T∕CPMA 010-2020 基于高通量測序的病原體篩查通用準(zhǔn)則

1、 ICS 07.100C 01團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CPMA 0102020基于高通量測序的病原體篩查通用準(zhǔn)則General criteria for pathogen screening based on high-throughput sequencing2020-10-01實施2020-07-01發(fā)布 T/CPMA010-2020目 次前言.12345范圍. 1規(guī)范性引用文件 . 1術(shù)語和定義 . 1試驗方法 . 3技術(shù)指標(biāo) . 4附錄A（規(guī)范性附錄）實驗室功能分區(qū). 6I T/CPMA010-2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1一2009給出的規(guī)則起草。II T/CPMA010-2020

2、基于高通量測序的病原體篩查通用準(zhǔn)則1范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于呼吸道樣本（鼻/咽拭子、鼻咽吸取物、痰液、肺泡灌洗液等）、消化道樣本（糞便、肛拭子等）、活檢組織、生物體液樣本（腦脊液、血液、胸腹水等）、蟲媒樣本、環(huán)境樣本等類型樣本的病原體高通量測序篩查。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開展基于高通量測序的病原體篩查的實驗室。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。CNAS-CL01-A024:2018檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明GB/T 30989-2014GB/T

3、 33681.1-2017GB/T 35537-2017GB/T 35890-2018SN/T 1193-2003高通量基因測序技術(shù)規(guī)程高通量測序樣本預(yù)處理方法高通量基因測序結(jié)果評價要求高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范基因檢驗實驗室技術(shù)要求WSS 233-2017病原微生物實驗室生物安全通用準(zhǔn)則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1文庫library由兩端連有已有的特定序列，中間為未知序列的核酸片段組成的核酸分子的集合。3.23.3高通量測序high-throughput sequencing以一次并行幾十萬到幾十億條甚至更多核酸分子序列測定為標(biāo)志，適用于DNA或RNA的測序技術(shù)。病原體pa

4、thogens指致人類或動植物感染性疾病的生物總稱，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等微生物或其他生物體。1 T/CPMA010-20203.4篩查screening通過某種方法手段對導(dǎo)致人群疾病的可能的因素進(jìn)行查找。3.5核酸序列數(shù)據(jù)庫nucleotide database按照數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)來組織、存儲和管理DNA/RNA核酸序列的數(shù)據(jù)倉庫。3.6靶向測序targeted sequencing檢測特定基因集或基因組區(qū)域內(nèi)已知和新型變異的測序方法。3.7鳥槍法測序shotgun sequencing也被稱為隨機(jī)測序，指隨機(jī)將DNA分解成小片段，并將小片段進(jìn)行測序獲得序列片段的方法。3.8讀序reads高

5、通量測序平臺產(chǎn)生的堿基和質(zhì)量值組成的字符串。3.9序列格式sequence format基于文本的、存儲核酸序列和其測序質(zhì)量信息的標(biāo)準(zhǔn)格式。3.103.113.12堿基質(zhì)量值base quality score測序質(zhì)量值是用于評價堿基測序準(zhǔn)確度的指標(biāo)。測序讀長read length測序能得到的片段的長度，通常以堿基數(shù)表示。測序覆蓋度coverage rate待測樣本檢出的病原體核苷酸序列檢測結(jié)果覆蓋于對應(yīng)病原體參考全長基因組（屬 /種水平）的比例(測序覆蓋度=覆蓋區(qū)域長度/參考序列總長度)。2 T/CPMA010-20203.13測序深度depth of sequencing待測樣本中單個堿基

6、被檢測的平均次數(shù)。4試驗方法4.1樣本采集樣本采集后需2小時內(nèi)放置于4冰箱中，在采集后24小時內(nèi)將容器運(yùn)回實驗室。如無法立即提取核酸，需放置于-80冰箱保存，不能反復(fù)凍融。4.2核酸提取核酸提取前對樣本采取物理破碎（如勻漿、液氮研磨、超聲波破碎儀）的方式處理，以提高病原體的核酸提取效率。核酸提取操作需符合試劑盒說明書的要求，提取后需質(zhì)控。4.3文庫構(gòu)建4.3.1DNA建庫4.3.1.1靶向測序針對16S、ITS等特異序列，采用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增、純化產(chǎn)物進(jìn)行混合文庫構(gòu)建，或者直接采用商品化試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。a）適用范圍：核酸濃度較低的樣本，或僅需要進(jìn)行初步種屬鑒定的樣本。b）注

7、意事項：1)采用高保真擴(kuò)增酶；2)對于多可變區(qū)目標(biāo)基因，擴(kuò)增跨區(qū)靶序列（如 16S的 V3-V4區(qū)）；3)采用公認(rèn)的擴(kuò)增引物和長測序讀長。4.3.1.2鳥槍法測序針對樣本中所有的DNA，采取直接將DNA打斷后進(jìn)行文庫構(gòu)建的方法。a）適用范圍：需要進(jìn)行菌種鑒定且遺傳信息分析（如功能基因）的樣本。b）注意事項：1)根據(jù) DNA起始量大小選擇相應(yīng)的建庫試劑盒：起始總 DNA量在 10ng以上采用普通建庫試劑盒；如總量在 100pg-10ng之間，采用超微量 DNA建庫試劑盒；如果 DNA量低于下限，先進(jìn)行全基因組擴(kuò)增后，繼續(xù)建庫及測序步驟。2)根據(jù)采用的測序平臺確定片段化長度；3)長測序讀長（100

8、bp）和雙端測序?qū)τ诮Y(jié)果判讀有幫助，但所需時間更長。4)必要時建庫前先去除宿主 DNA。4.3.2RNA建庫a）適用范圍：不同濃度范圍的 RNA樣本；需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究或 RNA病毒檢測的樣本。b）注意事項：3 T/CPMA010-20201) RNA逆轉(zhuǎn)錄前需冰上操作，防止 RNA降解；2)注意添加 RNA酶抑制劑；3)必要時建庫前先去除核糖體 RNA。4.4測序及測序數(shù)據(jù)分析利用高通量測序儀對構(gòu)建的文庫開展測序?qū)嶒?，并基于參比?shù)據(jù)庫開展分析，形成報告。操作需符合測序儀生產(chǎn)企業(yè)的要求。5技術(shù)指標(biāo)5.1實驗室功能分區(qū)/實驗室工作條件要求5.1.1實驗室功能分區(qū)實驗室設(shè)9個或更多的功能區(qū)，即樣

9、本前處理區(qū)、試劑存儲和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)（核酸提取）、核酸擴(kuò)增區(qū)（第一擴(kuò)增區(qū)）、建庫區(qū)、文庫擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫檢測與質(zhì)控區(qū)、測序工作區(qū)、數(shù)據(jù)存貯與分析區(qū)。各功能分區(qū)的工作條件、注意事項和儀器配備參照附錄 A。5.1.2實驗室生物安全要求實驗室的設(shè)施、環(huán)境要求和生物安全管理必須符合WSS 233-2017中的規(guī)定。實驗室開展工作必須依據(jù)國家發(fā)布的病原微生物分類名錄，完成風(fēng)險評估，確定實驗室人員防護(hù)、標(biāo)本運(yùn)輸?shù)确矫娴姆雷o(hù)水平。5.1.3實驗室工作條件各區(qū)域設(shè)有明確的標(biāo)識（包括生物安全標(biāo)識），避免生物安全風(fēng)險和不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。樣本在工作區(qū)內(nèi)單向流動。區(qū)分人流物流通道，保持各區(qū)

10、之間的空氣壓差，避免發(fā)生交叉污染。5.2質(zhì)控品樣本處理和后續(xù)試驗過程中均需平行設(shè)置陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。5.3核酸質(zhì)量控制要求5.3.1DNA質(zhì)量控制要求高質(zhì)量的DNA，其OD260/OD280在1.71.9之間，OD260/OD230大于2。1%瓊脂糖凝膠電泳測定：取5-10ul樣品跑膠，電壓150V，4050min。高質(zhì)量DNA無雜帶或拖尾。無蛋白質(zhì)污染（污染顯示為紫外燈下點(diǎn)樣孔附近有亮帶）。DNA的完整性用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測定，如果出現(xiàn)大部分片段在 200nt以下，說明DNA降解嚴(yán)重，需要重新采集和制備樣本。此標(biāo)準(zhǔn)不適用于血漿樣本提取的游離DNA的質(zhì)

11、量評估。5.3.2RNA質(zhì)量控制要求高質(zhì)量的RNA，其OD260/OD280在1.82.0之間，OD260/OD230大于2。4 T/CPMA010-2020RNA完整性用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測定，并以軟件的RIN (RNA Integrity Number)分?jǐn)?shù)評估，RIN值需大于7。此標(biāo)準(zhǔn)不適用于游離RNA的質(zhì)量評估。5.4文庫質(zhì)量控制濃度：采用Qubit熒光染料檢測文庫的濃度，qPCR檢測文庫中有效連接接頭的核酸濃度，建庫后濃度0.5ng/ul。上機(jī)前需根據(jù)不同測序平臺對文庫濃度的要求進(jìn)行稀釋。純度：高質(zhì)量的文庫DNA，其OD260/OD280在1.752

