分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：6重組克隆子的鑒定-菌落PCR

1、實(shí) 驗(yàn) 六重組克隆子的鑒定（菌落PCR技術(shù)）從本節(jié)課起，開始考察同學(xué)們的實(shí)驗(yàn)操作1. 無菌操作：酒精燈的合理使用，保持槍頭盒，EP管盒的無菌，各種溶液不被污染。 2. 獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)：不要隨意走動(dòng)串門，不要相互加各種溶液，不要讓其他同學(xué)幫自己該做的實(shí)驗(yàn)。3. 及時(shí)做好標(biāo)記：標(biāo)記規(guī)范合理，不要搞錯(cuò)樣品和材料。4. 及時(shí)改正錯(cuò)誤：對于某些操作的錯(cuò)誤，及時(shí)改正。5. 合理規(guī)范使用實(shí)驗(yàn)器材：包括移液器，各種儀器等。 實(shí)驗(yàn)管(1#,2#,3#) 陰性對照管(-) ddH2O 17.5L 17.5L 10 xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.0mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1

2、1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (細(xì)槍頭粘菌) Taq 1.0 L 1.0 L 反應(yīng)總體積 25 L 25 L在0.2ml Ep管(標(biāo)記)中建立254=100l 反應(yīng)體系，再分裝到PCR小管中，最后加不同的模板DNA（菌），混勻。細(xì)槍頭粘菌：鑷子取細(xì)槍頭,槍頭粘1個(gè)菌落,然后置入EP管,用手轉(zhuǎn)動(dòng)槍頭幾圈,棄槍頭。(在平板上做好標(biāo)記)循環(huán)擴(kuò)增：按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增 95 預(yù)變性 5 min 94 變性 45 sec 50 退火 45 sec 72 延伸 45 sec 72 延伸 5 min 30 cycles背景理論知識Section 1

3、重組子鑒定可從以下水平進(jìn)行：DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位雜交 Southern雜交 DNA順序分析 PCR檢測mRNA水平： RNA雜交 反轉(zhuǎn)錄-PCR蛋白質(zhì)水平：免疫沉淀檢測法功能水平： 抗性反應(yīng) 顯色反應(yīng) PCR技術(shù)的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術(shù)的革命美國Mullis教授 開汽車時(shí)的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路DNA雙螺旋 行駛的汽車一小段DNA引物 1988年發(fā)明了PCR技術(shù) 1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)6.1.1 實(shí) 驗(yàn) 目 的學(xué)習(xí)PCR體外擴(kuò)增DNA原理及引物設(shè)計(jì)的原則掌握PCR的基本操作步驟學(xué)習(xí)和掌握菌落PCR檢測重組克隆子的方法了解擴(kuò)增過程中各因素對擴(kuò)增結(jié)果的影響 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)P

4、olymerase Chain Reaction, PCR 在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。6.1.2【實(shí)驗(yàn)原理】以單鏈DNA為模板、4種dNTP為底物,在模板3末端引物存在的條件下,利用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸。經(jīng)變性、退火和延伸多次循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增。6.1.2【實(shí)驗(yàn)原理】 模板DNA 引物:與被分離的目的基因兩條鏈各自5端 序列相互補(bǔ)DNA（20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈) TaqDNA聚合酶 dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP） 反應(yīng)緩沖液典型PCR反應(yīng)體系的組成6.1.2【實(shí)驗(yàn)原理】變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分

5、引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合延伸：以目的基因?yàn)槟０?合成互補(bǔ)的新DNA鏈 (延伸時(shí)間：1kb/min)每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得 230(1.07109)個(gè)基因片段6.1.3 PCR方法發(fā)展傳統(tǒng)的PCR定量PCR(測定mRNA含量)半定量PCR (RT-PCR)反向PCR(擴(kuò)增未知序列) 巢式PCR定點(diǎn)誘變和DNA測序分析的PCR技術(shù)基礎(chǔ)研究遺傳病家系分析傳染病診斷古生物及進(jìn)化分析法醫(yī)鑒定和考古學(xué)研究6.1.4 PCR方法應(yīng)用6.1.5 成功PCR的特點(diǎn)特異性：高度特異地產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增帶有效性：高效率，較少的循環(huán)獲得較多的 擴(kuò)增產(chǎn)物忠實(shí)性：體

