第十二章獸藥殘留的測(cè)定教學(xué)課程

1、第十二章獸藥殘留的測(cè)定教學(xué)課程一. 獸藥殘留與危害典型的獸藥是指用于預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物。但是，隨著集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)的開(kāi)展，一些化學(xué)的、生物的藥用成分被開(kāi)發(fā)成具有某些功效的動(dòng)物保健品或飼料添加劑，也屬于獸藥的范疇。獸藥的主要用途有防病治病、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能、改善動(dòng)物性食品的品質(zhì)等。獸藥殘留是指動(dòng)物性產(chǎn)品的任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。一. 獸藥殘留的種類與危害獸藥最高殘留限量(MRLVD)是指某種獸藥在食物中或食物表面產(chǎn)生的最高允許獸藥殘留量(單位gkg，以鮮重計(jì))。獸藥殘留主要是由于各種正常用藥和藥物濫用造成的。另外，休藥期(是指自停止給藥到動(dòng)物獲準(zhǔn)屠宰或其動(dòng)物性產(chǎn)品獲準(zhǔn)上

2、市的間隔時(shí)間)過(guò)短，是造成動(dòng)物性食品獸藥殘留過(guò)量的另一個(gè)重要原因。 獸藥在動(dòng)物性食品中的殘留 獸藥的原形化合物及其代謝物在動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品（如奶、蛋）中的蓄積、貯存，稱為食品動(dòng)物的獸藥殘留。（狹義）化學(xué)物 (Chemicals)殘留：除獸藥外還包括通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的農(nóng)藥（如殺蟲(chóng)劑、除草劑等）和環(huán)境污染物(如重金屬、霉菌毒素等)。（廣義）在生產(chǎn)中大量使用抗菌藥物、抗寄生蟲(chóng)藥物及各種促生長(zhǎng)制劑，這些藥物都會(huì)以原形或以有活性的代謝產(chǎn)物形式隨動(dòng)物糞便、尿液或其他排泄物進(jìn)入環(huán)境。這些物質(zhì)在環(huán)境土壤、微生物、水生生物、植物等蓄積或貯存。獸藥在生態(tài)環(huán)境中的殘留 獸藥殘留的產(chǎn)生產(chǎn)生的途

3、徑獸藥和添加劑的使用防治動(dòng)物疫病使用藥物添加劑環(huán)境污染物不遵守休藥期的規(guī)定標(biāo)簽外用藥:劑量、劑型、給藥途徑、療程、適應(yīng)癥、動(dòng)物非法使用違禁藥物克倫特羅、己烯雌酚等污染飼料加工、貯藏、運(yùn)輸獸藥殘留產(chǎn)生的主要原因 獸藥殘留毒性急性毒性作用慢性毒性作用特殊毒性作用病原菌的耐藥性對(duì)胃腸道菌叢的影響急性毒性克倫特羅（瘦肉精）中毒慢性毒性氯霉素、氨基糖苷類、灰黃霉素等雌激素類（己烯雌酚）、同化激素（苯丙酸諾龍）喹惡啉類（卡巴氧）硝基呋喃類（呋喃西林、呋喃他酮）砷制劑苯并咪唑類殺蟲(chóng)劑（666）氯羥吡啶、SM2等甲醛、苯酚等特殊毒性（“三致作用”）激素樣作用對(duì)內(nèi)分泌功能的影響對(duì)生育能力的影響兒童性早熟過(guò)敏反應(yīng)

4、青霉素類、四環(huán)素類、磺胺類等 對(duì)人類腸道微生物的影響破壞或抑制人體胃腸菌群中敏感菌的生長(zhǎng)。導(dǎo)致條件性病原菌的大量繁殖或體外病原菌侵入腸道。改變腸道菌群的代謝活性，使菌群改變藥物和食物固有活性和毒性的的生物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生變化。引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致人類感染性疾病治療的失敗。二.常見(jiàn)獸藥殘留的種類 1抗生素類藥物 這類藥物多為天然發(fā)酵產(chǎn)物，是臨床應(yīng)用最多的一類抗菌藥物，如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。青霉素類最容易引發(fā)超敏反應(yīng)，四環(huán)素類、鏈霉素有時(shí)也能引起超敏反應(yīng)。輕至中度的超敏反應(yīng)一般表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)血壓下降、皮疹、身體發(fā)熱、血管神經(jīng)性水腫、

5、血清病樣反應(yīng)等，極度超敏反應(yīng)可能導(dǎo)致過(guò)敏性休克甚至死亡。長(zhǎng)期攝入含氨基糖苷類殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品，可損害聽(tīng)力及腎臟功能。2磺胺類藥物 主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來(lái)，磺胺類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象，在所有獸藥當(dāng)中是最嚴(yán)重的。長(zhǎng)期攝入含磺胺類藥物殘留的動(dòng)物性食品后，藥物可不斷在體內(nèi)蓄積?；前奉愃幬锏亩拘宰饔脫p害泌尿系統(tǒng) 磺胺類藥主要經(jīng)腎臟排出，在尿中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當(dāng)尿液偏酸性時(shí)，可在腎盂、輸尿管或膀胱內(nèi)析出結(jié)晶，產(chǎn)生刺激和阻塞，造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結(jié)晶尿、血尿、管型尿。 引起過(guò)敏反應(yīng) 抑制造血系統(tǒng) 導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性磺胺類藥

6、物結(jié)構(gòu) 磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)為對(duì)氨苯磺酰胺，簡(jiǎn)稱磺胺的衍生物， 具有芳氨基和磺酰胺基，多為兩性化合物 。常用的磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式： 磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu) 磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用 磺胺藥對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌都有抑制作用，在食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)中，磺胺類藥物不僅作為獸藥被廣泛用于獸醫(yī)臨床對(duì)細(xì)菌感染性疾病的防治，有時(shí)也被用作飼料添加劑?；前匪幍乃幋鷦?dòng)力學(xué) 磺胺藥主要在肝臟中代謝，常見(jiàn)的方式是在對(duì)位氨基處發(fā)生乙?；?，其次是羥基化作用。有的磺胺藥其乙酰代謝物的水溶性低，易在腎小管內(nèi)析出結(jié)晶，而有些代謝物雖水溶性較高，但在酸性尿中也容易結(jié)晶析出，容易引起結(jié)晶尿和腎并發(fā)癥?；前奉愃幬飳?duì)食品的污

7、染使用過(guò)磺胺類藥物的動(dòng)物，如果不遵守適當(dāng)?shù)男菟幤?，其肌肉組織、蛋和奶中就會(huì)被殘留的磺胺類藥物污染；短期大劑量或長(zhǎng)期小劑量給藥，很容易造成磺胺類藥物在動(dòng)物各組織中蓄積；當(dāng)飼料或飲水被磺胺類藥物污染后，也可導(dǎo)致動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留量嚴(yán)重超標(biāo)；很多研究表明豬肉及其制品中磺胺藥物超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，特別是致癌性的磺胺二甲基嘧啶殘留給人類的健康帶來(lái)了威脅。食品中磺胺類藥物的最高殘留限量英、美等國(guó)家對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1；歐盟第675/92號(hào)令中規(guī)定了，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得超過(guò)100 gkg-1；日本要求的最高殘留限量更嚴(yán)格，單個(gè)磺胺殘留限量為2

8、0 gkg-1 ，最大殘留總量不得超過(guò)100 gkg-1；我國(guó)對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1。提取和凈化方法 磺胺類藥物不易溶于非極性溶劑，而在極性較大的溶劑中溶解性較好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。凈化方法主要有柱色譜，TLC，液液萃?。↙LE），固相萃?。⊿PE）和基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）等。 磺胺類藥物的HPLC法色譜條件常采用反相硅膠柱對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分離，主要有C18，C8或者C4柱，有時(shí)也采用離子對(duì)色譜柱。流動(dòng)相主要由乙睛-水，甲醇-水或者乙睛-甲醇-水按不同比例組成，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用乙醇-水系統(tǒng)。在以上流動(dòng)相系統(tǒng)中加入適量乙

9、酸或者十二烷基磺酸鈉（SDS）常用于提高分離效率?；前奉愃幬锏腍PLC法色譜條件磺胺類藥物在色譜柱上的保留值不僅受流動(dòng)相的極性影響，還會(huì)受磺胺類藥物的解離形式的影響，因此，流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜分離的效果起重要作用。 檢測(cè)方法主要有UV，F(xiàn)LD，DAD，或者M(jìn)S。其中UV檢測(cè)器是最常用的檢測(cè)方法，波長(zhǎng)一般在270-280 nm，有時(shí)用255 nm。熒光檢測(cè)（FLD）的激發(fā)波長(zhǎng)一般為405-420 nm，發(fā)射波長(zhǎng)一般為485-495 nm。二極管陣列檢測(cè)（DAD）常采用267、268或263 nm。MS由于其高特異性，一般用于確證實(shí)驗(yàn)。 3硝基呋喃類藥物 主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃西林、呋

10、喃妥因等。通過(guò)食品攝入超量硝基呋喃類殘留后，對(duì)人體造成的危害主要是胃腸反應(yīng)和超敏反應(yīng)。劑量過(guò)大或腎功能不全者，可引起嚴(yán)重毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)炎、嗜酸性白細(xì)胞增多、溶血性貧血等。長(zhǎng)期攝人可引起不可逆性末端神經(jīng)損害，如感覺(jué)異常、疼痛及肌肉萎縮等，我國(guó)尚未制定硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。 4抗寄生蟲(chóng)類藥物 這類藥物主要用于驅(qū)蟲(chóng)或殺蟲(chóng)，如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑類抗寄生蟲(chóng)藥物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用殘留有苯并咪唑類藥物的動(dòng)物性食品，對(duì)人主要的潛在危害是致畸作用和致突變作用。對(duì)于妊娠期的孕婦有可能發(fā)生胎兒畸形，如短肢、兔唇等；對(duì)所

11、有消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，可能由于其致突變作用使消費(fèi)者發(fā)生癌變和性染色體畸變，從而其后代有發(fā)生畸形的危險(xiǎn)。5激素類藥物這類藥物主要用于提高動(dòng)物的繁殖和加快生長(zhǎng)發(fā)育速度，使用于動(dòng)物的激素有性激素和皮質(zhì)激素，而以性激素最常用，如孕酮、睪酮、雌二醇等。正常情況下，動(dòng)物性食品中天然存在的性激素含量是很低的，因而不會(huì)干擾消費(fèi)者的激素代謝和生理機(jī)能。但攝人性激素殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品，可能會(huì)影響消費(fèi)者的正常生理機(jī)能，并具有一定的致癌性，可能導(dǎo)致兒童早熟、兒童發(fā)育異常、兒童異性趨向等。 三. 獸藥殘留分析技術(shù)概述獸藥殘留分析技術(shù)的特點(diǎn)待測(cè)物質(zhì)濃度低樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多獸藥殘留代謝產(chǎn)物多樣或不明動(dòng)物種類多樣，對(duì)藥物代謝

12、存在差異 對(duì)檢測(cè)方法的要求快速高通量(high throughput)定量準(zhǔn)確度和精確度(accuracy & precision)確證(unequinocal identification)法定的和QC 理想的儀器裝備樣品經(jīng)簡(jiǎn)單處理即可上機(jī)測(cè)定不需萃取和凈化快速、準(zhǔn)確的定量分析自動(dòng)的資料處理分析方法的總體思路高水平(Level )方法確證和定量被分析物質(zhì) 中等水平(Level )方法定量但不需要確證被分析物質(zhì)低水平(Level )方法篩選 四. 獸藥殘留分析與監(jiān)測(cè)殘留分析的樣品樣品的前處理殘留檢測(cè)方法采樣與樣品制備（樣品預(yù)處理）提取凈化濃縮衍生化分辨檢測(cè)樣品處理測(cè)定分離殘留分析原理 殘留分析

13、的樣品可食性組織及產(chǎn)品肝、腎、肌肉、脂肪、皮膚、血液奶、蛋其他加工食品其他毛發(fā)、尿、糞便等取樣方法代表性原則、隨機(jī)采樣各種標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定活體檢測(cè)一般采集毛發(fā)、血液、尿液和糞便屠宰場(chǎng)取樣藥物的靶組織其他高濃度的樣本：肝、腎、膽汁、注射部位排泄物：尿液樣本的收集 樣本的貯存容器材料一般為玻璃或塑料硅烷化處理防止器皿壁對(duì)痕量殘留組分的吸附塑料吸附脂溶性物質(zhì)玻璃表面吸附堿性物質(zhì)預(yù)處理勻化、縮分、過(guò)篩、離心、過(guò)濾、防腐、抑制降解等貯存溫度要求食品中磺胺類獸藥殘留的液相色譜測(cè)定 樣品的處理1. 稱取5.0 g 勻漿樣品和10 g 經(jīng)煅燒的無(wú)水硫酸鈉，于50 mL 二氯甲烷，均質(zhì)提取1min， 3000r/min

14、 離心2 min, 上清液經(jīng)快速濾紙過(guò)濾到200 mL 濃縮瓶中， 用25 mL 二氯甲烷重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷，35 水浴氮?dú)獯蹈伞Ｉ鲜鰵堅(jiān)?.0 mL 1% （v/v） 乙酸-甲醇（65+35）溶解，漩渦混勻，轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管中，加3 mL正己烷，漩渦混勻， 靜置分層，棄上層正己烷層，再加入3 mL 正己烷，渦漩混勻，3000r/min 離心2 min, 下層用0.45 m 有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜測(cè)定?；|(zhì)干擾大的樣品，需要固相萃取柱如下的凈化步驟。2.下層加5%（v/v）乙酸溶液稀釋至3 mL，稀釋液注入預(yù)先分別用3 mL 甲醇和3 mL 5%乙酸溶液處理的Oasis HLB型固相萃取柱， 用2 mL 5% 乙酸甲醇（50+50）淋洗，最后用10 mL 5% 氨甲醇溶液洗脫，洗脫液40 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)? mL甲醇定容，供液