不同種雛鴨建立鴨乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的實驗研究

1、不同種雛鴨建立鴨乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的實驗研究郝友華1，李安意2 ，丁紅暉1 ，朱帆1 ，趙西平1 ，楊東亮1(1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院臨床免疫研究室, 武漢 430030; 2. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院動物實驗研究中心，武漢 430030 ) 摘要 目的：探討不同種雛鴨建立鴨乙肝病毒感染模型的影響因素，觀察應用該模型抗病毒的效果。方法：采集鴨血清，應用PCR方法定性檢測鴨血清中病毒DNA；定量PCR方法檢測鴨血清中病毒DNA載量變化；用抗病毒藥物處理，觀察其在鴨DHBV感染模型中的抗病毒效果。結果：不同種鴨DHBV自然感染率不同，櫻桃谷鴨為8.75%，湖北

2、麻鴨兩個批次分別為17.80%和10.68%；靜脈注射和腹腔注射兩途徑均能致雛鴨感染DHBV，靜脈注射感染率80%，腹腔注射感染率65%；鴨感染DHBV后，體內病毒載量維持在106108copies/mL，可持續(xù)20d以上；抗病毒藥物處理后，在不同DHBV模型中其抗病毒效果變化趨勢一致。結論：鴨的種類和人工感染途徑可影響DHBV感染率；雛鴨感染DHBV后其體內有持續(xù)性的病毒血癥；DHBV感染模型是藥物抗病毒研究較好模型。關鍵詞 鴨乙型肝炎病毒; 感染模型中圖分類號 R5Experimental Study on Duck Hepatitis B Virus Infection Model by

3、 Different Kinds of Ducklings and Anti-viral EffectHao You-hua1, Li An-yi2, Ding Hong-hui1, Zhu Fang1, Zhao Xin-ping1, Yang Dong-liang1. (1. Division of Clinical Immunology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030, China；2. Center of Medic

4、al Laboratory Animal Science, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030, China) Abstract Objective: To explore the factors in duck hepatitis B virus infection model by different kinds of ducklings and observe the antiviral effect in models.

5、 Methods: Collecting duck sera , qualitative detecting viral DNA by PCR method and detecting the changes of viral DNA load by the quantitative PCR method in duck sera. Observing the antiviral effects in duck DHBV infection models after antiviral drug treatment. Results: Natural infection rate of duc

6、k DHBV is different, Cherry Valley duck for 8.75%, two batches in Hubei sheldrake were 17.80% and 10.68% respectively. Both intravenous and intraperitoneal injection can cause ducklings infected with DHBV, infection rates of two ways were 80% and 65% respectiviely. Ducks infected with DHBV , the vir

7、al load is maintained at 106 108 copies / mL and persist for more than 20 days. Changing trends of antiviral effect in different DHBV models are coincident after treating by the antiviral drugs. Conclusion: Duck species and artificial routes of infection can affect DHBV infection rate, in vivo the v

8、iremia of duck is stably persistent after DHBV infection. Therefore, DHBV infection model is an available model in antiviral drug screening.Keywords Duck hepatitis B virus; Infection model基金項目：“十一五”艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項（No.2008ZX10002-011）第一作者：郝友華，男，42歲，副教授，主要從事病毒性肝炎免疫學發(fā)病機制和模型的研究。通訊作者，郝友華，E-mail：y

9、ouhuahao鴨乙肝病毒（Duck hepatitis B virus, DHBV）屬嗜肝DNA病毒科，禽嗜肝DNA病毒屬，其病毒顆粒為球型，有囊膜，直徑4050nm。DHBV主要經卵垂直傳播，雛鴨自然感染率高，感染后無明顯臨床癥狀。DHBV與人乙型肝肝炎病毒很類似，因而鴨乙型肝炎病毒及及其感染模型是在當前研究嗜肝DNA病毒復制機制、研究和篩選抗乙型肝炎病毒藥物中扮演重要作用1，2。建立雛鴨感染DHBV模型的影響因素較多，本研究主要比較了不同種雛鴨DHBV自然感染率和人工感染率，以及不同人工感染DHBV方法對病毒感染率的影響，觀察了DHBV感染后鴨體內病毒載量穩(wěn)定性，并對不同DHBV感染模型

10、應用抗病毒藥物抗病毒效果進行了比較分析，對進一步完善鴨乙肝病毒感染模型及其實際應用有著重要意義。1 材料與方法1.1 實驗材料二日齡櫻桃谷鴨雛鴨80只，購自武漢市春江禽業(yè)有限責任公司；二日齡湖北麻鴨雛鴨分兩批次：分別為146只，產地湖北天門；130只，產地湖北漢川。人工接種DHBV病毒株， 拷貝數(shù)為2.0107copies/mL，由本研究室制備保存。Real-time PCR試劑盒為SYBR Premix Ex TaqTM（大連寶生物工程有限公司）。1.2 實驗方法1.2.1鴨DHBV先天感染篩查二日齡雛鴨下肢內側，消毒后用一次性針頭刺破表皮，取血50L；置離心管中，37放置30min，120

11、00rpm10min；分離血清，取血清煮沸10min，12000rpm10min，取其上清做PCR模板，鑒定是否有DHBV自然感染。1.2.2 鴨DHBV人工感染未自然感染DHBV的雛鴨，分別經靜脈注射和腹腔注射人種接種DHBV病毒株， 每只200L，接種后第10天，采血，PCR方法鑒定DHBV感染。1.2.3 DHBV-DNA的PCR定性檢測和定量PCR檢測根據(jù)DHBV序列分別設計二對引物，定性PCR引物序列為：S1: 5- TGG CCT AAT CGG ATT ACT GG-3, S2:5-CAG CGT GGC TAA TTG AGT TA-3；定量PCR引物序列為：P1：5-GATA

12、CTGGAGCCCAAACC-3，P2: 5-GGCAGAGGAGGAAGTCAT-3,由上海invitrogen公司合成；由上海英駿公司合成。定性PCR擴增條件分別為：94 50s、61 45s、 72 50s、30個循環(huán)；定量PCR擴增條件：945s、585s、7215s、40個循環(huán)。1.2.4 在DHBV感染的鴨模型中觀察拉米呋啶抗病毒實驗實驗共分為4組，每組10只鴨，分別為（1）人工感染麻鴨組，此組給予安慰劑處理：三蒸超純水，每只1mL/ kg，一天一次；（2）DHBV自然感染麻鴨組，人工感染櫻桃谷鴨組、人工感染麻鴨組，此三組口服給拉米夫定：每只100mg/kg，一天一次，給藥15d。

13、實驗各組在用藥前（D0），用藥第5天（D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測DHBV-DNA載量變化。1.2.5 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS軟件（13.0版本）進行統(tǒng)計分析，以P0.01為有顯著性差異。2 結 果2.1 DHBV在不同鴨種中自然感染率比較 分別采集櫻桃谷鴨、湖北麻鴨的血清，以處理后的血清為模板，應用定性PCR方法擴增DHBV片段，PCR產物大小為422bp即為陽性。經檢測在80只櫻桃谷鴨血清中，DHBV陽性有7只，陽性率為8.75%；146只湖北天門麻鴨（湖北麻鴨-1），DHBV陽性有26只，陽性率為17.80%，13

14、1只湖北漢川麻鴨（湖北麻鴨-2），DHBV陽性有14只，陽性率為10.68%。見圖1。統(tǒng)計分析顯示：湖北麻鴨-1的自然感染率明顯高于其它2組（P0.05）。見圖3。圖3：不同鴨種人工接種后DHBV感染率 Fig3: Infection rates in the different duck species by artificial inoculation2.4 DHBV感染后鴨體內病毒血癥變化為觀察DHBV感染后鴨體內病毒DNA載量的變化，分別對DHBV自然感染陽性湖北麻鴨、人工感染DHBV陽性的櫻桃谷鴨和湖北麻鴨三組，各10只，從13日鴨齡開始，每間隔7d，采集鴨血清，定量PCR檢測病毒D

