12+植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察

1、實驗八植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察實驗?zāi)康膶嶒炘韮x器、材料與試劑實驗步驟實驗報告及思考題1 實 驗 目 的了解細胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)2實 驗 原 理 細胞骨架（cytoskeleton）是指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質(zhì)骨架、細胞膜骨架和細胞外基質(zhì)。狹義的細胞骨架是指細胞質(zhì)骨架，包括微絲（microfilament，MF， 57nm ）、微管（microtubule，MT，2025nm）、中間纖維（intermediated filament，IF，811nm）。 細胞（特別是真核細胞）中的骨架系統(tǒng)，不僅僅是活細胞的支撐結(jié)構(gòu)，決定細胞的形狀，而且與

2、細胞運動、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細胞分裂、基因表達、細胞分化、極性生長等生命活動密切相關(guān)。3細胞骨架在通常固定條件下不穩(wěn)定，如低溫、高壓、鋨酸處理，而且MF、MT、IF都是直徑非常小的結(jié)構(gòu)，只有在電鏡下才能夠觀察到。研究細胞骨架常規(guī)的實驗方法：電鏡觀察、組織化學、免疫熒光等本實驗采用的特殊方法4Triton X100Triton X100是一種非離子型去垢劑，可以除去可溶性蛋白質(zhì)和脂類，而微絲束不會被Triton 破壞而保留在細胞中。通過Triton的處理去掉了一部分雜蛋白，使細胞骨架顯現(xiàn)更清晰。M緩沖液成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCL2等咪唑是一種緩沖劑；EDTA熬合Ca、M

3、g離子；EGTA熬合Ca離子，不熬合Mg離子；保持一種低鈣低鎂的條件。使骨架纖維保持在聚合狀態(tài)并且較為舒張?？捡R斯亮藍R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，可以使細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)染色。本實驗中，有些骨架纖維不穩(wěn)定，如微管；有些纖維太細，在光學顯微鏡下無法分辨。在實驗中觀察到的纖維主要是微絲束，由許多微絲結(jié)合在一起，直徑約在40nm左右，考馬斯亮藍R250染色對微絲束的顯示起了夸大的作用。5 實 驗 步 驟1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約1cm2，放入盛有5 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液的小培養(yǎng)皿中，使其下沉（或浸沒5min）。 2）吸去緩沖液，用1%TritonX-100處理洋蔥表皮25 min。（3mL

4、） 3）吸去TritonX-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約3 min。（3mL） 4）加3%戊二醛固定20min。（5mL） 5）用磷酸緩沖液洗3次，每次3min。（3mL） 6）0.2%考馬斯亮藍R250染色20 min。（3mL） 7）用自來水洗數(shù)遍，降低背景。 8）將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察。6結(jié)果觀察將制好的片子置于光鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細胞輪廓，細胞內(nèi)可見到被染成蘭色的粗細不等的分枝狀結(jié)構(gòu)，這便是細胞骨架。轉(zhuǎn)高倍鏡繼續(xù)觀察，調(diào)節(jié)小鏍旋可見到細胞骨架的立體結(jié)構(gòu)。7注意事項撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮不可帶莖肉。樣本要展開鋪平去垢處理要掌握好時間和溫度染色時間需掌握好，必要時可分別不同時間染色觀察時選擇平展染色適中的部位觀察染色時統(tǒng)一到水槽旁邊染色，不要污染桌面滴