X射線晶體衍射測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)PPT通用課件

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定2011-3-30蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定方法及數(shù)量蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定年增長圖第一節(jié)：X-射線衍射技術(shù)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測定原理基本過程優(yōu)缺點應(yīng)用實例一、相關(guān)原理光的衍射現(xiàn)象X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用本質(zhì)的爭論X射線衍射的發(fā)現(xiàn)晶體學(xué)基礎(chǔ)知識X射線晶體衍射?光線拐彎了！1.光的衍射現(xiàn)象衍射現(xiàn)象：光波偏離直線傳播而出現(xiàn)光強不均勻 分布的現(xiàn)象當(dāng)縫的大?。ɑ蛘系K物的大小）跟波長相差不多時就發(fā)生明顯的衍射現(xiàn)象如果縫很寬，其寬度遠(yuǎn)大于波長，則波通過縫后基本上是沿直線傳播的，衍射現(xiàn)象就很不明顯了 惠更斯菲涅耳原理菲涅耳補充：從同一波陣面上各點發(fā)出的子波是相干波。 1818年惠更斯：光波陣面上每一點都可以看作

2、新的子波源，以后任意時刻，這些子波的包跡就是該時刻的波陣面。 1690年解釋不了光強分布！ 2. X射線的發(fā)現(xiàn)歷程及應(yīng)用失之交臂1836 法拉第 發(fā)現(xiàn)陰極射線1861 克魯克斯 陰極射線管在放電時會產(chǎn)生亮光 干版和光片有問題？1890 古德斯柏德 洗出了一張X射線的透視底片 照片的沖洗藥水或沖洗技術(shù) 發(fā)現(xiàn)X射線本質(zhì)的爭論X射線衍射2.X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用1895年 倫琴（Roentgen）發(fā)現(xiàn)故稱為倫琴射線。倫琴夫人的手的X射線照片X射線在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用倫琴的新發(fā)現(xiàn)轟動了全世界, 不到三個月, 維也納的一家醫(yī)院便拍出了應(yīng)用于醫(yī)療的X射線照片.從此, X射線拍片和射線透視成為醫(yī)學(xué)診療中常用的手段。為

3、了防止各臟器成像發(fā)生的重疊給診療帶來不便, 科學(xué)家們進(jìn)一步研究了成像更清晰、靈敏度更高的儀器。1972年，英國科學(xué)家漢斯菲爾德運用計算機和圖像重建理論, 制成了電子計算機射線斷層掃描成像裝置, 也就是已被廣泛應(yīng)用的CT。X射線與諾貝爾獎物理學(xué)獎倫琴因發(fā)現(xiàn)X射線而獲得第一屆諾貝爾物理學(xué)獎。1903 年諾貝爾物理學(xué)獎。1906 年的諾貝爾物理學(xué)獎。勞厄獲得了1914 年諾貝爾物理學(xué)獎。英國的布拉格父子1915 年的諾貝爾物理學(xué)獎。英國的巴克拉1917 年的諾貝爾物理學(xué)獎。瑞典物理學(xué)家西格班1924 年諾貝爾物理學(xué)獎。美國的康普頓1927 年諾貝爾物理學(xué)獎。前蘇聯(lián)的切連科夫1958 年諾貝爾物理學(xué)獎

4、;美國的霍夫斯塔特1961 年諾貝爾物理學(xué)獎;瑞典的西格巴恩1981 年的諾貝爾物理學(xué)獎。化學(xué)獎荷蘭的物理化學(xué)家德拜1936 年諾貝爾化學(xué)獎。美國著名化學(xué)家鮑林1954 年諾貝爾化學(xué)獎。英國生物學(xué)家肯德魯與佩魯茨1962 年諾貝爾化學(xué)獎。英國女化學(xué)家霍奇金1964 年諾貝爾化學(xué)獎。美國化學(xué)家利普斯科姆1976 年諾貝爾化學(xué)獎。英國化學(xué)家桑格和美國化學(xué)家吉爾伯特1980 年諾貝爾化學(xué)獎。英國生物化學(xué)家克盧格因1982 年諾貝爾化學(xué)獎; 美國化學(xué)家豪普特曼和卡爾1985 年諾貝爾化學(xué)獎;1988 年,米歇爾等三位德國生物化學(xué)家諾貝爾化學(xué)獎。3.X射線本質(zhì)的爭論X射線本質(zhì)的爭論-波動說巴克拉： X射

