T∕CPMA 010-2020 基于高通量測(cè)序的病原體篩查通用準(zhǔn)則

1、 ICS 07.100C 01團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CPMA 0102020基于高通量測(cè)序的病原體篩查通用準(zhǔn)則General criteria for pathogen screening based on high-throughput sequencing2020-10-01實(shí)施2020-07-01發(fā)布 T/CPMA010-2020目 次前言.12345范圍. 1規(guī)范性引用文件 . 1術(shù)語(yǔ)和定義 . 1試驗(yàn)方法 . 3技術(shù)指標(biāo) . 4附錄A（規(guī)范性附錄）實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū). 6I T/CPMA010-2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1一2009給出的規(guī)則起草。II T/CPMA010-2020

2、基于高通量測(cè)序的病原體篩查通用準(zhǔn)則1范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于呼吸道樣本（鼻/咽拭子、鼻咽吸取物、痰液、肺泡灌洗液等）、消化道樣本（糞便、肛拭子等）、活檢組織、生物體液樣本（腦脊液、血液、胸腹水等）、蟲(chóng)媒樣本、環(huán)境樣本等類(lèi)型樣本的病原體高通量測(cè)序篩查。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開(kāi)展基于高通量測(cè)序的病原體篩查的實(shí)驗(yàn)室。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。CNAS-CL01-A024:2018檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明GB/T 30989-2014GB/T

3、 33681.1-2017GB/T 35537-2017GB/T 35890-2018SN/T 1193-2003高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程高通量測(cè)序樣本預(yù)處理方法高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求高通量測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求WSS 233-2017病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1文庫(kù)library由兩端連有已有的特定序列，中間為未知序列的核酸片段組成的核酸分子的集合。3.23.3高通量測(cè)序high-throughput sequencing以一次并行幾十萬(wàn)到幾十億條甚至更多核酸分子序列測(cè)定為標(biāo)志，適用于DNA或RNA的測(cè)序技術(shù)。病原體pa

4、thogens指致人類(lèi)或動(dòng)植物感染性疾病的生物總稱(chēng)，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌等微生物或其他生物體。1 T/CPMA010-20203.4篩查screening通過(guò)某種方法手段對(duì)導(dǎo)致人群疾病的可能的因素進(jìn)行查找。3.5核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)nucleotide database按照數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)來(lái)組織、存儲(chǔ)和管理DNA/RNA核酸序列的數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù)。3.6靶向測(cè)序targeted sequencing檢測(cè)特定基因集或基因組區(qū)域內(nèi)已知和新型變異的測(cè)序方法。3.7鳥(niǎo)槍法測(cè)序shotgun sequencing也被稱(chēng)為隨機(jī)測(cè)序，指隨機(jī)將DNA分解成小片段，并將小片段進(jìn)行測(cè)序獲得序列片段的方法。3.8讀序reads高

5、通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的堿基和質(zhì)量值組成的字符串。3.9序列格式sequence format基于文本的、存儲(chǔ)核酸序列和其測(cè)序質(zhì)量信息的標(biāo)準(zhǔn)格式。3.103.113.12堿基質(zhì)量值base quality score測(cè)序質(zhì)量值是用于評(píng)價(jià)堿基測(cè)序準(zhǔn)確度的指標(biāo)。測(cè)序讀長(zhǎng)read length測(cè)序能得到的片段的長(zhǎng)度，通常以堿基數(shù)表示。測(cè)序覆蓋度coverage rate待測(cè)樣本檢出的病原體核苷酸序列檢測(cè)結(jié)果覆蓋于對(duì)應(yīng)病原體參考全長(zhǎng)基因組（屬 /種水平）的比例(測(cè)序覆蓋度=覆蓋區(qū)域長(zhǎng)度/參考序列總長(zhǎng)度)。2 T/CPMA010-20203.13測(cè)序深度depth of sequencing待測(cè)樣本中單個(gè)堿基

6、被檢測(cè)的平均次數(shù)。4試驗(yàn)方法4.1樣本采集樣本采集后需2小時(shí)內(nèi)放置于4冰箱中，在采集后24小時(shí)內(nèi)將容器運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。如無(wú)法立即提取核酸，需放置于-80冰箱保存，不能反復(fù)凍融。4.2核酸提取核酸提取前對(duì)樣本采取物理破碎（如勻漿、液氮研磨、超聲波破碎儀）的方式處理，以提高病原體的核酸提取效率。核酸提取操作需符合試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，提取后需質(zhì)控。4.3文庫(kù)構(gòu)建4.3.1DNA建庫(kù)4.3.1.1靶向測(cè)序針對(duì)16S、ITS等特異序列，采用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增、純化產(chǎn)物進(jìn)行混合文庫(kù)構(gòu)建，或者直接采用商品化試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。a）適用范圍：核酸濃度較低的樣本，或僅需要進(jìn)行初步種屬鑒定的樣本。b）注

7、意事項(xiàng)：1)采用高保真擴(kuò)增酶；2)對(duì)于多可變區(qū)目標(biāo)基因，擴(kuò)增跨區(qū)靶序列（如 16S的 V3-V4區(qū)）；3)采用公認(rèn)的擴(kuò)增引物和長(zhǎng)測(cè)序讀長(zhǎng)。4.3.1.2鳥(niǎo)槍法測(cè)序針對(duì)樣本中所有的DNA，采取直接將DNA打斷后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的方法。a）適用范圍：需要進(jìn)行菌種鑒定且遺傳信息分析（如功能基因）的樣本。b）注意事項(xiàng)：1)根據(jù) DNA起始量大小選擇相應(yīng)的建庫(kù)試劑盒：起始總 DNA量在 10ng以上采用普通建庫(kù)試劑盒；如總量在 100pg-10ng之間，采用超微量 DNA建庫(kù)試劑盒；如果 DNA量低于下限，先進(jìn)行全基因組擴(kuò)增后，繼續(xù)建庫(kù)及測(cè)序步驟。2)根據(jù)采用的測(cè)序平臺(tái)確定片段化長(zhǎng)度；3)長(zhǎng)測(cè)序讀長(zhǎng)（100

8、bp）和雙端測(cè)序?qū)τ诮Y(jié)果判讀有幫助，但所需時(shí)間更長(zhǎng)。4)必要時(shí)建庫(kù)前先去除宿主 DNA。4.3.2RNA建庫(kù)a）適用范圍：不同濃度范圍的 RNA樣本；需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究或 RNA病毒檢測(cè)的樣本。b）注意事項(xiàng)：3 T/CPMA010-20201) RNA逆轉(zhuǎn)錄前需冰上操作，防止 RNA降解；2)注意添加 RNA酶抑制劑；3)必要時(shí)建庫(kù)前先去除核糖體 RNA。4.4測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)分析利用高通量測(cè)序儀對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)開(kāi)展測(cè)序?qū)嶒?yàn)，并基于參比數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)展分析，形成報(bào)告。操作需符合測(cè)序儀生產(chǎn)企業(yè)的要求。5技術(shù)指標(biāo)5.1實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū)/實(shí)驗(yàn)室工作條件要求5.1.1實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū)實(shí)驗(yàn)室設(shè)9個(gè)或更多的功能區(qū)，即樣

9、本前處理區(qū)、試劑存儲(chǔ)和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)（核酸提?。?、核酸擴(kuò)增區(qū)（第一擴(kuò)增區(qū)）、建庫(kù)區(qū)、文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)、測(cè)序工作區(qū)、數(shù)據(jù)存貯與分析區(qū)。各功能分區(qū)的工作條件、注意事項(xiàng)和儀器配備參照附錄 A。5.1.2實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施、環(huán)境要求和生物安全管理必須符合WSS 233-2017中的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展工作必須依據(jù)國(guó)家發(fā)布的病原微生物分類(lèi)名錄，完成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定實(shí)驗(yàn)室人員防護(hù)、標(biāo)本運(yùn)輸?shù)确矫娴姆雷o(hù)水平。5.1.3實(shí)驗(yàn)室工作條件各區(qū)域設(shè)有明確的標(biāo)識(shí)（包括生物安全標(biāo)識(shí)），避免生物安全風(fēng)險(xiǎn)和不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。樣本在工作區(qū)內(nèi)單向流動(dòng)。區(qū)分人流物流通道，保持各區(qū)

10、之間的空氣壓差，避免發(fā)生交叉污染。5.2質(zhì)控品樣本處理和后續(xù)試驗(yàn)過(guò)程中均需平行設(shè)置陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。5.3核酸質(zhì)量控制要求5.3.1DNA質(zhì)量控制要求高質(zhì)量的DNA，其OD260/OD280在1.71.9之間，OD260/OD230大于2。1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定：取5-10ul樣品跑膠，電壓150V，4050min。高質(zhì)量DNA無(wú)雜帶或拖尾。無(wú)蛋白質(zhì)污染（污染顯示為紫外燈下點(diǎn)樣孔附近有亮帶）。DNA的完整性用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測(cè)定，如果出現(xiàn)大部分片段在 200nt以下，說(shuō)明DNA降解嚴(yán)重，需要重新采集和制備樣本。此標(biāo)準(zhǔn)不適用于血漿樣本提取的游離DNA的質(zhì)

11、量評(píng)估。5.3.2RNA質(zhì)量控制要求高質(zhì)量的RNA，其OD260/OD280在1.82.0之間，OD260/OD230大于2。4 T/CPMA010-2020RNA完整性用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測(cè)定，并以軟件的RIN (RNA Integrity Number)分?jǐn)?shù)評(píng)估，RIN值需大于7。此標(biāo)準(zhǔn)不適用于游離RNA的質(zhì)量評(píng)估。5.4文庫(kù)質(zhì)量控制濃度：采用Qubit熒光染料檢測(cè)文庫(kù)的濃度，qPCR檢測(cè)文庫(kù)中有效連接接頭的核酸濃度，建庫(kù)后濃度0.5ng/ul。上機(jī)前需根據(jù)不同測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)濃度的要求進(jìn)行稀釋。純度：高質(zhì)量的文庫(kù)DNA，其OD260/OD280在1.752

12、.0之間。片段長(zhǎng)度：采用生物分析設(shè)備檢測(cè)文庫(kù)片段大小及峰型。文庫(kù)片段大小為插入片段和接頭序列的總長(zhǎng)度，合格文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度至少大于100bp；文庫(kù)主峰明顯、無(wú)雜峰、無(wú)接頭、無(wú)引物二聚體。5.5測(cè)序質(zhì)量控制5.5.1數(shù)據(jù)量靶向測(cè)序3萬(wàn)條拼接序列；鳥(niǎo)槍法測(cè)序1千萬(wàn)條高質(zhì)量的讀序（符合長(zhǎng)度和質(zhì)量要求）。5.5.2準(zhǔn)確度Q30比例85%。5.5.3測(cè)序讀長(zhǎng)讀序去接頭后70bp以下的片段不納入分析。去接頭后連續(xù)為N的讀序不納入分析。來(lái)源于宿主的讀序不納入后續(xù)分析。5.6數(shù)據(jù)分析技術(shù)指標(biāo)參比數(shù)據(jù)庫(kù)5.6.1參比數(shù)據(jù)庫(kù)需基于公用、主流的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步篩選后建立，根據(jù)檢測(cè)范圍（如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等），選

13、擇性納入其中高質(zhì)量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中必須涵蓋甲乙丙類(lèi)國(guó)家法定傳染病和人間傳染的病原微生物名錄所包含的病原體，如不能涵蓋需指出。對(duì)于法定傳染病原體和臨床重要病原體，需要在種/亞型水平納入?yún)⒖蓟蚪M，以提高鑒定特異性及敏感性。參比數(shù)據(jù)庫(kù)至少每三個(gè)月更新一次。5.6.2分析方法流程以準(zhǔn)確、快速為原則，采用多數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的方法，以提高檢測(cè)靈敏性和準(zhǔn)確度。5.7病原體識(shí)別報(bào)告5.7.1報(bào)告內(nèi)容檢測(cè)報(bào)告必須涵蓋甲、乙和丙類(lèi)國(guó)家法定傳染病以及人間傳染的病原微生物名錄所包含的病原體。如方法不能涵蓋，需指出。如篩查出新發(fā)病原體，報(bào)告中需明確指出。5.7.2報(bào)告格式報(bào)告上必須含有檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)單位、報(bào)告人、報(bào)告時(shí)間、

