糖尿病基因診斷和治療

1、糖尿病基因診斷和治療一.糖尿病的臨床表現(xiàn)二.輔助檢查三.糖尿病的基因診斷一.糖尿病的臨床表現(xiàn):典型者有“三多一少病癥，即多飲、多尿、多食、消瘦，不少患者缺乏典型臨床病癥，表現(xiàn)為反響性低血糖，或某些急慢性并發(fā)癥的病癥?？梢芍刚饔卸嗄?，多食病癥者有原因不明的體重下降，特別是原來超重或肥胖者肥胖或者超重者有糖尿病家族史，年齡大于40歲者皮膚瘙癢，反復出現(xiàn)癤腫或者皮膚潰瘍經久不愈者有一過性高血糖史或尿糖陽性史者有反響性低血糖發(fā)作史者視力下降者有巨大兒出生體重=4kg分娩史的女性或男性陽痿二.輔助檢查血糖的測定口服葡萄糖耐量試驗 OGTT空腹血漿或血清胰島素及C肽測定胰島素或C肽釋放試驗糖基化血紅蛋白測

2、定糖化血清蛋白測定自身抗體測定其他檢查1999年WHO修改糖尿病標準如下： 空腹血糖(FPG)的分類：60mmolL為正常；6070mmolL為空腹血糖過高(未達糖尿病，簡稱IFG)；70mmolL為糖尿病(需另一天再次證實)?？崭寡堑亩x是至少8小時沒有熱量的攝入。 可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未到達糖尿病診斷標準者應行此試驗。成人采用75g葡萄糖負荷，兒童175g/kg，正常人血糖頂峰出現(xiàn)于服糖后1/21h，峰值不超過8910mmol/L(160180mg/dl)。采用放射免疫法測定的胰島素包括胰島素原及與抗體結合的胰島素。C肽測定不受胰島素抗體影響，不與胰島素產生交叉免疫反響，也不

3、受外源性胰島素干擾。1型糖尿病空腹血漿胰島素和C肽水平很低，2型糖尿病那么多為正?；蛟龈?。本試驗的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，120，180min時采血同時測胰島素或C肽，以直接了解胰島細胞的功能狀態(tài)。正常人血胰島素和C肽的頂峰與血糖頂峰一致，于服糖后3060分鐘胰島素測值為空腹的510倍，C肽測值為空腹的56倍。1型糖尿病患者糖負荷后無胰島素和C肽釋放反響峰，其釋放曲線呈低平狀態(tài)；2型糖尿病肥胖患者，糖負荷后胰島素和C肽釋放反響峰值正常或增高，但頂峰卻在2h后延遲出現(xiàn)；病程已久消瘦2型糖尿病患者胰島素和C肽的釋放反響峰值低于正常。糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖濃度呈

4、正比，可反映23個月前體內血糖的平均水平。糖基化血紅蛋白的主要成分為HbAlc，因此常以HbAlc代表GHb。GHb(或HbAlc)的測值因測定方法不同而略有差異，約在36%63%的范圍之內。未控制的糖尿病患者GHb可為正常人的2至3倍。自身抗體包括胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷氨酸脫羥酶(GAD)抗體測定。1型糖尿病患者血清中該三種抗體可同時存在，亦可僅測到12種。三種抗體中GAD存在的時間較長，于發(fā)病10余年后仍可測到該抗體。 三.糖尿病的基因診斷基因突變 分型一、線粒體基因突變二、胰島素基因突變三、胰島素受體基因突變四、葡糖糖激酶基因突變五、其他基因突變1、線粒體DNA

5、點突變： 線粒體DNA (m tDNA ) 3243 位點tRNAL eu (UUR)基因A G 突變是DM 的致病基因。2、線粒體DNA缺失突變: 10.4kb缺失(nt4398-14882);7.5kb(nt6080-13800);7.6kb(nt6465-14135)3、線粒體DNA重復突變：Poulton等報道2例，分別為8kbnt6000-15000及8kbnt7000-16000 一、線粒體基因突變二、胰島素基因突變 應用聚合酶鏈反響單鏈構象多態(tài)性(PCRSSCP)及等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術對INS基因進行分析，發(fā)現(xiàn)有Arg65His、Arg65leu以及Hisl00As

