第一章激光掃描共聚焦顯微鏡基本結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)

1、第二部分 激光生物技術(shù) 目前，較成熟的激光生物技術(shù)有： 1.激光顯微鏡：激光共聚焦斷層掃描顯微鏡、激光多普勒顯微術(shù)； 2.激光光譜分析技術(shù)：激光微束技術(shù)、激光流式細(xì)胞儀分析技術(shù)等。 3.激光超短脈沖技術(shù)：激光DNA測(cè)序技術(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及其應(yīng)用 光學(xué)顯微鏡17世紀(jì) Hook觀察到細(xì)胞形態(tài) 電子顯微鏡1931年電鏡誕生 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 共聚焦顯微鏡55年Minsky建立了一臺(tái)工作顯微鏡，57年提出共聚焦理論，并獲得了美國(guó)專利 60年激光誕生1590年荷蘭詹森發(fā)明第一臺(tái)顯微鏡 69年耶魯大學(xué)Davidovits和Egger等，物鏡掃描式共聚焦 70年牛津大學(xué)Sheppard和Wilson等

2、，臺(tái)階式掃描共聚焦 1987年，White 和Amos 在Nature發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時(shí)代的到來(lái)”論文。 近二十年來(lái)，人們對(duì)共焦高分辨率，采集圖像快 速技術(shù)的改進(jìn)及應(yīng)用開(kāi)發(fā)不斷進(jìn)行，出現(xiàn)了很多 新的技術(shù)，如雙光子、FCS、FLIM、STED等。PtK2 細(xì)胞：微管，細(xì)胞核擬南芥細(xì)胞：葉綠體 細(xì)胞核雙染 激光掃描共聚焦顯微技術(shù) (confocal)是目前生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域最先進(jìn)的熒光成像和細(xì)胞分析手段之一。近年來(lái)，該技術(shù)發(fā)展迅速、應(yīng)用領(lǐng)域日趨廣泛。第一章 激光掃描共聚焦顯微鏡 的基本結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)及工作原理1.基本結(jié)構(gòu)laser confocal scanning microscope, LCSM獨(dú)

3、特恒溫培養(yǎng)箱 專用CO2培養(yǎng)室（精確控制CO2濃度、溫度、濕度等）； 專用加藥及顯微注射的小孔（方便加藥注射）。實(shí)際上是一臺(tái)特殊的熒光顯微鏡： 共扼聚焦裝置掃描裝置激光光源檢測(cè)及圖像分析系統(tǒng)熒光顯微鏡（裝有微距步進(jìn)馬達(dá)）普通熒光顯微鏡成像效果不足： 樣品所有點(diǎn)被同時(shí)照射和參與成像; 圖像發(fā)虛和分辨率降低其一，其二是 Non-Confocal Scan of the 3D Reconstruction of Astrocyte by Same Cell Simulated Fluorescence Process 共聚焦系統(tǒng) CCD CONFOCAL 當(dāng)觀察樣品稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡接收來(lái)自焦平

4、面及其上、下方的散射熒光，來(lái)自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低 。 焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛與普通熒光顯微鏡比較，CONFOCAL的特點(diǎn)：的特點(diǎn)： 1.光學(xué)結(jié)構(gòu)為共扼聚焦結(jié)構(gòu)，抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像； 2.增加了激光掃描部分，可連續(xù)、固定范圍內(nèi)小功率掃描，記錄動(dòng)態(tài)變化； 3.具有更高的縱向分辨率，可實(shí)現(xiàn)樣品的多層掃描（細(xì)胞CT）。Fluorescent MicroscopeArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitatio

5、n PinholePMTExcitation FilterConfocal MicroscopeCONFOCAL的特點(diǎn)的特點(diǎn)C-CCD cameraConfocal細(xì)胞標(biāo)本2.主要功能特點(diǎn)1) 可無(wú)損傷地對(duì)樣品進(jìn)行逐層斷層掃描，并將各層面的連續(xù)光切片進(jìn)行三維立體重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品三維立體結(jié)構(gòu)的觀察、空間定位、定量測(cè)定（面積、厚度、空間距離、體積等）；2） 能夠?qū)铙w的各種生理信號(hào)（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、膜電位、pH值等）的動(dòng)態(tài)變化及離子分布作毫秒級(jí)的動(dòng)態(tài)觀察和監(jiān)測(cè)；3） 利用激光的點(diǎn)光源高能量特點(diǎn)可進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如膜流動(dòng)性、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞損傷和損毀實(shí)驗(yàn)等。3. 基本原理激光共

6、聚焦掃描顯微鏡光路圖激光器樣品分光鏡針孔檢測(cè)器物鏡針孔激光器樣品分光鏡針孔檢測(cè)器針孔物鏡激光器樣品分光鏡針孔檢測(cè)器物鏡Confocal原理: 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。 照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。 抑制同一焦平面上非測(cè)量點(diǎn)的雜散光； 抑制焦平面外的光。 計(jì)算機(jī)將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上； 掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦

7、圖像。 焦平面上的一層二維光切片 載物臺(tái)沿Z 軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上 隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的二維光切圖像 。 利用軟件疊合，即可獲得重構(gòu)的三維立體圖像。小結(jié)* LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，其橫向分辨率比普通光鏡高，成象聚焦后焦深小，因此也具有較高縱向分辨率。* 可無(wú)損傷地對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測(cè)量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三 維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu) 形象的稱為顯微“CT”。 * 物點(diǎn)在物鏡的焦點(diǎn)上，像點(diǎn)在會(huì)聚透鏡的焦點(diǎn)上，所以稱為共聚焦。 抑制同一焦平面上非測(cè)量點(diǎn)的雜散光； 抑制焦

8、平面外的雜散光。觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見(jiàn)光、近紅外）LSCM的基本設(shè)計(jì)特點(diǎn)照明成像方式： 點(diǎn)照明、照明 pinhole 和探測(cè)pinhole 共軛(共聚焦), 被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面, 點(diǎn)光源以逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。 輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析 具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)對(duì)多重染色樣品進(jìn)行觀察4.主要配制及性能指標(biāo)1) 激光光源： 配有Ar/ArKr激光器、GreNe激光器、HeNe激光器。 激發(fā)波長(zhǎng)為: 458nm、476nm、488nm、514nm、543nm、568nm 和633nm Ar激光器: 458nm, 476nm

9、, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm2) 物鏡： （540）物鏡、100油鏡； 高倍（40以上）物鏡的分辨率為0.3m，物鏡放大倍數(shù)精確度達(dá)5%以內(nèi)。3) 總放大倍數(shù)： （51000）范圍 另電子放大倍數(shù)132倍4) 激光分辨率：250nm5) 功能：明視場(chǎng)、DIC（微分干涉） 6) 樣品最大厚度: 取決于物鏡的NA、物鏡的工作距離、激光的穿透力(單光子- 50 m ；雙光子-500 m ) 、樣品的透明度，Z軸的最大移動(dòng)范圍(166m、Z-wide)。 待測(cè)樣品最大厚度約1-2mm。7) 樣品最小光切厚度： Z軸

10、的最小移動(dòng)步距40nm， Z軸的分辨率為0.35 m8) 四個(gè)熒光通道, 一個(gè)透射光通道(非共焦圖像) 注：對(duì)未標(biāo)記的標(biāo)本，可采集反射光圖像。9) 掃描速度: slow（220lines/s） slow2（440lines/s雙向掃描） medium（450lines/s） medium2（900lines/s） fast（1000lines/s） fast2（2000lines/s）10) 掃描密度: 6464、 128128、 512512、 10241024、 20482048Zoom2Zoom4激光掃描共焦顯微鏡的研究焦點(diǎn)： 熒光染料的開(kāi)發(fā)、細(xì)胞的制備方法和電子信號(hào)處理能力的提高。 此外，顯微鏡研發(fā)： 1.連續(xù)光譜型 Confocal 2.多光子激光掃描顯微鏡 (Multiphot