14、樣本信息、檢測(cè)方法、測(cè)序平臺(tái)、數(shù)據(jù)量等信息。參照陽(yáng)性和陰性質(zhì)控結(jié)果，報(bào)告中列出篩查的疑似病原體、檢測(cè)結(jié)果（匹配讀序數(shù)、測(cè)序覆蓋度、測(cè)序深度等）、判斷標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。報(bào)告中需標(biāo)注“篩查結(jié)果不能作為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)”。A5 T/CPMA010-2020附錄 A（規(guī)范性附錄）實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū)A.1樣本前處理區(qū)用于臨床樣本的前處理，如血清離心等。A.1.1注意事項(xiàng)依據(jù)感染性樣本的類(lèi)型，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上，確定實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)水平。此區(qū)域注意病原體污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)操作的病原微生物種類(lèi)、污染的對(duì)象和污染程度等選擇適宜的消毒和滅菌方法，以確保消毒效果。A.1.2儀器配備生物安全柜、離心機(jī)、水浴鍋、渦旋震蕩器、-

15、20/-80冰箱、樣本運(yùn)輸箱等。試劑存儲(chǔ)和準(zhǔn)備區(qū)A.2用于貯存試劑、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備。A.2.1注意事項(xiàng)1)反應(yīng)體系配置過(guò)程嚴(yán)格防止下游制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)的核酸污染。2)不同試劑的配置防止受到交叉污染。A.2.2儀器配備超凈工作臺(tái)、-20冰箱、制冰機(jī)、純水儀，漩渦振蕩器。A.3樣本制備區(qū)（核酸提?。┯糜诤怂幔≧NA、DNA）提取、貯存。A.3.1注意事項(xiàng)依據(jù)感染性樣本的類(lèi)型，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上，確定實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)水平。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)操作的病原微生物種類(lèi)、污染的對(duì)象和污染程度等選擇適宜的消毒和滅菌方法，以確保消毒效果。A.3.2儀器配備生物安全柜、水浴鍋、漩渦振蕩器、高速離心機(jī)（

16、冷凍）、-20/-80冰箱等或自動(dòng)核酸提取儀。核酸擴(kuò)增區(qū)（第一擴(kuò)增區(qū)）A.4基于雜交捕獲或擴(kuò)增方法，用于DNA片段的選擇和擴(kuò)增。6 T/CPMA010-2020A.4.1注意事項(xiàng)此區(qū)為核酸污染發(fā)生的主要區(qū)域。限制無(wú)關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動(dòng)。加樣在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。避免與第二擴(kuò)增區(qū)交叉污染。A.4.2儀器配備PCR儀、漩渦振蕩器、瞬時(shí)離心機(jī)。建庫(kù)區(qū)A.5用于核酸的片段化（酶、超聲波等）、連接、純化實(shí)驗(yàn)。A.5.1注意事項(xiàng)注意避免交叉污染，以及下游區(qū)域的核酸污染。A.5.2儀器配備配備核酸片段儀、漩渦振蕩器、磁力架、4冰箱、-20冰箱、微量分光光度計(jì)。A.6文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）用于文庫(kù)片段的擴(kuò)增和富集。A.6.1注意事項(xiàng)此區(qū)為主要的核酸污染來(lái)源。限制無(wú)關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動(dòng)。加樣在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。避免與第一擴(kuò)增區(qū)交叉污染。A.6.2儀器配備PCR儀、漩渦振蕩器、瞬時(shí)離心機(jī)。文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)A.7擴(kuò)增產(chǎn)物及文庫(kù)的定性與定量測(cè)定。A.7.1注意事項(xiàng)此區(qū)為主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源。限制無(wú)關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動(dòng)。A.7.2儀器配備熒光定量PCR儀、微量分光