免疫組化課件資料

1、免疫組化 蘇 敏汕大醫(yī)學院病理國家重點學科一、原理與方法 免疫組織與細胞化學檢查（Immunohistochemistry and immunocytochemistry examination）是利用免疫學原理，將抗原抗體反應應用與組織細胞化學而進一步通過級連放大，增加敏感性。最后用辣根過氧化物酶顯色。從而定位組織細胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多種基因產物的特異方法。 在病理學外檢工作中可用于對不同來源，HE難以診斷的的腫瘤進行確診和鑒別診斷。 其基本原理是應用抗原與抗體接觸后可形成“抗原抗體復合物”的化學反應，以檢測組織或細胞內抗原（或抗體）的技術。 Esophageal carcinom

2、a E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell. Tian Dong-Ping, Su Min et al. Fos+ in nucleusImmunohistochemistry尖銳濕疣 HPV IHC 200 郭 煜 2007 原位癌 IHC400胡彬 2007 MCM2 Ki67PCNA左）Ii（ 200/400）右）HLA-DR （ 200/400）雙標染色結果雙標染色 Ii （ 400） DR（ 400）二、免疫組織化學技術的主要步驟與常用標記物 （一）主要步驟1提取抗原(免疫原

3、Immuno-gen); 2用免疫原免疫動物(兔)制備抗血清(多克隆抗體) 或免疫動物(鼠)后，用雜交瘤技術制備單克隆抗體；3純化抗體；4抗體標記組織切片；5染色反應；6觀察結果。 （二）常用標記物 1酶 為最常用的標記物。作為標記的酶應具有以下條件：底物是特異性的，且易于顯示；酶反應產物穩(wěn)定，不易擴散；容易獲得純酶分子且較穩(wěn)定；酶標記抗體后，不影響兩者的活性；被檢組織中不應存在內源性相同的酶或其底物。常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2熒光素 指在高能量光波的激發(fā)下能產生熒光的物質。常用的有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅達明

4、（TRITC）。3生物素 其與卵白素的親和力明顯高于抗原抗體的結合力。4金屬標記物 如鐵蛋白和膠體金。多用于免疫電鏡。 三常用免疫組織化學染色方法 （一）直接法將熒光素(免疫熒光法)或酶直接標記在第一抗體上，以檢查相應的抗原。直接法具有特異性強的優(yōu)點，但敏感性差，耗費抗體多。 （二）間接法 先用熒光素或酶標記第二抗體，一抗為特異性抗體， 二抗僅有種族特異性。特點: 預先標好二抗，較方便； 比直接法敏感，但仍差。 （三）PAP法與雙PAP法： 既過氧化物酶抗過氧化物酶復合物法(Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先將過氧化物酶（HRP）免疫

5、兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗；然后再與結合，形成一個穩(wěn)定的多角形結構（PAP）。特點： 敏感性較高； 背景染色低（相對）； 雙PAP敏感性更高，但背景相對較重。 （四）ABC法： 1981年美籍華人許世明發(fā)明了ABC法 Vector 既卵白素生物素過氧化物酶復合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素與生物素特有的高度親和力，先將生物素與酶結合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一個復合物；同時先將二抗生物素化。 如將卵白素換成鏈霉親和素，則為： 法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase

6、 Complex)將鏈霉親和素和生物素先連結起來，則稱： 法：labelled StreptAvidin-Biotin用鏈霉素抗生物素蛋白連結辣根過氧化物酶，則為： 法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method)特點: 敏感性高，（比高倍）； 背景淡，鏈霉親和素更好； 方法較簡便，時間較短； 應用范圍廣，也可用于原位雜交和免疫電鏡。 。 免疫組化陽性結果色度弱陽性： 淡黃色中等陽性： 棕黃色強陽性： 棕黑色取決于：抗原量 分布密度 方法靈敏度免疫細胞化學陽性結果定位分布1.細胞膜陽性E-cad + in membrane Esophageal ca