6、現(xiàn)在由DNA聚合酶誘導(dǎo)的錯(cuò)配率非常低兩個(gè)關(guān)鍵一、正確的引物設(shè)計(jì)引物長度和GC%含量 15-60 bp，40%-60%Tm值： Tm=4(G+C)+2(A+T ) Ta=Tm - 5引物的端部 3端起始堿基決定特異性，錯(cuò)配延伸效率 TG=CA 5端堿基可呈游離狀態(tài)，可被修飾（如加酶切位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，插入啟動(dòng)子序列等） 4. 引物無回文對稱結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）5. 引物自身不能配對 5-AGCT3 3TCGA-5 引物二聚體（反應(yīng)底物，與靶序列競爭酶和dNTP）6. 二引物間不能配對7. 二引物的Tm值相近二、PCR反應(yīng)條件模板： 質(zhì)粒DNA，擴(kuò)增后的DNA，cDNA ，基因組DNA（機(jī)械剪切或稀

7、有限制酶酶切），單鏈和雙鏈， 拷貝數(shù)102-105引物： 常用濃度0.1-0.5uM, 分裝小管保存dNTP 20-200uM，4種dNTP終濃度相等Mg2+濃度 0.5-2.5mMpH半衰期 92.5 2h 95 40min 97.5 5-6min錯(cuò)誤參入率: 每2x104核苷酸中有一個(gè) 無3-5外切酶活性,無校對活性3端加poly(dA),非模板依賴堿基,T載體100L反應(yīng)體積中用量0.5-5U最適反應(yīng)溫度: 726.1.6 Taq酶(DNA聚合酶)PCR反應(yīng)的忠實(shí)性 Taq酶沒有3-5的外切活性而不能自行校正，從而導(dǎo)致錯(cuò)摻測序、定點(diǎn)誘變和克隆減少錯(cuò)摻的對策： 加入Taq酶后迅速反應(yīng)，避免

8、低溫下進(jìn)行的鏈延伸；酶濃度不可過大；dNTP 不可過濃；Mg2+濃度適中6.1.7 PCR平臺(tái)效應(yīng)定義：PCR進(jìn)行到一定次數(shù)后產(chǎn)物的積累由指數(shù)方式 向線性方式變化或反應(yīng)根本停止。原因：酶的熱失活抑制酶活的物質(zhì)dNTP的穩(wěn)定性非特異性片段的競爭模板的自身退火酶與dNTP的相對減少6.1.8 容易污染PCR反應(yīng)的靈敏度高,極易產(chǎn)生假陽性結(jié)果(一定要做陰性對照)污染來源： 樣品污染即樣品間的交叉污染 產(chǎn)物污染 其它污染：環(huán)境污染和實(shí)驗(yàn)使用的器材試劑防治方法：短波紫外線照射30分鐘；器皿類可用稀酸堿泡，使堿基脫嘌呤；PCR管、槍頭等一次性使用；試劑濕熱滅菌后小管分裝；加模板DNA后蓋緊蓋子，打開蓋子前

9、離心甩下小液滴，再慢慢打開，防止開蓋過快，形成氣溶膠。每次反應(yīng)都應(yīng)設(shè)立陽性，陰性對照。實(shí)驗(yàn)操作Section 26.2.1 實(shí)驗(yàn)材料儀器：PCR擴(kuò)增儀 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)材料： DNA模板 4種dNTP 引物1，2 Taq酶1、DNA模板的制備(挑取細(xì)菌沉淀)2、引物設(shè)計(jì)與合成(教師已做)3、PCR擴(kuò)增GFP基因4、瓊脂糖電泳檢測6.2.2【實(shí)驗(yàn)步驟】1、DNA模板的制備質(zhì)粒DNA擴(kuò)增后的DNAcDNA基因組DNA(機(jī)械剪切或稀有限制酶酶切)重組細(xì)菌(本次試驗(yàn)DH5a/pET28a-EGFP)單鏈和雙鏈,拷貝數(shù)102-1052、本次實(shí)驗(yàn)引物的設(shè)計(jì)與合成P1 XhoI5GC CTC GAG CT

10、T GTA CAG CTC GTC CAT G3 P2 EcoRI5GC GAA TTC GTG AGC AAG GGC GAG G3上海申工生物技術(shù)有限公司3、PCR擴(kuò)增GFP基因 實(shí)驗(yàn)管(1#,2#,3#) 陰性對照管(-) ddH2O 17.5L 17.5L 10 xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.5mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1 1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (細(xì)槍頭粘菌) Taq 1.0 L 1.0 L 反應(yīng)總體積 25 L 25 L混合于EP管中且混勻,Short離心4、瓊脂糖電泳檢測制膠: 配置25ml 1%瓊脂糖凝膠(2人配一塊膠,使用11個(gè)小齒的梳子)。（不知道如何配置的同學(xué)問老師）上樣電泳: 1. A1(1#) 10 l 2. A1(2#) 10 l 3. A1(3#) 10 l 4. A1(-) 10 l 5. DNA Marker 5 l 6. A2(1#) 10 l 7. A2(2#) 10 l 8. A2(3#) 10 l 9. A2(-) 10 l電泳: