免熒光素標(biāo)記抗體方法

1、免熒光素標(biāo)記抗體方法一)原理 目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的氨基共價結(jié)合，標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進行定性、定位或定量的檢測。(二)操作步驟將純化的IgG抗體對PH99.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，透析后抗體液移入小燒杯中稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC1mg/1ml D

2、MSO)使終濃度為1mgFITC1mlDMSOFITCIgG比例:如IgG濃度為1mgml，F(xiàn)ITCIgG比例約為50gFITCmgIgG；如IgG為510mgml，則比例為25gFITCml IgG在10ml小燒杯中先放入抗體按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素，先用25ml PBS淋洗G25柱收集PBS洗脫第一個熒光素結(jié)合蛋白峰，測定FP比值。第二個熒光素峰為游離熒光素計算:2.87A495FPA280-0.35A495合適的FP值為24。(三)試劑器

3、材1.純化的多克隆抗體或單克隆抗體。2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。3.PBS、DMSO4.PH99.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。5.PD10柱(Sephadex G25柱)6.磁力攪拌器，紫外分光光度計等(四)注意事項1.FITC保存于4暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取，以避免潮解。2.FITC-DMSO液要臨用時配制。3.碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。熒光抗體的制備（一）免疫球蛋白的提取 （二） 熒光素1 熒光色素的基本條件（1） 具有化學(xué)活性基團，如異硫氰基（-NCS）等，易

4、與免疫球蛋白結(jié)合形成共價鍵。（2） 對免疫球蛋白無毒性，不影響抗體活性。（3） 熒光效應(yīng)高，與蛋白結(jié)合需要量少。（4） 熒光素性能穩(wěn)定，結(jié)合物性能穩(wěn)定，容易貯藏。（5） 結(jié)合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。2常用的熒光色素（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分有結(jié)晶型與粉末型兩種,結(jié)晶型熒光強度大、穩(wěn)定、優(yōu)于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長為495nm。最大發(fā)射波長520

5、nm。異硫氰酸熒光黃性質(zhì)穩(wěn)定，于低溫下可保存二年以上，但久置標(biāo)記抗體能力弱，熒光亮度差，故應(yīng)采用新產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結(jié)合。一個IgG分子有86個氨基酸殘基，一般最多能標(biāo)記1620個熒光素分子。（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長570nm，最大發(fā)射波長為600nm。由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨使用，多用于與FITC標(biāo)記抗體的反襯染色或雙標(biāo)記配合使用。此染料不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染

6、料的-SO3Na基變?yōu)?SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的硫氨鍵。（三） 標(biāo)記方法異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種：1 攪拌法（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。（2）按熒光素與蛋白質(zhì)比1201100（一般用1100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動開關(guān)，輕輕攪拌，以不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液（約10min15min加完）。加完后，隨時用試紙測定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4攪拌6h12h即可。2 透析法（1）將IgG液以0

7、.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4攪拌24即可。透析法的優(yōu)點是標(biāo)記均勻，非特異性熒光少，但所標(biāo)記的時間長，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。3影響標(biāo)記的因素（1）熒光素與蛋白質(zhì)的比值：這也取決于熒光素的質(zhì)量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg0.05mg/mg蛋白質(zhì)為宜，而結(jié)晶型則只需0.006mg/mg0.008mg/mg蛋白質(zhì)即可。蛋白含量以20mg25mg/ml為宜，濃度過低標(biāo)記過慢。濃度過高，標(biāo)記效果不好。不過在實踐中

8、，以稍高一些蛋白濃度為好。（2）pH值：以pH9.09.5為最好。過低標(biāo)記速度慢，過高蛋白質(zhì)容易變性。（3）溫度和時間：溫度425均可。溫度與時間是成正比的，溫度低，反應(yīng)慢，溫度高，反應(yīng)快。4需要6h12h，79需要3h4h，2025只需要1h2h。實踐中可自選。透析法還是以4較長時間反應(yīng)為好。（4）熒光素的質(zhì)量及有效期。（四）標(biāo)記抗體的純化標(biāo)記后溶液是一個混合體，它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體，還有游離的熒光素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過多的蛋白質(zhì)。對于某些細(xì)菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對于一般組織染色熒光抗體，則要去除過度標(biāo)記的抗體即可。只是對某些特殊要求的組織染色試劑，則必

9、須經(jīng)過仔細(xì)的處理，包括具有特異性交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)性的除去。1 去除游離的熒光素（1）透析法：將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4透析數(shù)天，每天換液數(shù)次，直至透析液中無游離色素為止。通常約需57天才能透析完畢。（2）凝膠過濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進行過濾。次法速度快，一般1h2 h即可完成。也可以先透析4h5h，讓大部分游離熒光素除去，再過G25或G50柱。2 去除過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子 可采用DEAE纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進行，具體方法如下：（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。（2）以0.01 Mol/L pH

10、 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測熒光素的OD值，再于280nm測蛋白的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度，并計算出F/P比值（見后介紹），將合格者合并，濃縮后分裝小瓶備用。層析柱上滯留的過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。3去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高

11、、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)??？梢砸耘K粉進行吸收。具體做法如下：于每ml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標(biāo)記抗體。必要時可減半臟粉用量再處理一次。經(jīng)過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因為重金屬對熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。（五）標(biāo)記抗體的鑒定1F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結(jié)合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。異硫氰酸熒光素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25g/ml、0.5g/ml.、0.75g/ml、1.

12、0g/ml、2.0g/ml10.0 g/ml的濃度，在495nm波長測其OD值，按重量與OD值在坐標(biāo)上制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml1.6mg/ml，在280nm測其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計算F/P比值：16 104 FITCg/ml FITCg/mlF/P（克分子比值）= =0.41 390 抗體mg/ml 抗體mg/ml 式中16104為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。F/P克分子比值以12為合適，13.5為合格。比值過低敏感性差，比值過高，易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。用于檢查組織細(xì)胞抗原成分

13、，F(xiàn)/P以12為好；用于檢查細(xì)菌涂片時，F(xiàn)/P以23為好。2 免疫電泳測定 通過免疫電泳可以測定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現(xiàn)一條沉淀線。3染色性能的鑒定 包括測定熒光抗體的敏感性與特異性。（1）熒光抗體效價的測定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“ ”熒光強度的最大稀釋倍數(shù)即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實際應(yīng)用時則取2個或3個單位做應(yīng)用的稀釋度。（2）熒光抗體的特異性試驗：為了確保熒光抗體的特異性，必須預(yù)先進行下列試驗。陽性標(biāo)本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的相應(yīng)的抗原，結(jié)果應(yīng)是陽性；陰性標(biāo)本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應(yīng)抗原，結(jié)果應(yīng)是陰性；類屬性抗原染色試驗：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應(yīng)為陰性，說明特異性強，如不同程度地出現(xiàn)有熒光，說明具有類屬反應(yīng)，特異性不強等；抗體吸收試驗：以過