基因組編輯技術PPT課件[通用]

1、基因組編輯應用基因編輯技術不長角的奶?；蚓庉嫷亩x： 通過精確識別靶細胞DNA片段中靶點的核苷酸序列，利用核酸內切酶對DNA靶點序列進行切割，從而完成對靶細胞DNA目的基因片段的精確編輯。 基因編輯的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)技術為基礎的基因打靶技術相比，基因編輯新技術保留了可定點修飾的特點，可應用到更多的物種上，效率更高，構建時間更短，成本更低?；蚓庉嬙憩F(xiàn)代基因組編輯技術的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活細胞天然的修復機制，包括非同源末端連接(

2、NHEJ)和同源重組修復(HDR) 兩條途徑。第一代: ZFN(鋅指核酸酶) 第二代: TALEN(轉錄激活樣效應因子核酸酶)第三代: CRISPR/Cas9(成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復序列)第四代：NgAgo - gDNA 韓春雨基因編輯發(fā)展史 ZFN 基因組編輯技術 ZFN 技術是第一代基因組編輯技術，其功能的實現(xiàn)是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。 1986年Diakun 等首先在真核生物轉錄因子家族的 DNA 結合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊。 1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內切酶。 2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZF

3、N可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應用。ZFN=DNA識別域+核酸內切酶DNA識別域： 由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般34個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯(lián)體堿基。核酸內切酶： 非特異性核酸內切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA。ZFN原理和機制ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內切酶組成。其中，由 ZFP 構成的 DNA 識別域能識別特異位點并與之結合，而由Fok構成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結合可使靶位點的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細胞可以通過同源重組(HR)修復機制和非同源末端連

4、接(NHEJ)修復機制來修復 DNA。HR 修復有可能會對靶標位點進行恢復修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達到基因敲除的目的。 ZFN 誘導的基因組編輯技術可應用于很多物種及基 因位點，具有較好的發(fā)展?jié)摿Α?缺點: (1)以現(xiàn)有的策略設計高親和性的 ZFN，需要投入大量的工作和時間;(2)在細胞中持續(xù)表達 ZFN 對細胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應。TALEN 基因組編輯技術 2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉錄激活樣效應因子(TAL蛋白),它的核酸

5、結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系,一個模塊單元識別一個堿基，簡單且特異性極好。隨后，TALE特異識別 DNA 序列的特性被用來取代 ZFN技術中的鋅指蛋白。它可設計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應用潛力。 TALENs 包含兩個 TALEN 蛋白, 每個 TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個 TALEN 靶向正義鏈上靶標位點, 另一個則靶向反義鏈上的靶標位點. 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細胞啟動 DNA 損傷修復機制. 針對不同的TALE

6、N 骨架, 其最適宜的spacer長度不同, 其長度范圍一般為1220 bp. 實驗結果表明, TALENs在靶向DNA時, 第一個堿基為 T 時其結合效果更佳。通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進行靶向特異性敲除或內源基因的表達調控。 目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應用。CRISPR /Cas9 基因組編輯技術 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，日本學者首次在大腸桿菌(E. coli)基因組中發(fā)現(xiàn)一連串短的空間間隔重復序列。隨后，在其他細菌和古細菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊的序列。 2002年科學家才將其命名為成簇的規(guī)律間隔短回文重復序

7、列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，現(xiàn)有測序結果顯示40%的細菌基因組中含有CRISPR位點。 2005年，科學家們發(fā)現(xiàn)CRISPR中的許多間隔序列來源于質粒和病毒，CRISPR的基因座能夠被轉錄，并且Cas基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結構域，因此推測CRISPR/ Cas 是利用無義的RNAs標記外源核酸序列的防御系統(tǒng)。 2011年，才揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機制：當病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時，CRISPR轉錄

8、生成crRNA前體(pre-crRNA)，pre-crRNA經(jīng)過加工形成含有與外源基因匹配序列的 crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導Cas蛋白結合并切割，從而保護自身免受入侵。 2013年，研究者報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。其中分別在人類細胞和小鼠細胞中成功對部分基因實現(xiàn)了編輯。 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述 CRISPR/ Cas系統(tǒng)廣泛存在于細菌和古菌中，是它們的一種適應性免疫系統(tǒng)，能夠識別自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/ Cas系統(tǒng)有3種類型：型、型和型。 型和型CRISPR/Cas系統(tǒng)較為復雜，需要多個Cas蛋白形成復合體切割DN

9、A雙鏈，而型CRISPR/Cas系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白核酸酶來切割DNA雙鏈,即為現(xiàn)在廣泛應用于遺傳學基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。 Type系統(tǒng)中只有一種核酸酶Cas9核酸酶，在該系統(tǒng)中Cas9蛋白與crRNA參與對抗外源噬菌體和質粒的入侵。目前，Type系統(tǒng)在基因組編輯中應用的最為廣泛。 CRISPR-Cas主要由兩部分組成：CRISPR/Cas的結構CRISPR 是一個特殊的DNA重復序列家族, 廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats) 組成, 重復序列的長度通常 2148 bp, 重復序列之間被 2672 bp 間隔序

10、列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。 識別切割Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)由間隔重復CRISPR基因座轉錄出來的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA組成，其中tracrRNA促進pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元復合體。 病毒或質粒入侵細菌后，其基因組DNA暴

11、露于細菌胞漿之中，經(jīng)過同源重組，CRISPR重復序列轉錄、翻譯出的Cas復合物對外來DNA進行剪切，產(chǎn)生新的spacer序列。如果產(chǎn)生的新spacer序列能夠與CRISPR array內部的短重復序列部分互補，將會通過某種未知的方式整合到細菌基因組的CRISPR array 序列中，從而對該病毒或質粒產(chǎn)生特異性免疫記憶。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理和機制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理和機制 當同類的病毒或者質粒再次入侵該細菌時 首先，tracrRNA與pre-crRNA的重復序列結合； 第二，內源RNase 切割pre-crRNA/ tracrRNAs復合體，切除5末端的間隔序列

12、，形成成熟的crRNA，并與tracrRNA形成被稱為向導RNA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子； 第三，每一個成熟的sgRNA能夠引導Cas9蛋白定位到雙鏈DNA的靶位點上并在原型間隔毗鄰序列(Proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游38 bp位置對結合的序列進行切割(圖2A)。 Cas9的特異性靶點 依賴于原型間隔序列3端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9識別一個5- NGG-3的PAM，而來源于嗜熱鏈球菌(Strept

13、ococcus thermophilus)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分別識別5-NNAGAAW-3的PAM和5-NNNNGATT-3的PAM。 Cas9擁有兩個核酸酶結構域 分別是蛋白中間的HNH結構域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like結構域，其中HNH切割與crRNA互補的鏈，切割位點位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互補鏈，切割位點位于PAM序列上游38 bp，從而造成雙鏈的斷裂。 Cas9的特異性靶點和兩個核酸酶結構域 CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的DSB能夠激活細胞和生物體自身修復機制，產(chǎn)生兩種不同的修復途徑NH

14、EJ和HDR修復。NHEJ能夠高效地引入不同長度的插入或者缺失突變，導致轉錄閱讀框編碼序列，轉錄激活相關的啟動子和增強子的損壞；而HDR的修復通常會引入特定位點的突變或者在外源供體DNA模板存在時對靶位點進行可預測的插入。 1. PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列3端沒有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會切割該序列位點.2. sgRNA與目標基因組相結合的20nt序列區(qū)決定著CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向特異性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的關鍵點3. sgRNA的長度也與特異性密切相關。sgRNA的5端額外增加兩個鳥嘌呤核

15、苷酸后能夠顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的特異性決定于sgRNA上的識別(20nt)。然而，在復雜的生物基因組中，sgRNA的識別序列可能會與非靶點DNA發(fā)生局部匹配(Partial match)。 這種局部匹配，目前可歸結為兩類：sgRNA與脫靶位點DNA序列長度相同，但存在堿基錯配。(2) 脫靶位點DNA序列長度比sgRNA多或少幾個堿基，通過形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge)來完成其他堿基的正確配對。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應用1. DNA

16、片段靶向刪除2. DNA片段靶向反轉3. DNA片段靶向重復4. DNA片段靶向插入5. 染色體靶向易位類別ZFNTALENCRISPR /Cas9NgAgo-gDNA構成ZF ArrayFok1TALEN ArrayFok1Cas9sgRNANgAgo-gDNA靶向元件ZF Array蛋白 TALENArray蛋白sgRNA核糖核苷酸gDNA脫氧核糖核苷酸切割元件Fok 蛋白Fok 蛋白Cas9蛋白Ago蛋白優(yōu)勢單位點編輯單位點編輯多位點編輯多位點編輯靶向序列 18bp30bp23bp20bp切割類型雙鏈斷裂，單列缺刻雙鏈斷裂，單列缺刻雙鏈斷裂，單列缺刻雙鏈斷裂，單列缺刻技術難度困難較容易非

17、常容易非常容易商業(yè)價格60000每位點10000每位點1000每位點？脫靶效應較輕較輕較嚴重較輕？編輯技術對比NgAgo-gDNA編輯NgAgo-gDNA是格式嗜鹽桿菌（Natronobactricum grogoryi) ACO蛋白（Argonauto）的簡稱，其本質是一種核酸內切酶，NgAgo根據(jù)指導DNA的定位，可以有效地對基因組目標區(qū)域進行編輯。 NgAgo-gDNA 概述NgAgo是格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacteriumgregoryi）AGO蛋白（Argonaute）的簡稱，其本質是一種核酸內切酶。NgAgo酶根據(jù)指導DNA的定位，可以有效地對基因組目標區(qū)域進行編輯。Ng

18、Ago-gDNA 與 Crispr-Cas9 特點比較 NgAgo-gDNA Crispr-CAS95-P-ssDNA 介導sgRNA 介導 ssDNA無特殊二級結構要求，除靶序列一致的堿基無需其它堿基參與sgRNA由tracrRNA和crRNA組成，需求固定的二級結構結合靶序列23-25bp結合靶序列19-21bp無需PAM區(qū)需要PAM區(qū)NgAgo蛋白 由887個氨基酸組成CAS9蛋白 由1368個氨基酸組成可在哺乳動物細胞水平進行基因組編輯可在哺乳動物細胞水平進行基因組編輯NgAgo-gDNA 的優(yōu)勢1. 設計更加靈活 由于NgAgo-gDNA系統(tǒng)無PAM要求，5p ssDNA設計相較sg

19、RNA更加靈活2. 理論上精確性會比Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA識別靶序列的長度會比Crispr-Cas9長約4個堿基，另外DNA-DNA duplex的特異性比RNA-DNA duplex高,所以理論上精確性會更加高。3. 對向導序列-靶序列錯配容忍度低 脫靶率低5. 針對富含GC的靶序列，NgAgo系統(tǒng)比Cas9系統(tǒng)切割效率更高基因功能研究基因治療構建模式動物改造和培育新品種基因編輯新技術的用途1. 基因功能研究基因敲除是在活體動物上驗證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)， 但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、 ES 細胞篩選、 嵌合體動物模型選育等一系列步驟， 成功率受到多方面因素的限制。基因編輯新技術則不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具ZFN 技術已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草 等模式生物或經(jīng)濟物種的細胞或胚胎中以及包括誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在內的人體外培養(yǎng)細胞系中成功地實現(xiàn)了內源基因的定點突變，其中在果蠅、 斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。2. 基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細胞中替代有缺陷的基因， 但這種方法難以精準控制， 可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g可以精確定位， 在靶位點進