干擾素的工藝制備流程

1、基因工程藥物 -干擾素的制備 1 什么是干擾素u概念(interferon,IFN)：機體免疫細胞產(chǎn)生的一類細胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒應答反應而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。u根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個類型。1.1天然干擾素的分類天然干擾素的分類 1. 根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類 I 型干擾素：IFN、IFN、IFN 、IFN 來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等 功能 ：抗病毒感染、抗腫瘤生長 、免疫調(diào)節(jié)(較弱） 其中IFN-為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。 II 型干擾素：干擾素（IFN) 來源：活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)

2、生 功能：免疫調(diào)節(jié) 提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力 增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性 抑制TH2細胞形成，下調(diào)體液免疫應答 趨化作用 抗病毒和抗腫瘤作用（次要） 2.2. 根據(jù)動物來源確定分類 人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。v不同來源的干擾素1.2 重組干擾素的臨床應用重組干擾素的臨床應用v廣譜抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。v直接抗腫瘤活性（rhuIFN） 毛細胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。v免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN）v多發(fā)性硬化癥 rhuIFN2 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工

3、藝基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝干擾素生產(chǎn)工藝路線干擾素生產(chǎn)工藝路線上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:v目的基因的分離目的基因的分離克隆載體克隆載體目的基因與克隆目的基因與克隆載體的體外重組載體的體外重組重組體導入大腸桿菌重組體導入大腸桿菌K12K12受體菌的培養(yǎng)及

4、篩選受體菌的培養(yǎng)及篩選從受體菌中獲取目的基因從受體菌中獲取目的基因表達載體表達載體重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒導入大腸桿菌導入大腸桿菌受體菌的篩選，表達性、穩(wěn)定性等檢測受體菌的篩選，表達性、穩(wěn)定性等檢測工工程菌程菌 基因工程菌的制備一、目的基因的分離與擴增v1. 破碎細胞，用Trizol法提取總的RNAv2. 將生產(chǎn)干擾素的人白細胞的mRNA分級分離然后進行凝膠電泳切取目的基因片段v3. 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAv4. 以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物v5.人工加尾形成“粘性末端”二、構(gòu)建重組質(zhì)粒v1. 提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切

5、，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應的酶酶切，用連接酶連接E EcocoR IR IB BamamH IH IE EcocoR IR IB BamamH IH I 2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。 3.鑒定序列無誤后，導入受體細胞，篩選三、重組體引入宿主細胞 將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。四、受體菌的篩選 由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況 五、分析保存

6、 對基因工程大腸桿菌進行評價分析，并保存菌種。干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子啟開種子 制備種子液制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 粗提粗提 精提精提 半成品制備半成品制備 半成品檢定半成品檢定 分裝分裝 凍干凍干 成品檢定成品檢定 成品包裝成品包裝v1 1菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 取70下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，250 r/min活化培養(yǎng)182小時后，進行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。v2 2種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培

7、養(yǎng)34小時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌 v3.3.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0。級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)56.5小時。同時進行發(fā)酵液雜菌檢查，當OD值達9.01.0后，用5冷卻水快速降溫至15以下，以減緩細胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10以下。v4. 4. 菌體收集菌體收集 將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機，16000 r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含

8、量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于20冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。3. 干擾素的分離純化工藝過程干擾素的分離純化工藝過程 3.1、干擾素分離工藝過程 3.2、干擾素的純化工藝過程3.1 干擾素分離工藝過程v菌體裂解v預處理v初級分離(1)菌體裂解菌體裂解v裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5）v使用保護劑：EDTA，PMSF。v破碎菌體：2厘米以下的碎塊v攪拌：加裂解緩沖液，210，2hrv凍融: 細胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預處理預處理-沉淀沉淀v加絮凝劑聚乙烯亞胺: 210，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。v加凝聚

9、劑醋酸鈣溶液: 210,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。(3)離心離心v連續(xù)流離心機：210，16000 r/minv收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)v雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。（4）初級分離）初級分離v鹽析: 硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。v離心：連續(xù)流離心機，16000 r/minv保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。3. 2、干擾素純化工藝過程v溶解粗干擾素v沉淀與疏水層析 陰離子交換層析與濃縮 陽離子交換層析與濃縮 凝膠過濾層析v無菌過濾分裝(1) 溶解粗干擾素溶解粗干擾素v配制純化緩沖液： 超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45 m濾器和10 k

10、u超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至210。v檢查: 緩沖液的pH值和電導值。v溶解：210，勻漿，完全溶解。(2) 沉淀與疏水層析沉淀與疏水層析v等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。v疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中 除非疏水性蛋白 洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）v等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40 ms/cm，210，靜置過夜v超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。v透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，電導值，10 ku超濾膜，0.005 M緩沖液。(3)無菌過濾分裝無菌過濾分裝0.22 m濾膜過濾干擾素溶液v分裝v20以

11、下的冰箱中保存。(4)檢測項目檢測項目v干擾素鑒別試驗v干擾素效價測定v蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量v宿主殘余蛋白、殘余DNAv干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列v其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素半成品檢定v（1）效價測定效價測定 用細胞病變抑制法，以Wish細胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。v（2）蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定v 福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。v（3）比活性比活性v 效價的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。v（4）純度純度v 電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應

12、在95%以上。v（5 5）相對分子量測定）相對分子量測定v 還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。v（6 6）殘余外源性）殘余外源性DNADNA含量測定含量測定v 用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應低于100pg。v（7 7）殘余血清）殘余血清IgGIgG含量測定含量測定v 在應用抗體親和層析法作為純化方法時必須進行此項檢定。v（8 8）殘余抗生素活性測定）殘余抗生素活性測定v 半成品中不應有抗生素活性存在。v（9）紫外光譜掃描

13、紫外光譜掃描v 檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應在2802納米。v（10）肽圖測定肽圖測定v 用CNBr裂解法，測定結(jié)果應符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應一致。v（11）等電點測定等電點測定 等電聚焦電泳。v（12）除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質(zhì)除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質(zhì)試驗。試驗。成品檢定v（1）物理性狀物理性狀v 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。v（2）鑒別試驗鑒別試驗v 應用ELISA或中和試驗檢定。v（3）水分測定水分測定v 用卡氏法，應低于3%。v（4）無菌試驗無菌試驗v 同半成品。v（5）熱原質(zhì)試驗熱原質(zhì)試驗v 同半成品檢定。v v（6）干擾素效價測定干擾素效價測定v 同半成品檢定，效價不應低于標示量。v（7）安全試驗安全試驗v 取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。 取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動物