5、線波動性 標(biāo)識譜線：不管元素已化合成什么化合物，它們總是發(fā)射一種硬度的X射線，當(dāng)原子量增大時，標(biāo)識X射線的穿透本領(lǐng)會隨著增大。這說明X射線具有標(biāo)識特定元素的特性。X射線本質(zhì)的爭論微粒說X射線微粒論者 粒子具有旋轉(zhuǎn)性 布拉克父子4.X射線衍射X射線衍射的獲得波長范圍：100.1埃欲觀察其衍射現(xiàn)象則衍射線度應(yīng)與其波長差不多，晶體的晶格常數(shù)恰是這樣的線度衍射波的兩個基本特征衍射線（束）在空間分布的方位（衍射方向）和強度與晶體內(nèi)原子分布規(guī)律（晶體結(jié)構(gòu)）密切相關(guān)。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析？ 使用X射線作為物理工具，依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理，以晶體作為研究對象，晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法。5.X射線

6、的獲得：X射線管激光等離子體同步輻射X射線激光6.晶體基礎(chǔ)什么是晶體晶體的周期排布晶體的對稱性3.1什么是晶體固體物質(zhì)晶體相當(dāng)罕見的東西？非晶體晶體(Crystal )指離子、原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復(fù)排列形成的、能夠給出明銳衍射的固體結(jié)構(gòu)。 晶體什么樣（1）晶體什么樣（2）晶體什么樣（3）晶體什么樣（4）2.晶體和點陣結(jié)構(gòu)晶體的周期性結(jié)構(gòu)使得我們可以把它抽象成“點陣”來研究. 一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點陣二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點陣一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點陣 二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點陣 晶胞(Unit cell)空間點陣的單位（大小和形狀完全

7、相同的平行六面體），是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。同一個空間點陣，劃分平行六面體的方式是多種多樣的。選擇平行六面體的原則：所選平行六面體的對稱性應(yīng)符合整個空間點陣的對稱性。 選擇棱與棱之間直角關(guān)系為最多的平行六面體 所選平行六面體之體積應(yīng)最小。 當(dāng)對稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關(guān)系時，應(yīng)選擇結(jié)點間距小的行列作為平行六面體的棱，且棱間的交角接近于直角的平行六面體。單位平行六面體，a、b、c 、 是表征它本身形狀、大小的一組參數(shù)，稱為格子參數(shù)或點陣參數(shù)。cab單位平行六面體參數(shù)單位平行六面體與坐標(biāo)軸的關(guān)系：棱交角坐標(biāo)軸之間交角。 a、b、c 軸單位。a、b、c、 關(guān)系有七種情況，與單位平行六面體七種格子相

8、對應(yīng)。立方格子 a=b=c = =90o三方格子 a=b=c = 90o， 60， 109o2816 菱面體格子中為特殊角度時，演變成的三種立方體格子四方格子 a=b c = =90o六方格子 a=bc =90o =120o正交格子 a b c = =90o單斜格子 a b c = =90o 90o三斜格子 a b c 90o按結(jié)點位置，可有四種不同的類型：P 原始格子（角頂）C 底心格子（角頂、頂?shù)酌妫㊣ 體心格子（角頂、體心）F 面心格子（角頂、每個面）P 原始格子（角頂）C 底心格子（角頂、頂?shù)酌妫㊣ 體心格子（角頂、體心）F 面心格子（角頂、每個面）結(jié)構(gòu)中代表各類等同點的結(jié)點在空間的排

9、列方式來說，格子的種類有、且只有十四種。衍射方向二、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定基本過程蛋白質(zhì)獲?。ㄌ峒儯┚w生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理重原子衍生物制備衍射數(shù)據(jù)收集衍生數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)結(jié)構(gòu)模型的獲?。òㄐ拚?（2）晶體生長過程及影響因素晶核（盡量少）微晶（可用作晶種）晶體在數(shù)小時至數(shù)月后出現(xiàn)2個問題：是鹽晶嗎？能給出有用的衍射嗎？（多晶/雙晶）影響因素物理因素：溫度、壓力、震動、溶劑清潔度、試劑純度、重力、外加物理場等生物化學(xué)因素：pH、離子強度、沉淀劑/添加劑的類型和濃度等其他：溶液過飽和度、純度等“經(jīng)驗” “機器人”（2）晶體生長過程及影響因素（3）結(jié)晶方法批量結(jié)晶法 batch crystalliza

10、tion透射法 crystallization by dialysis液相擴(kuò)散法 liquid diffusion氣相擴(kuò)散法vapor diffusion氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMS生物玻璃bioglass（4）晶體的初步鑒定小分子晶體蛋白質(zhì)晶體邊界完整，漂亮常不完整，易出現(xiàn)多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或幾瓣偏軟，易碎成粉脫水不變化因脫水而變壞溶解性慢快偏光性強相對弱染色性弱強漂浮性下沉漂浮（5）衍射數(shù)據(jù)收集晶體的處理：低溫液氮氣冷流技術(shù)數(shù)據(jù)收集儀：底片、面探測器衍射分析儀器的發(fā)展

11、射線種類：連續(xù)射線 特征射線 電子衍射 中子衍射 探測技術(shù)：膠片 閃爍體計數(shù)器（點） （IP）CCD探測器（面） 圖2-22 石英的衍射儀計數(shù)器記錄圖（部分）*右上角為石英的德拜圖，衍射峰上方為（hkl）值，代表K衍射底片（外森堡相機、徘循相機）優(yōu)點：多點同時收集容易保存價格便宜缺點存在“化學(xué)霧”背景和X射線散射背景費時、費力計數(shù)管（四圓衍射儀）將X射線光子強度轉(zhuǎn)換為電信號，信號放大后再轉(zhuǎn)換成數(shù)字存入計算機隨時調(diào)用逐點收集數(shù)據(jù)優(yōu)缺點與底片相反面探技術(shù)-SMART APEX-CCD衍射儀Smart CCD OverviewSMART APEX-CCD探測器金屬絲構(gòu)成的面板，可同時多點收集將X射線

12、光子強度轉(zhuǎn)換為電信號集計數(shù)管的精確和底片的多點收集效率面探技術(shù)-SMART APEX-CCD衍射儀圖像板image plate面探測器的改進(jìn)由化學(xué)材料構(gòu)成，整塊板子密度一致高分辨率可見光下可測量集底片和面探測器的優(yōu)點于一身（6）數(shù)據(jù)分析電子密度修飾電子密度圖詮釋結(jié)構(gòu)模型精化數(shù)據(jù)處理軟件：Denzo, Scalepack三、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定優(yōu)點分辨率高不損傷樣品無污染相對快捷能得到晶體完整性的大量信息晶體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象；很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；（瓶頸）X射線晶體衍射的工作流程較長。 四、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定存在問題Last upda

13、te: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDT于1971年和1972年分別得到分辨率為2.5埃和1.8埃的豬胰島素晶體測定，這是中國闡明的第一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。豬胰島素(蛋白質(zhì)編號4ins)的兩條小鏈“中國蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究水平和世界發(fā)達(dá)國家一樣高！胰島素晶體最好的電子密度圖在北京，不在牛津?！?多蘿西霍奇金 ，1972五、應(yīng)用實例1.胰島素2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72）Nature, 2004, Mar.LHC-II是綠色植物中含量最豐富的主要捕光復(fù)合物，這種復(fù)雜的分子體系鑲嵌在生物膜中，具有很強的疏水性，難以分離和結(jié)晶。對其晶體結(jié)構(gòu)的測定是國際公認(rèn)的高難課題，也是一個國家結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究水平的重要