4 第三章 滅活劑、保護劑與免疫佐劑（章節(jié)課程）

1、第三章 滅活劑、保護劑與免疫佐劑2007-11-251教學(xué)課資第一節(jié)滅活劑一、滅活與滅活劑獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中，滅活（inactivation）是指破壞微生物的生物學(xué)活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性。被滅活的微生物主要用于生產(chǎn)滅活疫苗；或指破壞診斷血清或待檢血清中的補體活性，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。滅活的對象不同，采用的方法也不盡相同。2教學(xué)課資本節(jié)主要講解微生物的滅活方法及其作用機理。研制滅活生物制品，選擇合適的滅活劑和滅活方法十分重要。滅活的主要方法有兩類，即物理學(xué)方法和化學(xué)方法。3教學(xué)課資1.物理學(xué)滅活方法：有加熱及射線照射等方法，過去用加熱滅活方法者較多。該法簡單

2、易行，但加熱殺死微生物的方法比較粗糙，容易造成菌體蛋白質(zhì)變性，因而免疫原性受到明顯影響，所以，該滅活方法已基本不用。 射線照射則主要通過破壞核酸來達到滅活微生物體的目的，而微生物的蛋白質(zhì)、脂類和多糖等有機化合物的一般不受影響。因此，射線照射不破壞微生物的免疫原性，如60Co照射處理后的血清或裂解紅細胞全血的質(zhì)量沒有發(fā)生變化，經(jīng)測定17種氨基酸含量與非照射的血清無差異。4教學(xué)課資60Co照射(rad拉德 )應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。用60L大玻瓶裝6L的血清或血液，吸收60Co量200萬rad/h能完全殺死芽孢桿菌，150萬rad/hr可使非芽孢菌完全滅活。含雞

3、新城疫病毒的雞胚尿囊液，吸收60Co劑量達50萬rad/h，病毒可完全被滅活。豬瘟病毒強毒吸收量達到300萬rad/h完全失去致病力。被60Co照射處理的血清用于細胞培養(yǎng)，與未照射的血清比較，病毒培養(yǎng)效果一致；被照射處理的裂解全血，不影響牛出敗菌及禽霍亂菌的生長，制出的菌苗免疫效力良好。5教學(xué)課資2.化學(xué)滅活方法：用于滅活微生物的化學(xué)試劑或藥物稱為滅活劑（inactivator）。 化學(xué)滅活劑的種類很多，作用的機理也不同，而且滅活的效果受多種因素影響。6教學(xué)課資（一） 甲醛溶液甲醛是最古典的滅活劑，至今仍是生物制品研究與制造中最主要的滅活劑。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的獸醫(yī)生物制品制造及檢驗規(guī)程（2000

4、）中的26種滅活疫苗，均以甲醛作為滅活劑。 甲醛溶液是甲醛氣體的水溶液，又稱福爾馬林。常用的甲醛溶液約含37甲醛氣體（重量計），為無色透明液體，有辛辣窒息味，對眼、鼻粘膜有強烈刺激性，較冷溫度下久貯易變混濁，形成三聚甲醛沉淀，雖加熱可變清，但會降低其滅活性能，故一般商品甲醛溶液加1015甲醇，以防止其聚合。7教學(xué)課資甲醛的滅活作用機理是甲醛的醛基作用于微生物蛋白質(zhì)的氨基產(chǎn)生羥甲基胺，作用于羧基形成亞甲基二醇單酯，作用于羥基生成羥基甲酚，作用于巰基形成亞甲基二醇。 上述反應(yīng)生成的羥甲基等代替敏感的氫原子，破壞生命的基本結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物死亡。 甲醛還可與微生物核糖體中的氨基結(jié)合，使兩個亞單位間形成

