記錄的是許多通道的綜合電流，需改變內(nèi)部介質(zhì)以分離電流；適合于對(duì)小細(xì)胞的電壓鉗位，對(duì)直徑大于30m的細(xì)胞很難實(shí)現(xiàn)鉗制；該方法使電生理研究的重點(diǎn)從無脊椎動(dòng)物大細(xì)胞中解脫出來，而向人類和哺乳類細(xì)胞發(fā)展。細(xì)胞細(xì)胞電極電極細(xì)胞膜細(xì)胞膜 膜片鉗制技術(shù)記錄方式膜片鉗制技術(shù)記錄方式 穿孔膜片記錄技術(shù)（perforated patch recording technique） HomHom和和MartyMarty于于19881988年首次建立了一種對(duì)年首次建立了一種對(duì)傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄法改進(jìn)的方法，該方法是基傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄法改進(jìn)的方法，該方法是基于某些抗生素如于某些抗生素如制霉菌素制霉菌素（NystatinNys

28、tatin），），兩兩性霉素性霉素B B（AmphotericinAmphotericin B B）等具有在生物）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使電極液與細(xì)胞內(nèi)液在電學(xué)上相通，因而稱作電極液與細(xì)胞內(nèi)液在電學(xué)上相通，因而稱作穿孔膜片記錄技術(shù)。穿孔膜片記錄技術(shù)。 穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式（Perforated patch and perforated vesicle mode）制霉菌素制霉菌素形成的孔道形成的孔道電極電極受體受體離子通道離子

29、通道提起電極提起電極胞漿胞漿穿孔囊泡穿孔囊泡(外面向外式外面向外式) 穿孔膜片穿孔膜片(緩慢全細(xì)胞式緩慢全細(xì)胞式)技術(shù)點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與全細(xì)胞記錄相比，該技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn) 由抗生素形成的孔道對(duì)于等于或大于葡萄糖的分子均不能通過。因此，在全細(xì)胞記錄時(shí)可避免對(duì)胞內(nèi)重要物質(zhì)的滲析影響，通道電流衰減現(xiàn)象顯著減慢，那些對(duì)細(xì)胞內(nèi)通訊及通道調(diào)控具有重要作用的第二信使物質(zhì)仍可正常運(yùn)行。 因抗生素形成的孔道對(duì)多價(jià)離子不通透，故胞內(nèi)的這些離子的濃度就不受電極液的影響。因此可在全細(xì)胞電流記錄的同時(shí)用Ca2+染料測定胞內(nèi)游離的Ca2+水平 對(duì)細(xì)胞的損傷作用明顯小于微電極細(xì)胞內(nèi)記錄及膜片鉗全細(xì)胞記錄，記錄時(shí)間可持續(xù)3

30、小時(shí)。 高阻封接不易被破壞，而全細(xì)胞記錄的負(fù)壓脈動(dòng)式抽吸和電壓脈沖易致高阻封接破壞。電極串聯(lián)電阻較低，膜電容更易補(bǔ)償。缺點(diǎn)： 無法使電極液中的大分子與胞內(nèi)物質(zhì)交換。因此研究大分子物質(zhì)對(duì)胞內(nèi)機(jī)制的作用就不能進(jìn)行。 由于電極液與胞內(nèi)液之間存在Donnan平衡，因此電極液內(nèi)必須有與細(xì)胞內(nèi)相同濃度的不通透陰離子和Cl-，否則將導(dǎo)致Cl-流出或流入細(xì)胞，使陰離子和水重新平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞體液變化。 穿孔所需時(shí)間較全細(xì)胞法長。 濃度鉗（concentration clamp） 用改變灌流液的方法來改變細(xì)胞內(nèi)液或外用改變灌流液的方法來改變細(xì)胞內(nèi)液或外液中某種化學(xué)成分和濃度。人工地控制膜內(nèi)液中某種化學(xué)成分和濃

31、度。人工地控制膜內(nèi)或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變某種化學(xué)物質(zhì)的濃度，這種技術(shù)就是某種化學(xué)物質(zhì)的濃度，這種技術(shù)就是濃度鉗濃度鉗，也稱為也稱為化學(xué)鉗化學(xué)鉗（chemical clamipchemical clamip）, ,或稱或稱濃濃度跳變度跳變(concentration jump)(concentration jump)。 人工脂膜的膜電流記錄人工脂膜的膜電流記錄 把構(gòu)成細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子散布于水表面時(shí)，很容易形成親水端向下脂質(zhì)單分子層，將單分子層背靠背地折疊起來，就形成類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的人工脂質(zhì)雙層。純的脂質(zhì)雙層幾乎是絕緣的，但是將含有通道蛋白的脂