6、p等點突變。此3種突變均可導致血中胰島素原不能轉換為胰島素，從而引起高胰島素原血癥。 Moller等對INSR基因的全部外顯子篩查后發(fā)現(xiàn)，外顯子2，3，8，9，13，17中有無義突變，外顯子20中存在一個異質性點突變。 (CGGCAG、Argl174Gln) 該突變位于酪氨酸激酶區(qū)內，影響受體細胞內亞基的結構，是引起遺傳性胰島素抵抗insulin resistance ，IR的主要原因。三、胰島素受體基因突變四、葡萄糖激酶基因突變 對GCK的12個外顯子作單鏈構象多態(tài)性(SSCP)測序分析進行分子篩查，發(fā)現(xiàn)多種GCK突變，到目前為止致NIDDM的GCK突變近30種，以錯義突變多見，亦有無義突變

7、、剪接點突變及堿基缺失。五、其他基因突變1己糖激酶(hexokinase，HK2)基因突變2磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突變 3糖原合成酶(glycogen synthetase，GSY)基因突變4載脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受體基因突變糖尿病相關基因診斷技術 等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術 測序分析進行分子篩查 PCR PCR-SSCP PCR-DGGE 基因芯片 線粒體基因突變糖尿病PCR技術常規(guī)方法提取基因組DNA (包括核DNA 和線粒體DNA )。PCR 法擴增含3243 位點的線粒體DNA 片段, 引物R: 52 GTTTTA GGGGCTCTTTGGT 2GAA GA GTT

8、23; 引物F: 52 TTGGA TCA 2 GGACA TCC2CGA TGGTGCA G23。組成PCR 總反響體系50 l, 置熱循環(huán)儀內, 94變性30 s, 60退火45 s, 72延伸1 m in, 共30 個循環(huán), 最后再72延伸10 m in。用限制性內切酶Apa I 酶切PCR 反響產物。取30 l PCR 反響產物, 再加3. 4 l L 2Buffer 及1 lApa 酶(20 ul) 混勻, 37水浴3 h, 使之充分酶解。酶解產物用溴化乙錠染色, 然后用1. 5% 瓊脂糖電泳檢測, 最后在紫外燈下觀察結果。1 4: 突變; 5、6: 無突變; C: 正常PCR 擴增

9、產物為500 bp。線粒體3243 位點突變者的白細胞中含有野生型和突變型m tDNA , 呈異質性。A G 突變, 形成GGGCCC 序列能被限制性內切酶Apa I 識別。酶切后, 在1. 5% 瓊脂糖電泳帶上可見500 bp 及重疊在一起的250 bp 2 個片段,無此突變者僅見500 bp 1 個片段。單鏈構象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)原理：基于序列不同的DNA單鏈片段，其空間構象亦有所不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其泳的位置亦發(fā) 生變化而表現(xiàn)出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據(jù)引判斷有無突變存在

10、. 步驟：1、PCR擴增靶DNA。2、PCR產物的快速變性而后快速復性，形成特定空間結構的DNA單鏈分子。3、非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE。4、PAGE膠的銀染?；蛐酒琯ene chip 指通過微陣(Microarray)技術將高密度DNA片段通過高速點樣機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如硅片、膜、玻璃片等固相外表，以同位素或熒光標記的DNA待測樣品，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的技術。“探針：載玻片或尼龍膜外表的寡核苷酸“樣品：標記了熒光或同位素待測靶核酸 DNA、cDNA或RNA近日從武漢大學中南醫(yī)院了解到, 該院周新教授率領的課題組

11、新近創(chuàng)造的糖尿病基因診斷芯片, 可以通過基因檢測在一天之內確診線粒體型糖尿病。 將成千上萬個我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激包括不同誘導、不同治療手段下細胞內的mRNA或逆轉錄所得的cDNA進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能確實立。基因芯片工作流程病例唐同學，男，15歲。三個月前受涼感冒，之后常感覺口渴、總想喝水、感覺沒有力氣，體重減輕5斤。以為是感冒還沒完全好，沒有在意，口渴時就喝可樂等甜飲。兩天前明顯感覺沒力氣，并出現(xiàn)惡心、嘔吐、上腹不適。到醫(yī)院查空腹血糖22.7mmol/L；尿常規(guī)：葡萄糖4+，酮體3+，蛋白-。血常規(guī)：WBC13.6*109/L；肝功、腎功、血脂、尿酸、血尿淀粉酶正常；血氣分析：PH值 7.05；尿微量白蛋白正常；心電圖：竇性心動過速；肝膽脾雙腎B超：脂肪肝。體檢：血壓90/60mmHg，身高169cm，體重48kg，皮膚粘膜較枯燥，雙肺呼吸音稍粗，心率110次/分，律齊，心界無擴大，心音正常，各瓣膜聽診區(qū)未聞及雜音，雙下肢無水腫。診斷：1型糖尿病