5、交聯(lián)鏈，亦可抑制微生物的蛋白質(zhì)合成。 近年發(fā)現(xiàn)，對病毒和細菌等的核酸的烷化作用比對蛋白質(zhì)的作用更有利殺滅微生物。8教學(xué)課資滅活劑甲醛的濃度及處理時間適當(dāng)濃度的甲醛可使微生物喪失增殖力或毒性，保持抗原性和免疫原性。 針對不同類型的微生物，使用甲醛滅活的濃度一般為：需氧細菌0.10.2，厭氧菌0.40.5。病毒0.050.4（多數(shù)為0.10.3）。 不論是殺菌或脫毒，使用甲醛或其他滅活劑，滅活劑的濃度及處理時間都要根據(jù)試驗結(jié)果來確定。 通常以用低濃度、處理時間短而又能達到徹底滅活目的為原則，必要時可在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應(yīng)。9教學(xué)課資滅活疫苗/甲醛濃度/時間/溫度氣腫疽明礬 0.5%甲

6、醛 3738 7296h氣腫疽甲醛 0.5%甲醛 3738 7296h肉毒梭菌(C型) 0.8%甲醛 3710d羊快疫-猝疽-腸毒血癥三聯(lián) 0.5%-0.8%甲醛 3738 37d家兔魏氏梭菌氫氧化鋁 0.8%甲醛 36-37 5d羊大腸桿菌病 0.3%甲醛 37 2448h豬丹毒、豬肺疫氧氧化鋁二聯(lián)0.25%甲醛37 l824h豬丹毒氫氧化鋁滅活疫苗 0.2%0.25%甲醛37 1824h 牛出血性敗血病氫氧化鋁 0.l%0.2%甲醛 37718h豬肺疫氫氧化鋁滅活疫苗0.1%甲醛 37712h10教學(xué)課資滅活疫苗/甲醛濃度/時間/溫度 禽霍亂氫氧化鋁滅活疫苗 0.1%甲醛 37712h禽霍

7、亂油乳劑滅活疫苗 0.1%甲醛 3712h山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁0.1%甲醛1618 48h兔出熱組織滅活疫苗 0.4%甲醛 371224h牛、羊偽狂大病滅活疫苗0.15%甲醛4107d破傷風(fēng)明礬沉降類毒素 0.4%甲醛 382131d口蹄疫滅活疫苗0.05%AEI或0.02%BEI2037 720h11教學(xué)課資（二）烷化劑 （alkylating agent）含有烷基的分子中去掉一個氫原子基團的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入，形成烷基取代物。 這類化合物的化學(xué)性質(zhì)活潑，其滅活機制主要在于烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，因改變DNA的結(jié)構(gòu)而破壞其

8、功能，妨礙RNA的合成，從而抑制細胞的有絲分裂。也可與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。 因此，這類滅活劑能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而又不損害其蛋白衣殼，得以保留其保護性抗原。常用的烷化劑類的滅活劑有乙?；蚁﹣啺贰⒍蚁﹣啺泛涂s水甘油醛。12教學(xué)課資1、乙?；蚁﹣啺罚∟-acetyl ethylenimine，AEI）：為淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或醇任意混合。在04可保存1年，在-20可保存2年，但在常溫下由于分子聚合，外觀顏色及流動性均發(fā)生變化，從而導(dǎo)致滅活作用的改變。AEI功能基團是乙烯亞胺基，可用于滅活口蹄疫病毒。在口蹄疫病毒培養(yǎng)液中加入最終濃度為0.

9、05，30 8h后達到滅活目的，滅活終末需加2硫代硫酸鈉阻斷滅活。13教學(xué)課資2、二乙烯亞胺（binary ethylenimine，BEI）：市購商品為0.2的BEI溶液，在04可保存1個月。 按1/10（V/V）(終濃度為0.02%)加入口蹄疫病毒懸液中，37滅活速率對口蹄疫病毒A24毒株為每小時10log10左右。當(dāng)滅活結(jié)束時，加入2硫代硫酸鈉中斷滅活。 14教學(xué)課資3、縮水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）： 本品易揮發(fā)，水溶液含量為1531mg/ml。保存于04 3個月含量漸下降，約半年失效；20只能保存10d。 其作用機理是環(huán)氧烷基與病毒蛋白或核酸發(fā)生反應(yīng)。 1964年

10、Martinsen將其用于生物制品滅活劑，對大腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒和口蹄疫病毒等有滅活作用，據(jù)報告GDA的滅活效果優(yōu)于甲醛。法國梅里厄研究所曾用本品生產(chǎn)牛和豬的口蹄疫滅活苗。15教學(xué)課資（三）苯酚（phenol）又名石炭酸（Carbolic acid）。為無色結(jié)晶或白色熔塊，有特殊氣味，有毒及腐蝕性，暴露在空氣中和陽光下易變紅色，在堿性條件下更易促進這種變化。當(dāng)不含水及甲酚時，在4凝固，43溶解。一般商品含有雜質(zhì)，使熔點升高；與80水混合能溶化。易溶于乙醇、乙醚、氯仿、甘油及二硫化碳，不溶干石油醚。密封避光保存。 16教學(xué)課資苯酚（phenol）為羥基與芳烴族（苯環(huán)或稠苯環(huán)）直接連接的化

11、合物，是苯的一部分被酚取代的化合物。 對微生物的滅活機制是使其蛋白質(zhì)變性和抑制特異酶系統(tǒng)（如脫氫酶和氧化酶等），失去活性。生物制品的常用量為0.30.5。17教學(xué)課資（四）結(jié)晶紫（Crystal violet）別名甲基青蓮或甲紫（Methyl violet）。是一種堿性染料，為綠色帶有金屬光澤結(jié)晶或深綠色結(jié)晶狀粉未，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水和醚，有的商品為五甲基與六甲基玫瑰苯胺的混合物。 對微生物的滅活機制與其它堿性染料一樣，主要是它的陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰電的羥基形成弱電力的化合物（如COOH、PO3、H2等），妨礙微生物的正常代謝，也可能擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高，不適于

12、微生物的增殖而滅活（如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、雞白痢染色抗原等） 。18教學(xué)課資（五）-丙酰內(nèi)酯（propiolactone），又名為羥基丙酸-內(nèi)酯。 性狀為無色有刺激氣味的液體，潮氣進入時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解。 水中溶解度37（V/V），水溶液有效期10保存18h，25保存3.5h，50保存20min，密封于玻璃瓶中5保存較為穩(wěn)定。能與丙酮、醚和氯仿任意混合。 對皮膚。粘膜及眼有強刺激性，其液體對動物有致癌性。是一種良好的病毒滅劑，病毒滅活后，能保持良好的免疫原性，主要用于狂犬病滅活疫苗的制備。19教學(xué)課資三、影響滅活作用的因素（一）滅活劑特異性 某些滅活劑只對一部分微生物有明顯

13、的滅活作用，而對另一些微生物則效力很差。 如酚類能抑制和殺滅大部分細菌的繁殖體，5%石炭酸溶液于數(shù)小時內(nèi)能殺死細菌的芽胞。真菌和病毒對酚類不太敏感。 陽離子表面活性劑抗菌譜廣，效力快，對組織無刺激性，能殺死多種革蘭氏陽性菌和陰性菌，但對綠膿桿菌和細菌芽胞作用弱，其水溶液不能殺死結(jié)核桿菌。 因此在選擇滅活劑時，應(yīng)考慮其特異性，即應(yīng)考慮其對微生物的作用范圍。20教學(xué)課資（二）微生物種類與特性不同種類的微生物如細菌、病毒、真菌以及革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌對各類滅活劑的敏感性并不完全相同；細菌的繁殖體及其芽胞對化學(xué)藥物的抵抗力不同；生長期和靜止期的細菌對滅活劑的敏感程度亦有差別，另外細菌的濃度也會影

14、響滅活的效果。微生物或毒素的總氮量和氨基氮含量對滅活也有一定影響。一般含氮量越高，甲醛等滅活劑的消耗量就越大，滅活脫毒速度越慢。21教學(xué)課資（三）滅活劑濃度以甲醛為例，甲醛濃度越高，滅活脫毒越快，但抗原損失量亦較大。有人證明，加0.5%甲醛溶液脫毒的類毒素，其結(jié)合力僅相當(dāng)于0.2%甲醛溶液脫毒類毒素結(jié)合力的2/3。有時可以采用分次加入甲醛溶液進行滅活、脫毒比較緩和的方法。即將甲醛溶液分數(shù)次加入，加量由小至大，pH由低而高，溫度起初為室溫，繼而轉(zhuǎn)為允許的最高溫度，這樣對于保護抗原的免疫原性有一定好處。22教學(xué)課資（四）滅活溫度通常情況下，滅活作用隨滅活溫度上升而加速。在低溫時，溫度每上升10，細