7、rcinoma免疫細胞化學陽性結果定位分布2. 細胞漿陽性：GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell. 免疫細胞化學陽性結果定位分布3.細胞核陽性C-fos+ in nucleus免疫細胞化學陽性結果定位分布4.復合型： 核+胞漿陽性注意：固定不及時，前處理過度 可以造成假陽性免疫細胞化學陽性結果定位分布5.微絨毛型 甲狀腺、胃腸、膽管、卵巢腺癌的微絨毛 如上皮膜抗原免疫組化陽性結果定位分布1.局灶型2. 片塊型3. 彌漫型4. 網狀型5. 腺管型6. 腔緣型7. 菊團型免疫組化陽性結果強度 75% 四免疫組織化學染色過程中需注意的有關事項 正確設置免疫組織化學

8、的對照 對照原則：首先對照第一抗體；替代對照要注意相同的原則；陽性結果陰性對照，陰性結果陽性對照；染色清晰，定位準確。 陰性對照：（）空白對照：用置換第一抗體；（）血清替代對照：用同種動物的正常血清代替第一抗體；（）抑制對照：用未標記的抗體先和相應的抗原結合；（）吸收對照：用純化的抗原對抗體先行吸收；陽性對照：用已知或已被實驗證明為陽性的組織；自身對照：利用組織切片內的各種不同的組織成分作對照。 2假陽性反應： 1）Non-specific reaction (非特異性反應)：邊緣現象、皺折和刀痕、出血和 壞死等 2）Endogenous peroxidase(內源性過氧化物酶：紅細胞、炎細胞

9、、退變壞死細胞 皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等； 3）Cross-reactive (交叉反應)：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應的成分； 4）Reagent concentration is too high or invalid 試劑濃度過高或失效。 未封閉內源性過氧化物酶胃固有膜腺體3假陰性反應： 組織固定不當或固定時間過長； 抗體效價過低或久置失效； 組織中抗原被粘稠基質或分泌物阻隔； DAB或H2O2的濃度不當。 五、免疫組織化學在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應用 （一）在腫瘤診斷中應用免疫組織化學染色的原因：在常規(guī)病理活檢中,通常有的疑難病例不能明確診斷。形態(tài)結構相

10、似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤）因而難于識別，給治療帶來困難。 一些轉移性腫瘤常常缺乏特有的組織學特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌）。 通過一些反映細胞增殖和與腫瘤惡性程度有關的標記物協助識別腫瘤的良惡性。 （二）各種不同組織及其腫瘤常見的標記物： 1上皮組織及其腫瘤標記物：（）存在于所有上皮細胞內的標記物： 橋粒蛋白（desmoplakin） 細胞角蛋白（Cytokeratin,）：一種中間絲蛋白 （）存在于大部分上皮細胞內的標記物： 角蛋白多肽（如）； 組織多肽抗原（tissue polypeptide antigen,）； 上皮細胞膜抗原（epith

11、elial membrane antigen,）。（）選擇性存在于某些上皮細胞內的標記物： 角蛋白多肽（），癌胚抗原（）； 甲胎蛋白（），乳鐵蛋白（lecroferrin）； 前列腺特異性抗原（）及激素類等。 2間葉組織（軟組織）及其腫瘤標記物： （）間葉源性腫瘤：波形蛋白（Vimentin）；（）纖維組織源性腫瘤：纖維瘤、肉瘤，惡纖組。 抗胰蛋白酶（1，）； 抗胰糜蛋白酶（，）； 溶菌酶（Lysozyme）。 3肌細胞及肌上皮腫瘤及其標記物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。 結蛋白（Desmin），最常用，肌細胞分化最早的標記； 肌動蛋白（Actin），屬肌絲蛋白，種亞型分別存在于不同的肌細胞、肌上

12、皮細胞 肌球蛋白（Myosin），屬肌絲蛋白，分型（慢）和型（快）收縮纖維，存在于心肌、橫紋肌及平滑肌中，肌動蛋白和肌球蛋白均出現在肌細胞發(fā)育分化中期。 肌紅蛋白（Myoglobin），是心肌和橫紋肌結合氧的肌紅蛋白，存在于分化成熟的橫紋肌中。 內皮細胞腫瘤及其標記物：血管內皮肉瘤 第因子相關抗原（Factor -related Antigen,） 荊豆凝集素（Ulex Europaeus1 Lectin,）； 、等。 骨、軟骨和脂肪組織腫瘤及其標記物： ，Vimentin陽性； Lysozyme少數陽性。 滑膜及間皮腫瘤及其標記物：雙向分化，無特異性標記物。Keratin,EMA;Vimen