15、NA的載量，連續(xù)觀察28d。結果見圖4。三類DHBV感染鴨體內病毒載量維持在106108copies/mL，三組間DNA載量變化無明顯差 異（P0.05）。圖4：DHBV感染后鴨體內病毒DNA載量的變化 Fig4: Changes of in vivo viral DNA load in DHBV-infected ducks 2.5 在DHBV感染鴨模型中拉米呋啶抗病毒效果 根據(jù)實驗分組，分別給予安慰劑和拉米呋啶抗病毒藥物處理，每組使用的動物分別為：處理組-1為櫻桃谷鴨人工感染、處理組-2為湖北麻鴨人工感染、處理組-3為湖北麻鴨自然感染、安慰劑組為麻鴨人工感染。在用藥前（D0），用藥第5天（

16、D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測DHBV-DNA載量變化。結果見圖5：給藥后第10，15天后，除安慰劑組外，其余三組鴨血清DHBV-DNA顯著降低，經統(tǒng)計學分析，病毒下降有顯著的統(tǒng)計意義(P0.05)；停藥5d后，鴨體內DHBV-DNA滴度都出現(xiàn)了明顯的反彈；三組間病毒變化趨勢一致；但給予安慰劑組，鴨體內DHBV病毒沒出現(xiàn)明顯下降和反彈。圖5：抗病毒藥物在不同鴨模型中抗病毒效果 Fig5: Antiviral effects of the drug in different duck models3 討 論鴨乙肝病毒在不同種雛

17、鴨中自然感染率存在明顯差異3。本研究應用PCR方法，比較了湖北麻鴨和櫻桃谷對DHBV感染率，結果顯示：湖北地區(qū)孵化的櫻桃谷鴨DHBV自然感染為8.75%，湖北麻鴨DHBV自然感染率約為10%20%；湖北麻鴨自然感染DHBV的比率明顯高于櫻桃谷鴨，與瞿滌等前期研究結果類似4。但即使是同為湖北麻鴨種，因來源不同其自然感染率也不同，這提示除了鴨的種類差異影響DHBV的自然感染率外，人工孵育鴨的不同方式也可能是影響其自然感染率不容忽視的重要因素。 雛鴨人工感染DHBV是制備鴨乙肝病毒感染模型的重要措施，其主要受人工感染的途徑和雛鴨種類的影響5。人工感染的途徑比較多，但以鴨腿脛靜脈注射和腹腔注射途徑感染

18、最為常用。本研究比較了這兩種途徑感染DHBV的感染率。結果顯示：這兩種途徑均能使雛鴨感染DHBV，但靜脈注射途徑感染率明顯高于腹腔注射。而鴨種對人工感染率的影響不明顯，本研究中不同種雛鴨人工感染DHBV后的感染率分別是：櫻桃谷鴨為68.57%，湖北麻鴨為62.85%，二者間無明顯差異。這提示鴨的種類不是影響DHBV實驗感染雛鴨是否易感的主要因素。此外，本實驗中將未自然感染DHBV的雛鴨與人工感染DHBV的雛鴨一起飼養(yǎng)，10d后，這些鴨體內DHBV仍為陰性，提示DHBV傳播主要以垂直傳播途徑為主，水平傳播途徑對病毒的傳播影響較小。DHBV感染鴨后，鴨體內病毒血癥的穩(wěn)定性和持續(xù)時間是成功建立鴨人工感染DHBV實驗模型重要參數(shù)6。本研究比較了人工DHBV感染鴨和自然感染后，鴨體內的病毒血癥和持續(xù)時間，結果顯示：鴨體內病毒血癥在不同途徑感染中都能穩(wěn)定持續(xù)存在；但自然感染的鴨中，不同個體病毒DNA載量波動較大；在病毒持續(xù)時間上無明顯差異。此外，本研究還比較了抗病毒藥物在不同DHBV感染模型中抗病毒效果，結果顯示：人工感染組和自然感染組抗病毒效果的變化趨勢具有較好的一致性，而且鴨種的差異對其也無明顯影響。但櫻桃谷鴨個體較大，實