15、菌死亡率可成倍增加。每升高10，金屬鹽類的滅菌作用增加25倍，石炭酸的殺菌作用增加58倍。但是，如果溫度超過40 或更高，對微生物的抗原性將有不利影響。23教學(xué)課資（五）滅活時間滅活時間與滅活劑濃度和作用溫度密切相關(guān)。一般隨著滅活劑濃度增高、作用溫度升高，滅活時間則縮短。在生物制品生產(chǎn)中，應(yīng)以能保征制品安全和效力，以低滅活劑劑量、低作用溫度和短時間處理為最佳。24教學(xué)課資（六）酸堿度（pH）在微酸性時滅活速度慢，抗原性保持較好，在堿性時滅活速度快，但抗原性易受破壞。滅活初期損失較快，以后逐漸減慢，尤其甲醛溶液濃度高時，在堿性溶液中抗原性損失更大。對細菌的滅活作用，pH有較大影響。pH改變時，細

16、菌的電荷也發(fā)生改變，在堿性溶液中，細菌帶陰電荷較多，陽離子表面活性劑的殺菌作用較大。在酸性溶液中，則陰離子的殺菌作用較強。同時，pH值也影響滅活劑的電離度。未電離的分子一般較易通過細菌細胞膜，滅活效果較好。25教學(xué)課資（七）有機物的存在被滅活的病毒或細菌液中，如果含有血清或其他有機物質(zhì)，會影響滅活劑的滅活能力。因為有機物能吸附于滅活劑的表面或者和滅活劑的化學(xué)基團相結(jié)合。受其影響最大的為苯胺類染料、汞制劑和陽離子去污劑。一旦汞制劑與含硫氫基化物相遇或季銨鹽類與脂類結(jié)合，則明顯降低這些滅活劑的滅活作用。26教學(xué)課資第二節(jié)保護劑（protector） 又稱穩(wěn)定劑（stabilizer），是指一類能防

17、止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞的物質(zhì)。 廣義上保護劑是指保護微生物和寄生蟲等活力和免疫原及酶和激素等生物活性的一類物質(zhì)，還包括細菌或病毒的營養(yǎng)液、賦形劑和抗氧化劑。 生物制品的冷凍真空干燥一般都加凍干保護劑，以使制品在凍干后仍保持有較高的生物學(xué)活性，而且能夠延長制品保存期和提高耐熱性。 27教學(xué)課資保護劑分類一類為滲透劑，如二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、甘油和蔗糖等，能滲入細菌細胞等生物活性物質(zhì)內(nèi)部，降低因冷凍而增加的滲透壓，防止細胞內(nèi)脫水，可保護細胞因慢凍可能產(chǎn)生的損害。28教學(xué)課資另一類是非滲透劑如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì)等，能防止細胞等生物活

18、性物質(zhì)由外向內(nèi)滲漏溶質(zhì)，可保護其在速凍和溶解時可能產(chǎn)生的損害。 根據(jù)其分子量大小，又可分為高分子物質(zhì)和低分子物質(zhì)。按其化學(xué)性質(zhì)，可分為復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物。29教學(xué)課資一些常用的冷凍干燥保護劑 分 類 保 護 劑 復(fù)合物糖類鹽類醇類酸類聚合物 脫脂乳、明膠、蛋白質(zhì)、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等檸檬酸、酒石酸、氨基酸等葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等30教學(xué)課資一、凍干保護劑的組成與作用通常由營養(yǎng)液、賦形劑和抗氧化劑三部分組成。 營養(yǎng)液可使

19、因凍干而受損傷的細胞修復(fù)，對水分子起緩解作用，并能使凍干生物制品仍含有一定量水分；還可促進高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀，增加溶解度，如脫脂乳、蛋白胨、氨基酸和糖類等，常為低分子有機物。 賦形劑主要起骨架作用，防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，保護活性物質(zhì)不受加熱的影響，使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，從而使溶解度增加，如蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚糖等，常為高分子有機物。 抗氧化劑可抑制凍干制品中的酶作用，增加生物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間的穩(wěn)定性，如維生素C、維生素E和硫代硫酸鈉等。31教學(xué)課資凍干保護劑作用機制防止活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的

20、損傷;降低細胞內(nèi)外的滲透壓差、防止細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保持細胞的活力；保護或提供細胞復(fù)蘇所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力的復(fù)蘇和迅速修復(fù)自身。對凍干生物活性物質(zhì)，一些含羥基的有機保護劑，還能替代部分結(jié)構(gòu)水，與蛋白質(zhì)中的羰基或氨基結(jié)合，保持其三級和四級結(jié)構(gòu)。 一種優(yōu)良的凍干保護劑應(yīng)充分利用上述不同物質(zhì)，發(fā)揮各自作用，進行優(yōu)化集成。32教學(xué)課資二、影響保護劑效能的因素 保護劑的效能主要表現(xiàn)在保證生物活性物質(zhì)在凍干和保存過程中的存活率。 一般來說，每種微生物或生物制品均有其最佳凍干保護劑的組合，從而獲得在凍干過程中失活率最低、增加制品的保存期。 凍干保護劑的種類、組合、配制以及組分的濃度對其效能的影響十

21、分明顯。33教學(xué)課資影響保護劑效能的因素 一種新的凍干制品在批量生產(chǎn)前應(yīng)進行系統(tǒng)的最佳保護劑的選擇試驗，包括保護劑凍干前后的活菌數(shù)、病毒滴度或效價測定的比較試驗；不同保存條件和不同保存期的比較試驗。 任何一種制品在選擇凍干保護劑時，還應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膬龈汕€，使其在共融點以下水分基本升華為原則。絕不能任意更換不明規(guī)格的材料和質(zhì)量標(biāo)準。 在凍干制品投產(chǎn)以后，仍須根據(jù)條件的改變不斷作選擇試驗，以改進凍干制品的質(zhì)量。 34教學(xué)課資1保護劑種類用不同保護劑凍干的同一種微生物，在其保存過程中存活率不同。 如分別用7.5%葡萄糖肉湯和7.5%乳糖肉湯作保護劑凍干的沙門氏菌，在室溫保存7個月后的細菌存活率分別為

22、35%和21%。35教學(xué)課資2保護劑組分濃度 可直接影響凍干制品細菌或病毒的成活率，必須嚴格掌握。 如以副大腸桿菌“D201H”加不同濃度葡萄糖作保護劑進行凍干，并測定凍干品的細菌的存活率，證明用5%10%葡萄糖存活率最高。36教學(xué)課資3保護劑配制方法配置方法不同會影響保護劑的效果， 例如含糖保護劑滅菌溫度不宜過高，否則由于糖的炭化而影響凍干制品的物理性狀和保存效果，所以均采用11430min滅菌或間歇滅菌； 又如血清保護劑就不能用熱滅菌法，必須以濾過法除菌。 37教學(xué)課資4保護劑酸堿度（pH）保護劑的pH應(yīng)與微生物生存時的pH相同或相近，過高或過低都能導(dǎo)致微生物的死亡。 例如明膠蔗精保護劑的

23、pH以6.87.0為最佳，否則會造成微生物大量死亡。 又如含葡萄糖、乳糖保護劑經(jīng)高壓滅菌后能或多或少改變保護劑的pH值，從而影響保護效果，為此最好采取濾過除菌。38教學(xué)課資三、 常用的凍干保護劑 各類微生物適用的保護劑甚多，同一種制品所使用的保護劑組成不一樣;例如 雞新城疫弱毒疫苗，我國選用5%蔗糖脫脂乳為凍干保護劑，而日本則用5%乳糖，0.15%聚乙烯吡咯烷酮、1%馬血清或0.4%蔗糖脫脂乳、0.2%聚乙烯吡咯烷酮作保護劑； 豬 丹毒弱毒菌苗，我國以5%蔗糖、1.5%明膠作凍干保護劑，而日本用5%脫脂乳、2.5%酵母浸膏為保護劑。 39教學(xué)課資（一）不同微生物適用的保護劑各類微生物常用的保護劑如下：1需氧和兼性厭氧性細菌：適用的凍干保護劑有10%蔗糖、5%蔗糖脫脂乳、5%蔗糖、1.5%明膠，10%20%脫脂乳和含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳等。2厭氧性細菌：含0.1%谷氨酸鈉的10%乳糖、10%脫脂乳