13、tin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能陽性。 周圍神經腫瘤及其標記物： S-100：神經纖維腫瘤，神經鞘腫瘤。 髓性緘性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； 髓鞘相關蛋白（MAG）； 層粘連蛋白（Laminin）。 8淋巴造血組織腫瘤及其標記物： ()LCA（Leucocyte Common Antigen，白細胞共同抗原）；()、標記淋巴細胞；()、標記淋巴細胞；()、標記組織細胞；()、（Ki-antigen）標記細胞；()標記單核細胞、粒細胞。 9神經及神經內分泌腫瘤及其標記物： （）膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic

14、 protein, ）：膠質細胞、室管膜細胞； （）髓鞘堿性蛋白（）：少枝細胞；（）神經細胞烯醇化酶（ Neurun specific enolosa,）：神經細胞；（）神經微絲（Neurofilaments,）神經細胞、嗜鉻細胞、副節(jié)細胞、瘤； （）嗜鉻素（Chromogranin ）：神經內分泌腫瘤。（）其它：、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin 、Serotonin等。 免疫組織化學最突出的優(yōu)點是能在微觀世界原位地確定組織及細胞結構的化學成分由于其方法簡便且可重復性強，目前已得到廣泛的應用，并正繼續(xù)向著更微細、更精確的原位分子雜交和免疫電鏡方向

15、發(fā)展，向著分子病理學的領域推進。 細胞角蛋白胃腺癌送檢（肉眼）：“胃體”部分胃壁切除標本，15 65cm ，切開見1個圓形腫物，大小10.56 5cm，切面灰白、質地稍硬。圖8圖9圖10 免疫組化結果：腫瘤細胞Vimentin（+）圖11免疫組化結果：腫瘤細胞（CD117+）抗原修復 從應用病理技術觀點來看，福爾馬林組織標本固定術就像一把雙刃劍： 福爾馬林（10%甲醛溶液）是一經典的常規(guī)病理診斷用組織樣本固定劑，然而缺點是其對免疫組織化學及原位雜交信號檢測是有損害作用。 抗原修復 福爾馬林固定甲醛反應導致組織蛋白質發(fā)生的一系列反應，最終導致蛋白質交聯 這種特殊的蛋白質交聯依賴于氨基酸側鏈的參與

16、 這種蛋白質交聯可導致蛋白質變性，降低或丟失免疫活性反應?？乖迯?縱觀歷史，福爾馬林固定并不適合于蛋白質免疫組化檢測，只有極少例外。 但這個問題已被Shi et al.等人所解決，當他們發(fā)現煮沸組織（“抗原修復”）可以恢復許多抗體的免疫反應。 綜合了其他組織病理學抗原修復技術，極大地促進了免疫組化在臨床應用。 目前絕大多數經過福爾馬林固定處理過的組織樣本通過抗原修復的方法都可以恢復抗原免疫活性而被檢測。抗原修復 從概念上講，福爾馬林固定后的熱修復免疫反應的這一發(fā)現是驚人的、反常態(tài)的。就像煮一個雞蛋，蛋白質暴露于高溫下發(fā)生了不可逆轉的變性，其蛋白免疫活性也會隨之減弱。 有學者解釋沸騰也可以從相

17、反的各種機制包括反轉由福爾馬林所介導的蛋白質交聯，從而解釋了為什么沸騰的組織切片可以恢復免疫反應活性。 雖然福爾馬林介導的蛋白質交聯可以在抗原修復中被打開，還并不清楚在如此劇烈的處理后蛋白質如何恢復其天然構象并恢復其免疫活性的。 抗原修復 以前的研究揭示甲醛能夠與蛋白質發(fā)生多種化學反應。然而，從應用診斷實驗室的角度，我們重點關注甲醛固定導致抗原丟失，修復如何使抗原活性重新展現的化學反應機理。 因此重點闡述肽抗原表位的模型系統研究如何固定和抗原修復影響抗體與他們表位結合的能力很重要 此研究的獨特的方面是使用肽鏈抗原表位，而不是細胞、部分組織或整個蛋白，聚焦研究破譯抗原修復機制的還原途徑?？乖砦?/p>

