腫瘤細(xì)胞與分化凋亡(三)

1、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫機制衰老腫瘤發(fā)生及化學(xué)治療 1細(xì)胞凋亡和惡性腫瘤1 Bcl2和惡性腫瘤2 P53和惡性腫瘤3Bcr-abl和惡性腫瘤4 PML-RAR蛋白和惡性腫瘤2細(xì)胞凋亡干預(yù)和腫瘤治療1 野生型P53基因介導(dǎo)的腫瘤治療2 Bcl2基因介導(dǎo)的腫瘤治療3 泛素蛋白酶體降解途徑介導(dǎo)的腫瘤治療4 三氧化二砷介導(dǎo)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療5 DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡3細(xì)胞凋亡的檢測方法1 臺肦藍（trypan blue)染色法 原理：trypan blue 是一種細(xì)胞膜非通透性染料。壞死細(xì)胞因細(xì)胞膜受損而被臺肦藍著色染色。因此，該法能區(qū)分細(xì)胞的生存狀態(tài)，簡單、便捷、常

2、規(guī)用于細(xì)胞死亡的初步評價和細(xì)胞存活率評價。 注意事項：該法不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細(xì)胞；也容易低估細(xì)胞死亡程度。（因為早期凋亡細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜而被誤當(dāng)作活細(xì)胞）42.丫啶橙染色（acridine orange,AO)和溴化乙啶(ethidium bromide,EB)雙染法原理：AO和EB都是結(jié)合DNA的熒光染料，分別產(chǎn)生藍色和橙色熒光。其中，AO能透過完整的細(xì)胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細(xì)胞。因此， AO/EB雙染法能借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀區(qū)分活細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞和壞死或繼發(fā)性壞死細(xì)胞。 注意事項：應(yīng)用單一形態(tài)學(xué)計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)（凋亡指數(shù)，apoptosis index

3、)常受到主觀因素的干擾，其個體間甚至同一主體的重復(fù)性較差。 5熒光顯微鏡觀察 圖9A 未處理的HL-60細(xì)胞 圖9B DADS處理的HL-60細(xì)胞 吖啶橙 40 吖啶橙 4063 電子顯微鏡觀察法 電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察雖可顯示凋亡細(xì)胞的許多特點，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)如微纖毛的丟失、染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮等，但由于樣本制備復(fù)雜、耗時，該項技術(shù)主要用于獲取細(xì)胞凋亡的定性檢測。783 透射電鏡觀察 圖8A 未處理的HL-60細(xì)胞 圖8B DADS處理的HL-60細(xì)胞 透射電鏡6000 透射電鏡600094 DNA斷片法或稱瓊脂糖凝膠電泳“梯形條帶”圖譜法 原理：凋亡細(xì)胞的基因組DNA常首先被剪切為20

4、0-300kb和30-50kb的片斷（“結(jié)構(gòu)域式”剪切），再進一步降解產(chǎn)生大小相當(dāng)于核小體(160-200bp)的倍數(shù)的寡核小體片斷（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為特征性“梯子”樣外觀。 注意事項：梯狀DNA(DNA ladder)現(xiàn)象常被看作是細(xì)胞凋亡的重要生物化學(xué)標(biāo)志。但是，日益增多的資料顯示并不是所有表現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞都是呈現(xiàn)這種梯子樣外觀。因此，缺乏梯狀DNA并不能排除細(xì)胞凋亡的存在。據(jù)報道，某些細(xì)胞系如K562細(xì)胞凋亡常發(fā)生單鏈而不是雙鏈DNA降解，故不能形成“DNA ladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈現(xiàn)典型“DNA l

5、adder” 。故有DNA ladder可以肯定凋亡存在，沒有DNA ladder不能排除凋亡的存在。10圖5 不同濃度DADS作用HL-60細(xì)胞24h后DNA梯狀條帶的形成圖6 60 molL-1 DADS作用HL-60細(xì)胞不同時間后DNA梯狀條帶的形成 11.TUNEL法（末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法） 原理：DNA聚合酶能夠填補雙鏈DNA中的單鏈缺 失部分，應(yīng)用放射性同位素、生物素和熒光素等標(biāo)記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。 TUNEL法是在含標(biāo)記dUTP的反應(yīng)體系中，加以末端DNA轉(zhuǎn)移酶。故又稱為TdT(terminal deoxy-transferase)法。該法是應(yīng)用無需

6、模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的堿基序列與DNA底物無關(guān)。 注意事項：該法只能了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞數(shù)量，雖然在理論上對這種方法的特異性尚有爭議，但操作簡便，并且可大量應(yīng)用于回顧性研究，從而成為目前較為流行的細(xì)胞凋亡評價方法。12TUNEL檢測結(jié)果 圖10A 未處理的HL-60細(xì)胞 圖10B DADS處理的HL-60細(xì)胞 TUNEL 20 TUNEL 20136 PI染色流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡率 原理：實驗證明凋亡細(xì)胞在固定和清洗過程中降解的小分子量DNA 外漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少。因此，應(yīng)用DNA特異熒光染料（如碘化丙啶，propidium iodide, PI）染色后，

7、在FCM進行的細(xì)胞周期分析中，凋亡細(xì)胞常以亞二聚體形式出現(xiàn)。亞二倍體細(xì)胞群被稱為亞G1期（sub-G1)細(xì)胞。它的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的重要標(biāo)志。 注意事項：識別亞G1期細(xì)胞的同時，必須將它和細(xì)胞碎片區(qū)分開來，因為細(xì)胞碎片的DNA含量也明顯低于G1期細(xì)胞。142.3 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率 control 5mgL-1DADS 7.5mgL-1DADS 10mgL-1DADS 15mgL-1DADS 20mgL-1DADS 10mgL-1DADS+PD 10mgL-1DADS+SB15圖7 PI/Annexin V雙染色檢測DADS作用HL-60細(xì)胞12h后凋亡率的變化163.3 流式細(xì)胞儀檢測

8、凋亡率 17圖12 PI/Anexin-V雙染色流式細(xì)胞儀檢測DADS作用K562細(xì)胞12h后凋亡率的改變18 E F G H圖13 流式細(xì)胞儀檢測DADS作用K562細(xì)胞24h、48h后的凋亡率改變19細(xì)胞凋亡死亡受體相關(guān)信號途徑20細(xì)胞凋亡死亡受體相關(guān)信號途徑 表3 caspase 家族主要成員序號 原名 功能 底物特異性Caspase-1 ICE 輔助炎癥 WEHDCaspase-2 ICH-1 凋亡反應(yīng) DEXDCaspase-3 CPP32,Yama,apopain 凋亡反應(yīng) DEXDCaspase-4 ICErel-,TX,ICH-2 輔助促炎癥 WEHDCaspase-5 ICE

9、rel-,TY 輔助促炎癥 WEHDCaspase-6 Mch-3 凋亡反應(yīng) (I/L/V)EXDCaspase-7 Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1 凋亡反應(yīng) DEXDCaspase-8 FLICE,MACH,Mch-5 凋亡反應(yīng) (I/L/V)EXDCaspase-9 ICE-LAP6.Mch6 凋亡反應(yīng) (I/L/V)EXDCaspase-10 Mch4 凋亡反應(yīng)Caspase-11 ICH-3Caspase-12 Caspase-13 ERICHCaspase-14 MICE(Mini-ICE)21Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60T

10、ime(h) 0 1 2 4 8 24圖30 DADS作用HL-60細(xì)胞后caspase3的表達變化22Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562Time(h) 0 1 2 4 8 24圖31 DADS作用K562細(xì)胞后caspase3的表達變化23Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRajiTime(h) 0 1 2 4 8 24圖32 DADS作用Raji細(xì)胞后caspase3的表達變化24細(xì)胞凋亡線粒體相關(guān)信號途徑MMP開放線粒體外膜PBRCyclophilin DANTPorinm 下降A(chǔ)IF Cyto C/Apaf-1

11、/procaspase-9 caspase-9-caspase-8 caspase-3 apoptosis 25BaxMitoTracker overlay圖34激光共聚焦檢測HL-60細(xì)胞中Bax的線粒體轉(zhuǎn)位26overlayMitoTrackerBax圖35激光共聚焦檢測K562細(xì)胞中Bax的線粒體轉(zhuǎn)位27DADS通過啟動Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3線粒體凋亡通路誘導(dǎo)HL-60和K562細(xì)胞凋亡。28MMP開放和caspase活化的“正反饋”環(huán)MMP開放Caspase-3活化線粒體膜屏障功能破壞線粒體腫脹Cyoto C釋放Apoptosome（proc

12、aspase-9/Apaf-1/Cyto C）Caspase-9活化膜間蛋白（如AIF）釋放刺激ceremide酶活化 剪切MMP復(fù)合物凋亡誘導(dǎo)劑結(jié)合Apaf-1 和procaspase-929內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制物1 Caspase8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)2 SODD(silencer of death domain)3 IAP（inhibitor of apoptosis protein)4 Survivin5 Bcl-2家族蛋白30Bcl2家族蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 Bcl2的兩大結(jié)構(gòu)域： TM BHBcl2家族蛋白活性調(diào)節(jié) Bcl2 家族蛋白的效應(yīng)機制31MCL1Bcl-2BidB

13、axBakGAPDHHL-60Time(h) 0 1 2 4 8 24圖24 DADS處理HL-60細(xì)胞后Bcl-2家族成員的表達變化32GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h) 0 1 2 4 8 24圖25 DADS作用K562細(xì)胞后Bcl-2家族成員的表達變化MCL133Time(h) 0 1 2 4 8 24MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHRaji圖26 DADS作用Raji細(xì)胞后Bcl-2家族成員的表達變化34Quantitation data for Cycling B.FAM/SybrStandard Curve圖27 DADS作用HL-60、K562、Raji細(xì)胞后MCL1mRNA表達水平的變化35Quantitation data for Cycling B.FAM/SybrStandard Curve圖28 DADS作用HL-60、K562、Raji細(xì)胞后BaxmRNA表達水平的變化36Standard CurveQuantitation data for Cycling B.