32、質(zhì)小泡融入人工脂膜或?qū)⑺苄酝ǖ赖鞍字苯硬迦肴斯ぶ|(zhì)雙層，便可利用膜片鉗技術(shù)記錄到單通道電流。 三三 膜片鉗記錄的基本步驟膜片鉗記錄的基本步驟 （一）、液體配制（一）、液體配制 主要根據(jù)研究通道的不同，所用細(xì)胞的主要根據(jù)研究通道的不同，所用細(xì)胞的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持2 2個(gè)個(gè)平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。 （二）、標(biāo)本制備 膜片鉗實(shí)驗(yàn)一般是在單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用單細(xì)胞主要來自培養(yǎng)細(xì)胞或急性酶分離的細(xì)胞，也可來自腦片細(xì)胞中

33、的原位細(xì)胞。常用的酶是膠原酶和蛋白酶，單獨(dú)或聯(lián)合使用，有些組織還要加用其它酶，如彈性纖維酶等。v 豚鼠心室肌細(xì)胞急性酶分離方法 v 腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離 （三）、微管電極的制備（三）、微管電極的制備 一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在12m之間，拋光與涂布液體硅酮樹酯后，充灌電極液。1 1、微管電極拉制、微管電極拉制 2 2、電極熱拋光、電極熱拋光 3 3、緣樹脂涂抹、緣樹脂涂抹 4 4、電極液充灌、電極液充灌 （四）、高阻抗封接形成（四）、高阻抗封接形成 1在恒溫條件下，將細(xì)胞貼壁良好的載玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以盡量減少電極進(jìn)入浴液的深度，從而減少浮游電容；2倒置相差

34、顯微鏡下選擇立體感強(qiáng)、活性好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；3使用新拉制的微管電極，用細(xì)塑料管以反充灌方式灌電極液入電極尖端，若含有氣泡，可手持微電極使其尖端朝下，用手指敲彈幾下管壁即可排除，然后再將微電極安裝在探頭上。4 4 當(dāng)微管電極在微推進(jìn)器幫助下進(jìn)入浴液時(shí)，當(dāng)微管電極在微推進(jìn)器幫助下進(jìn)入浴液時(shí)，用注射器向電極施加一正壓（用注射器向電極施加一正壓（12cm12cmH H2 2O O），），以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調(diào)節(jié)放以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調(diào)節(jié)放大器上大器上pipette offsetpipette offset旋鈕，將電極電壓補(bǔ)償旋鈕，將電極電壓補(bǔ)償?shù)搅?。同時(shí)由膜片鉗放大器向微管

35、電極發(fā)放到零。同時(shí)由膜片鉗放大器向微管電極發(fā)放電壓為電壓為5mV5mV、波寬、波寬40ms40ms的方波脈沖信號(hào)，用于的方波脈沖信號(hào)，用于觀察封接過程；觀察封接過程；5 5微推進(jìn)器將微管電極送入到即將接觸細(xì)胞時(shí)，撤微推進(jìn)器將微管電極送入到即將接觸細(xì)胞時(shí)，撤去正壓，并繼續(xù)向選定的細(xì)胞表面推進(jìn)，當(dāng)電極尖去正壓，并繼續(xù)向選定的細(xì)胞表面推進(jìn)，當(dāng)電極尖端輕觸到細(xì)胞表面時(shí)其應(yīng)答電流變小，這時(shí)只要給端輕觸到細(xì)胞表面時(shí)其應(yīng)答電流變小，這時(shí)只要給微管電極尖端管腔內(nèi)施加一負(fù)壓（微管電極尖端管腔內(nèi)施加一負(fù)壓（1020cm H1020cm H2 2O O），），若在計(jì)算機(jī)屏幕上看到應(yīng)變電流突然下降至零，電若在計(jì)算機(jī)屏

36、幕上看到應(yīng)變電流突然下降至零，電流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細(xì)胞形成流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細(xì)胞形成近似電絕緣，其阻抗約近似電絕緣，其阻抗約10100G10100G，說明，說明高阻抗封接高阻抗封接（gigagiga seal seal）形成，這時(shí)的膜片為細(xì)胞貼附式膜片。）形成，這時(shí)的膜片為細(xì)胞貼附式膜片。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，再制成不同類在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，再制成不同類型的膜片構(gòu)型。型的膜片構(gòu)型。保證高阻封接要點(diǎn)：保證高阻封接要點(diǎn)： 電極電阻適當(dāng)；電極電阻適當(dāng)； 電極尖端清潔；電極尖端清潔； 負(fù)壓抽吸系統(tǒng)密閉；負(fù)壓抽吸系統(tǒng)密閉； 電極與細(xì)胞相貼適度；電

37、極與細(xì)胞相貼適度； 細(xì)胞膜清潔，活性好。細(xì)胞膜清潔，活性好。 膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖灌流槽In bathPushed against cellMore pressure against cellSealGo whole cell（五）、數(shù)據(jù)采集與分析（五）、數(shù)據(jù)采集與分析 實(shí)驗(yàn)中通道電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大后再經(jīng)實(shí)驗(yàn)中通道電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大后再經(jīng)1212位位A/DA/D、D/AD/A轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)用于電流信號(hào)采集，轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)用于電流信號(hào)采集，系統(tǒng)連接如下圖所示：系統(tǒng)連接如下圖所示： 分析的內(nèi)容分析的內(nèi)容 1 1、宏觀電流的分析、宏觀電流的分析 宏觀電流（宏觀

38、電流（macroscopicalmacroscopical current current）是指）是指膜上許多通道同時(shí)開放形成的離子電流膜上許多通道同時(shí)開放形成的離子電流，是，是由許多單通道電流總和形成的。應(yīng)用電壓鉗由許多單通道電流總和形成的。應(yīng)用電壓鉗技術(shù)在單細(xì)胞或多細(xì)胞標(biāo)本上記錄的電流和技術(shù)在單細(xì)胞或多細(xì)胞標(biāo)本上記錄的電流和膜片鉗全細(xì)胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。膜片鉗全細(xì)胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。（1 1）、通道的藥理學(xué)特性）、通道的藥理學(xué)特性 通道的藥理學(xué)特性是通道分類的重要依據(jù)，許通道的藥理學(xué)特性是通道分類的重要依據(jù)，許多通道具有多通道具有特異性阻滯劑特異性阻滯劑和和激動(dòng)劑激動(dòng)劑

39、（或開放劑）。（或開放劑）。TTXTTX鈉通道特異性阻滯劑，鈉通道特異性阻滯劑，TEATEA鉀通道特異性阻滯劑，鉀通道特異性阻滯劑，CromakilinCromakilinATPATP敏感鉀通道特異性開放劑敏感鉀通道特異性開放劑 利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確認(rèn)通道的種類。認(rèn)通道的種類。 （2 2）、通道的門控特性）、通道的門控特性 通道的通道的門控性門控性主要是指主要是指電壓門控通道的激活與失電壓門控通道的激活與失活對(duì)電壓和時(shí)間的依賴性?；顚?duì)電壓和時(shí)間的依賴性。典型的電壓門控通道的典型的電壓門控通道的活動(dòng)包括激活過程和失活過程?；顒?dòng)包括激活過程和

40、失活過程。鈉通道門控的H-H模型 （3 3）、通道的電流）、通道的電流電壓關(guān)系電壓關(guān)系 通道的電流通道的電流電壓關(guān)系（電壓關(guān)系（current-voltage current-voltage relationship, relationship, 簡稱簡稱I-VI-V曲線曲線）是反映離子通道）是反映離子通道動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù), ,可分析通道的激活過程、可分析通道的激活過程、反轉(zhuǎn)電位、整流特性和離子選擇性等。反轉(zhuǎn)電位、整流特性和離子選擇性等。 要獲得要獲得I-VI-V曲線，需要給予連續(xù)變化的階躍曲線，需要給予連續(xù)變化的階躍式脈沖電壓。式脈沖電壓。、通道整流特性的分析、通道整

41、流特性的分析 通道通道I-VI-V關(guān)系曲線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)是該通道電關(guān)系曲線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)是該通道電流的流的反轉(zhuǎn)電位反轉(zhuǎn)電位V Vrevrev或稱或稱零電流電位零電流電位。通道的整流特。通道的整流特性則是指通道電流對(duì)膜電位的依賴性，通?？捎眯詣t是指通道電流對(duì)膜電位的依賴性，通?？捎肐-I-V V關(guān)系予以判斷。關(guān)系予以判斷。通道的電流電壓關(guān)系曲線 l 整流（Rectification） 電流和電壓的關(guān)系不滿足歐姆定律的直線關(guān)系。原因是離子通道的開放導(dǎo)致膜電阻迅速降低。整流現(xiàn)象是許多離子通道的特點(diǎn)。有整流有整流無整流無整流V=IRcV=IRv離子通道不開放時(shí)離子通道不開放時(shí)膜的被動(dòng)反應(yīng)膜的被動(dòng)反應(yīng)離

42、子通道開放時(shí)離子通道開放時(shí)膜的主動(dòng)反應(yīng)膜的主動(dòng)反應(yīng)v 外向整流外向整流隨膜電位的去極化，隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向曲線明顯向Y軸（電流軸）軸（電流軸）靠近靠近。如。如IK電流。電流。v 內(nèi)向整流內(nèi)向整流隨膜電位的去極化，隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向曲線明顯向X軸（電壓軸）軸（電壓軸）靠近靠近。如煙堿電流。如煙堿電流。 IK電流的外向整流電流的外向整流煙堿電流的內(nèi)向整流煙堿電流的內(nèi)向整流去極化方向去極化方向去極化方向去極化方向、通道離子選擇性的分析、通道離子選擇性的分析 如果通道的離子選擇性很高，只能或主要如果通道的離子選擇性很高，只能或主要通過一種離子，則通過一種離子，則V Vr

43、evrev應(yīng)等于或接近該離子的應(yīng)等于或接近該離子的平衡電位。平衡電位。如果通道通過多種離子，則可利用如果通道通過多種離子，則可利用改變膜兩側(cè)某種離子濃度差以后的改變膜兩側(cè)某種離子濃度差以后的V Vrevrev變化來變化來判斷膜電流中是否的該離子成分。例如判斷膜電流中是否的該離子成分。例如I If f通道通道的的I-VI-V曲線隨曲線隨NaNa。的增高而右移，。的增高而右移，V Vrevrev相應(yīng)變相應(yīng)變正，說明正，說明I If f通道對(duì)鈉離子有通透性。通道對(duì)鈉離子有通透性。2 2、單通道電流的分析、單通道電流的分析（1 1）、通道門控動(dòng)力學(xué)的分析）、通道門控動(dòng)力學(xué)的分析 典型的單通道電流（典型

44、的單通道電流（single channel currentsingle channel current）呈一種振幅相同而持續(xù)時(shí)間不等的脈沖樣變化。呈一種振幅相同而持續(xù)時(shí)間不等的脈沖樣變化。它有兩個(gè)電導(dǎo)水平，即它有兩個(gè)電導(dǎo)水平，即0 0和和1 1，分別對(duì)應(yīng)關(guān)閉和開，分別對(duì)應(yīng)關(guān)閉和開放狀態(tài)。放狀態(tài)。 A：豚鼠心室肌內(nèi)向整流鉀通道的單通道電流； B：同一膜片上通道開放（上）和關(guān)閉（下）時(shí)間頻數(shù)分布直方圖。 （2 2）、單通道電導(dǎo)的測定）、單通道電導(dǎo)的測定 在幾個(gè)不同的鉗制電位下記錄膜片上單在幾個(gè)不同的鉗制電位下記錄膜片上單通道電流，右圖為得到單通道的通道電流，右圖為得到單通道的I-VI-V曲線，曲曲線，曲線斜率即單通道電導(dǎo)。線斜率即單通道電導(dǎo)。 蛙骨骼肌細(xì)胞貼附式膜片的記錄 A：不同鉗制電位下記錄的N2型乙酰膽堿受體陽離子通道電流，左側(cè)數(shù)字為膜電位（mV）。B：單通道電流的IV關(guān)系，膜電導(dǎo)32pS。l I-V曲線（曲線（Current-voltage curve）電流電流-電壓關(guān)系曲線?？煞从惩ǖ赖娜缦聞?dòng)力學(xué)參數(shù)：電壓關(guān)系曲線。可反映通道的如下動(dòng)力學(xué)參數(shù)：v 激活過程激活過程v 閾電位閾電位v 反轉(zhuǎn)電位反轉(zhuǎn)電位v 整流特性整流特性 I(nA)Ca2+o =5.0mM-8-6