18、-定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenic determinant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負責與抗體分子或免疫細胞表面的抗原受體結合。嚴格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的?？乖ㄟ^抗原表位與相應的淋巴細胞表面的抗原受體結合，從而激活淋巴細胞，引起免疫應答；抗原也借表位與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合而發(fā)揮免疫效應?？乖砦坏男再|、數目和空間構型決定抗原的特異性。 抗原分子以其B細胞表位與抗體分子的抗原結合部位發(fā)生互補性結合A.抗原-抗體復合物的立體構象；B.采用電腦技術將抗原和抗體分子分

19、開，可見抗原和抗體分子的相互作用僅發(fā)生在抗原分子的B細胞表位和抗體分子的抗原結合部位之間，兩者呈現結構互補。C.抗體的互補決定區(qū)與抗原表位結合示意圖 C一般情況下，一個多肽表位含56個氨基酸殘基；一個多糖表位含57個單糖；一個核酸半抗原的表位含68個核苷酸。抗原表位的大小與相應抗體的抗原結合部位相適合。一個抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定，但其中有些殘基在與抗體結合時比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團。 抗原表位-分類覆蓋型和非覆蓋型表位 某些抗原分子表面，不同表位之間相對分離，各自結合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。 若某一表位與相應抗體結合會影響另

20、一表位與抗體的結合，此類表位稱為覆蓋型表位。 功能性和隱蔽表位 位于抗原分子表面的表位易被相應淋巴細胞所識別，即具有易接近性，可直接啟動免疫應答，故稱為功能性表位。 存在于抗原分子內部的表位無直接觸發(fā)免疫應答的功能，稱為隱蔽表位。若通過理化因素處理抗原，使其結構發(fā)生改變，內部的隱蔽表位被暴露，可能成為新的有功能的表位。 按表位結構不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位。連續(xù)性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成通常這種結合比較弱，因為小肽并不含完整天然蛋白的構象，在多數情況下這種表位可能只代表了復雜表位的一部分。對其研究依賴于多肽固相化學合成技術。后者又稱構象型抗原表位，是由那

21、些空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成。分類 按照與抗原受體細胞結合不同，分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。分類特性T細胞表位B細胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無需表位性質主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有機化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個氨基酸，5-7個單糖或5-7個核苷酸表位類型線性表位構象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面研究意義表位是蛋白質抗原性的基礎 ，研究蛋白質抗原表位， 對于設計具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特

22、異性診斷試劑盒中更為重要。主要參考文獻 王伯沄 李玉松 黃高昇 張遠強。病理學技術。人民衛(wèi)生出版社2000年。ISBN 7-117-03644-3/R3645 田東萍 吳名耀.組織芯片技術在腫瘤分子病理學研究中的應用，中國腫瘤2002，11（1）：52-53李青 周曉軍 蘇敏主編 臨床病理學人民衛(wèi)生出版社2009年。ISBN 978-7-117-10844-7/R10845 12-26 蘇敏 田東萍 牛恕淼. AMeX包埋法簡介及在FISH中的應用。中華病理學雜志1995；4：265蘇敏 田東萍. 福爾馬林固定石蠟包埋標本細胞單離涂片FISH技術。西安醫(yī)科大學學報 1997；18（3）：399

23、蘇敏 黃天華.實體瘤染色體分子病理學。癌變 突變 畸變雜志 1999；11（6）：282 主要參考文獻 1.Shi S-R, Gu J, Turrens J,et al. : ”Development of the antigen retrieval technique: philosophical and theoretical bases.” In Antigen Retrieval Techniques: Immunohistochemistry Molecular Morphology . pp. 17-40, S.-R. Shi, J . Gu and C.R. Taylor (ed

24、s.) , Natick, MA : Eaton Publishing, 2000.2.Fraenkel-Conrat H, Brandon B, Olcott H: The reaction of formaldehyde with proteins. IV. Participation of indole groups. Gramicidin. J. Biol. Chem. 1947;168:99-118.3.Fraenkel-Conrat H, Olcott H: Reaction of formaldehyde with proteins. VI. Crosslinking of am

25、ino groups with phenol, imidazole, or indole groups. J. Biol. Chem.1948;174:827-843.4.Fraenkel-Conrat H, Olcott H: The reaction of formaldehyde with proteins. V. Crosslinking between amino and primary amide or guanidyl groups. J.Am. Chem.Soc. 1948;70:2673-2684.5.Shi S, Key M,Kalra K: Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemica