《基因工程概論》課件chapt3

1、基因工程概論第一章 導 論第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的載體第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表達第六章 基因工程的基本技術第三章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）引 言基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴增和富集，而目的基因本身在體外無法進行復制，必須借助于“載體”及其“寄主細胞”來實現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：能在寄主細胞中進行獨立的復制和表達

2、；具有1-2個選擇標記基因，如對抗生素的抗性基因等；具備多克隆位點（MCS），而且可攜帶外源DNA片段的長度范圍較寬。自身分子量較小，在寄主細胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。Characteristics of vectors for gene cloningMCSMarkerForeign gene第三章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasmid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasmid vect

3、ors）1、質(zhì)粒載體的生物學特性2、質(zhì)粒載體相關知識介紹1.質(zhì)粒載體的生物學特性（1）質(zhì)粒是一種廣泛存在于細菌細胞中染色體以 外的能自主的復制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。1.質(zhì)粒載體的生物學特性（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能 編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達到 200kb。（3）質(zhì)粒的生存在寄主細胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復制，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存。比如，對抗菌素的抗性，對重金屬的抗性等。1.質(zhì)

4、粒載體的生物學特性（4）質(zhì)粒的復制類型一種質(zhì)粒在宿主細胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復制型：“嚴緊型”質(zhì)粒（stringent plasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxed plasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細胞間也可能有很大的變化。（5）質(zhì)粒的不親和性兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存，屬于同一個不親和群，如pMB1或ColE1的派生質(zhì)粒。已鑒別出25個以上大腸桿菌質(zhì)粒的不親和群，它們之間是相容的。1.質(zhì)粒載體的生物學特性（6）質(zhì)粒的存在形式 有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。

5、在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移率。其中走在最前面的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋SC構型）開環(huán)雙螺旋（一個裂口， OC構型）線狀雙螺旋（兩個裂口，L構型）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）1、質(zhì)粒載體的生物學特性2、質(zhì)粒載體相關知識介紹質(zhì)粒：是一種裸露的雙鏈閉環(huán)DNA分子，它們在寄主細胞中能夠獨立地自我復制從而得到不斷的繁殖。作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應該具備復制的起始區(qū)、選擇標記基因區(qū)、多克隆位點等部分。多克隆位點：克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的

6、緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點應該在整個載體中是唯一的。選擇標記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如對氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選擇得到轉(zhuǎn)化的細胞（菌）。（1） -互補 (alpha-complementation) 大腸桿菌-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且釋放出一種藍色物質(zhì)，當該酶的-片段和-片段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中，而在一些人工構建的大腸

7、桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導入到這類寄主細胞中時，載體編碼的 -片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應），這種現(xiàn)象被稱為是 alpha-complementation.2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹 所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導物IPTG的平板上分辨出來。因為這類菌落中釋放出的藍色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍色，非常容易辨別。2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹（2）pBR322 研究最廣泛，使用最早的質(zhì)粒之一。 大小為4363 bp ，帶有兩個抗性基因（氨芐青霉素和四環(huán)素）。 帶有下列

8、限制酶切位點。 pBR322 generally does not give such a high yield of plasmid DNA as modern vectors such as pUC, pGEM and pBluescript2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹pBR3224363bp連接加反應液2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹（3）pUC是在pBR322基礎上發(fā)展起來的克隆載體。大小為2.7 kb，帶有復制起始位點，ampicillin 抗性基因和lacZ 基因。2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹（4）pGEM-3Z 帶有 LacZ 基因，大小為2.9 kb ，氨芐青霉素抗性基因，高拷貝。在多克

9、隆位點側(cè)翼帶有兩個啟動子SP6 和T7. 2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹（5）pBluescript SK pBluescript SK 同 pGEM 類似，另外還帶有線狀噬菌體f1 的復制起始位點。 可以產(chǎn)生單鏈DNA。如果寄主細胞帶有質(zhì)粒，f1噬菌體可以感染產(chǎn)生包含有質(zhì)粒DNA的噬菌體。2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹（6）pET pET 載體可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。 在EcoRI 和 BamHI酶切位點前面， pET-5 有一個可以編碼產(chǎn)生11個氨基酸組成的蛋白質(zhì)的區(qū)域。在這個位點插入DNA可以產(chǎn)生融合蛋白。使用NdeI 酶切不能產(chǎn)生融合蛋白。2. 質(zhì)粒載體相關知識介紹第三章 基因克隆的載體引 言（int

10、roduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）1、噬菌體的生物學特性2、 噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學特性4、M13噬菌體載體1. 噬菌體的生物學特性 噬菌體由正二十面體的蛋白質(zhì)頭部和中空管狀的蛋白質(zhì)尾部組成。頭部包含線狀染色體DNA，侵染寄主時將自己的DNA注入寄主細菌。 噬菌體屬溫和噬菌體。1. 噬菌體的生物學特性 噬菌體的生長周期可分為溶菌周期和溶源周期兩種類型。前者指

11、噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環(huán)化，然后進行自我復制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。在溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。只有溶菌生長周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體 。只有溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體（temperate phage ） 。整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌被稱為溶源性細菌（lysogen ） 。在溶源性細菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體（prophage ）。 1. 噬菌體的生物學特性 DNA為線狀雙鏈DNA分子，長度為48502bp，在分子兩端

12、各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點（cohesive end site）. DNA至少包括61個基因，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能。第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）1、噬菌體的生物學特性2、 噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學特性4、M13噬菌體載體2. 噬菌體載體（1）Insertion vectors 插入型載體能插入10 kb左右的DNA片段， Lambda phage 不能包

13、裝超過本身長度(48kb)的105 %。 所以插入型載體中不必要的基因要去掉。 選擇重組噬菌體的方法是使用cI基因插入失活， cI基因的表達可以促進噬菌體進入溶源狀態(tài), cI產(chǎn)物受影響會促進噬菌體進入裂解循環(huán)。 cI+ 噬菌體在大腸桿菌的寄主菌中產(chǎn)生模糊的噬菌斑， 而cI-噬菌體則產(chǎn)生清晰的噬菌斑。（1） Insertion vectors selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI genecI+cI-Lysogenic cycleLytic cycleclear plaquescloudy plaqu

14、es（1） Insertion vectorsLambda gt10 Lambda gt10 載體可以克隆較小的DNA片段, 尤其是 cDNA。 載體上包含有EcoRI酶切位點，可接受7.6 kb長的外源片段。外源DNA的插入可以使lambda 抑制基因(gene i434)失活，從而產(chǎn)生清晰的噬菌斑。 b527 Lambda基因組上缺失的一部分。A . J 是結構基因。 （1） Insertion vectorsLambda gt11 Lambda gt11 在EcoRI位點能接受超過7.2 kb長的DNA片段，在E. coli LacZ附近。這就可以通過Lac 啟動子產(chǎn)生融合蛋白。 重組噬

15、菌體可以通過抗體和在包含X-Gal/IPTG的平板上檢測LacZ基因的失活進行檢測。 nin5 is a deletion of the Lambda genome.（1） Insertion vectorsLambda ZAP 這類載體設計用來克隆cDNA文庫。在6個克隆位點的任何一個位點，可以接受大于10 kb 的外源DNA。 克隆進這些位點后導致LacZ基因插入失活，從而可以X-Gal/IPTG平板上檢測出重組體。還可以在啟動子下表達蛋白質(zhì)通過特異抗體進行檢測。（2） Replacement vectors2. 噬菌體載體（2） Replacement vectors 構建噬菌體載體的另

16、一種方法是切去一部分中間填充片段?？梢钥寺?20-25 kb長度的DNA。這些載體專用于構建哺乳動物的基因文庫。 這種載體被限制酶酶切時, 可以除去“stuffer” 片段，只留下左臂和右臂。通過乙醇沉淀法去除“stuffer” 片段，再用同一種限制酶連接外源DNA和兩臂。 Lambda DNA 有粘性末端，可以相互連接成cos 位點。 重組分子用體外包裝系統(tǒng)進行包裝。為了有效地包裝，兩個cos位點之間的距離要在38kb和52 kb之間。續(xù)前一頁（2） Replacement vectorsEMBL 3 and 4 Lambda EMBL載體用來克隆9到23kb的片段. 多克隆位點位于stuf

17、fer 片段的一側(cè)?？寺∥稽c的順序EMBL 3 和EMBL 4相反。 用EMBL 3載體克隆時用雙酶切EcoRI 和 BamHI 可以阻止 中間填充片段和兩臂重新連接。第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）1、噬菌體的生物學特性2、 噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學特性4、M13噬菌體載體3. M13噬菌體的生物學特性 M13是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有6047個核苷酸的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，其單鏈的基因組DNA經(jīng)改造后可作為單鏈的DNA載體。 因為M13單鏈DNA的復制型（RF，replicative form）是呈雙鏈環(huán)形，此時的DNA可以像質(zhì)粒DNA一樣進行提取和體

18、外操作。不論是雙鏈還是單鏈的M13 DNA均能感染寄主細胞。而且M13的顆粒不受包裝的限制，根據(jù)DNA的多寡其噬菌體的顆?？纱罂尚?。 M13噬菌體將DNA正鏈注入寄主細胞后與單鏈DNA 結合蛋白結合，隨后以小RNA鏈為引物合成負鏈而轉(zhuǎn)變成RF。 正鏈和負鏈出現(xiàn)不對稱性積累：當RF積累到100-200個拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結合蛋白很快就阻止了負鏈的進一步生成，但以負鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒。 新組裝的噬菌體顆粒并不會發(fā)生溶菌現(xiàn)象，只是從寄主細胞中擠壓出去。但噬菌體的大量繁殖也干擾了寄主細菌的正常生長，所以仍可產(chǎn)

19、生模糊的噬菌斑。 在M13基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)，該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。3. M13噬菌體的生物學特性3. M13噬菌體的生物學特性 SS RF 1-1RF RF 1-20RF SS 20以上The typical life cycle of M13第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）1、噬菌體的生物學特性2、 噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學特性4、M13噬菌體載體4. M13噬菌體載體 后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程中容易發(fā)生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內(nèi)，克隆300-400bp的

20、片段十分穩(wěn)定。 載體中含有LacZ基因及位于其中的多克隆位點，所以能通過互補在X-Gal/ IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等。 這類載體的突出優(yōu)點在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段 噬菌粒載體噬菌粒載體（phagemid vector或phasmid vector）是一種新型的載體，具有質(zhì)粒和絲狀噬菌體的優(yōu)點，其特點是：分子較小，約為3kb，可克隆10kb的外源DNA片段；既具有質(zhì)粒的復制起始點，又具有M13噬菌體的復制起點，在宿主細胞內(nèi)可按質(zhì)粒雙鏈的DNA分子形式復制。當輔助噬菌體存

21、在時，復制按M13噬菌體的滾環(huán)復制模型進行復制，產(chǎn)生單鏈DNA分子；具有多種功能，例如：外源DNA片段的克隆、產(chǎn)生單鏈模板DNA用于基因定點突變、直接測定插入外源DNA片段的序列、對外源基因進行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯等。第三章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的特點 柯斯質(zhì)粒是一類人工構建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類

22、型的質(zhì)粒載體，cosmid是cos site carrying plasmid的縮寫。柯斯質(zhì)粒的大小為4-6kb，由3部分組成： A.多克隆位點區(qū) B. 含有cos位點的DNA區(qū) C. 復制起始位點和抗性標記區(qū)pHC79OriMarkerMCScosDNA第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒（粘粒）載體的特點1、具有噬菌體的特性 柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導寄主細胞。進入寄主細胞的DNA也能環(huán)化和復制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2、具有質(zhì)粒載體的特性 能像質(zhì)粒一樣在寄主細胞內(nèi)復制，且?guī)в锌剐赃x擇標記基

23、因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。3、高容量的克隆能力 cos質(zhì)粒本身很?。?-10kb），只有復制起點、選擇標記和cos位點等構成，所以其克隆上限可達42kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達到33kb。第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的應用噬菌體的位點特異切割體系末端酶（terminase）體系要求兩個cos位點間要保持38-52kb的距離。 下面的操作中缺點是：cosmid自我重組、外源DNA片段串聯(lián) 后重組。OriMarkerMCScosDNA第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的應用1

24、981年Ish-Horowics和Burke設計的特殊的基因組克隆方案，選用 MboI或Sau3A進行基因組DNA的酶切。不僅是因為它們是4堿基識別位點的酶，而且它們和BamHI是同尾酶。cosHindIIIBamHISal ISal IHindIII磷酸化酶Sal IBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISal IHindIIISau 3A磷酸 化酶32-47 kb第三章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第四

25、節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）第四節(jié) 人工染色體載體（B/Y/HAC）用于DNA 片段克隆的載體系統(tǒng)( vector) 一直是分子生物學中的重要工具， 前面介紹的質(zhì)粒、噬菌體、粘粒等載體系統(tǒng)在分子生物學研究中都有著廣泛的應用。但質(zhì)粒系統(tǒng)容量小( 15 kb) ，很少用于DNA 文庫(DNA library) 的構建， 尤其是真核生物的文庫構建。噬菌體載體的克隆能力也超不過25kb，粘粒容量雖較大( 45 kb) ， 但對一些較大的基因簇(gene cluster) 的研究仍然無能為力。人工染色體載體系統(tǒng)復雜基因組研究中不可缺少的工具。 The sister chromatids of a

26、 mitotic pair each consist of a fiber (30 nm in diameter) compactly folded into the chromosome. Photograph kindly provided by E. J. DuPraw.The eukaryotic chromosome as a segregation device端粒(Telemere, TEL ) , DNA 復制起始點(Autonomously replicating sequence, ARS)和 著絲粒(Centromere, CEN ) 是維持染色體正常功能所不可缺少的三類

27、原件。將這三類原件及必要的選擇標記克隆到大腸桿菌(E. Coli ) 質(zhì)粒pBR 322中就構成了YAC載體質(zhì)粒, 通過雙酶切形成左右兩臂, 同外源大片段DNA 連接后構成了YAC 分子。轉(zhuǎn)入酵母細胞后即為YAC 克隆。右圖是以pYAC4 為載體的YAC 分子構建程序。YAC載體的構建和應用1987 年，克隆容量可達幾百至幾千kb 的酵母人工染色體( YAC) 問世，并可以通過同源重組的方式在酵母菌中對攜帶有基因組插入大片段的YAC 進行操作（Burke DT , Science, 1987, 236: 806 811）。1993 年，Schedl 等首次報道用顯微注射法制備得到含35kb 酪

28、氨酸酶基因以及側(cè)翼序列的轉(zhuǎn)基因鼠，并在后代中檢測到酪氨酸酶的表達。同年， Yale 大學醫(yī)學院Forget 教授隨即在美國科學院院刊(PNAS)上以“YAC transgenes ：bigger is probably better”為題發(fā)表述評，對這類大片段的轉(zhuǎn)基因研究給予了高度評價。遺憾的是，YAC 內(nèi)部存在嵌合及重組等現(xiàn)象，即在一個YAC 克隆里含有兩個本來不相連的獨立片段；某些克隆不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)時可能會缺失或重排其中的片段；此外，由于YAC 與酵母染色體具有相似的結構，因此YAC 很難與酵母染色體區(qū)分開，并且在轉(zhuǎn)基因操作時必須特別小心，否則將難以保持YAC DNA 的結構完整，進而

29、導致大片段轉(zhuǎn)基因研究失敗。上述易于發(fā)生重組， 缺乏穩(wěn)定性及制備工藝的繁瑣等不足極大地制約了以YAC 為基礎的大基因和大基因簇的轉(zhuǎn)基因研究。BAC載體的構建和應用1992 年, Shizuya 等構建成功細菌人工染色體 (BAC) ，盡管BAC 克隆容量(350 kb) 較YAC 小， 但是，它具有容量大、遺傳特性穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點。在基因文庫構建和基因功能分析等方面有廣泛的應用。BAC 構建的基礎是E. coli 及F因子。 研究表明，F(xiàn) 因子在E. coli 中復制受到嚴格控制而且保持低拷貝，一般為每細胞單拷貝或兩個拷貝，此外， F因子具有攜帶1Mb 插入片段的潛能，這就使得以此為基礎、構建具有大容量克隆能力的BAC載體成為可能 。BAC 的復制子來源于單拷貝質(zhì)粒F 因子，故BAC 在宿主菌內(nèi)只有極少數(shù)拷貝數(shù)，可穩(wěn)定遺傳，無缺失，重組和嵌合現(xiàn)象。BAC 以E. coli 為宿主，所以轉(zhuǎn)化效率較高，常規(guī)方法(堿裂解) 即可分離BAC：藍白斑，抗生素，菌落原位雜交等均可用于目的基因篩選；而且， 可對