12、.0之間。片段長度：采用生物分析設(shè)備檢測文庫片段大小及峰型。文庫片段大小為插入片段和接頭序列的總長度，合格文庫插入片段長度至少大于100bp；文庫主峰明顯、無雜峰、無接頭、無引物二聚體。5.5測序質(zhì)量控制5.5.1數(shù)據(jù)量靶向測序3萬條拼接序列；鳥槍法測序1千萬條高質(zhì)量的讀序（符合長度和質(zhì)量要求）。5.5.2準(zhǔn)確度Q30比例85%。5.5.3測序讀長讀序去接頭后70bp以下的片段不納入分析。去接頭后連續(xù)為N的讀序不納入分析。來源于宿主的讀序不納入后續(xù)分析。5.6數(shù)據(jù)分析技術(shù)指標(biāo)參比數(shù)據(jù)庫5.6.1參比數(shù)據(jù)庫需基于公用、主流的數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選后建立，根據(jù)檢測范圍（如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等），選

13、擇性納入其中高質(zhì)量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫中必須涵蓋甲乙丙類國家法定傳染病和人間傳染的病原微生物名錄所包含的病原體，如不能涵蓋需指出。對于法定傳染病原體和臨床重要病原體，需要在種/亞型水平納入?yún)⒖蓟蚪M，以提高鑒定特異性及敏感性。參比數(shù)據(jù)庫至少每三個月更新一次。5.6.2分析方法流程以準(zhǔn)確、快速為原則，采用多數(shù)據(jù)庫相結(jié)合的方法，以提高檢測靈敏性和準(zhǔn)確度。5.7病原體識別報告5.7.1報告內(nèi)容檢測報告必須涵蓋甲、乙和丙類國家法定傳染病以及人間傳染的病原微生物名錄所包含的病原體。如方法不能涵蓋，需指出。如篩查出新發(fā)病原體，報告中需明確指出。5.7.2報告格式報告上必須含有檢測時間、檢測單位、報告人、報告時間、

14、樣本信息、檢測方法、測序平臺、數(shù)據(jù)量等信息。參照陽性和陰性質(zhì)控結(jié)果，報告中列出篩查的疑似病原體、檢測結(jié)果（匹配讀序數(shù)、測序覆蓋度、測序深度等）、判斷標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。報告中需標(biāo)注“篩查結(jié)果不能作為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)”。A5 T/CPMA010-2020附錄 A（規(guī)范性附錄）實驗室功能分區(qū)A.1樣本前處理區(qū)用于臨床樣本的前處理，如血清離心等。A.1.1注意事項依據(jù)感染性樣本的類型，在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上，確定實驗室的生物安全防護(hù)水平。此區(qū)域注意病原體污染。實驗室應(yīng)根據(jù)操作的病原微生物種類、污染的對象和污染程度等選擇適宜的消毒和滅菌方法，以確保消毒效果。A.1.2儀器配備生物安全柜、離心機(jī)、水浴鍋、渦旋震蕩器、-

15、20/-80冰箱、樣本運(yùn)輸箱等。試劑存儲和準(zhǔn)備區(qū)A.2用于貯存試劑、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備。A.2.1注意事項1)反應(yīng)體系配置過程嚴(yán)格防止下游制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)的核酸污染。2)不同試劑的配置防止受到交叉污染。A.2.2儀器配備超凈工作臺、-20冰箱、制冰機(jī)、純水儀，漩渦振蕩器。A.3樣本制備區(qū)（核酸提?。┯糜诤怂幔≧NA、DNA）提取、貯存。A.3.1注意事項依據(jù)感染性樣本的類型，在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上，確定實驗室的生物安全防護(hù)水平。實驗室應(yīng)根據(jù)操作的病原微生物種類、污染的對象和污染程度等選擇適宜的消毒和滅菌方法，以確保消毒效果。A.3.2儀器配備生物安全柜、水浴鍋、漩渦振蕩器、高速離心機(jī)（

16、冷凍）、-20/-80冰箱等或自動核酸提取儀。核酸擴(kuò)增區(qū)（第一擴(kuò)增區(qū)）A.4基于雜交捕獲或擴(kuò)增方法，用于DNA片段的選擇和擴(kuò)增。6 T/CPMA010-2020A.4.1注意事項此區(qū)為核酸污染發(fā)生的主要區(qū)域。限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動。加樣在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。避免與第二擴(kuò)增區(qū)交叉污染。A.4.2儀器配備PCR儀、漩渦振蕩器、瞬時離心機(jī)。建庫區(qū)A.5用于核酸的片段化（酶、超聲波等）、連接、純化實驗。A.5.1注意事項注意避免交叉污染，以及下游區(qū)域的核酸污染。A.5.2儀器配備配備核酸片段儀、漩渦振蕩器、磁力架、4冰箱、-20冰箱、微量分光光度計。A.6文庫擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）用于文庫片段的擴(kuò)增和富集。A.6.1注意事項此區(qū)為主要的核酸污染來源。限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動。加樣在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。避免與第一擴(kuò)增區(qū)交叉污染。A.6.2儀器配備PCR儀、漩渦振蕩器、瞬時離心機(jī)。文庫檢測與質(zhì)控區(qū)A.7擴(kuò)增產(chǎn)物及文庫的定性與定量測定。A.7.1注意事項此區(qū)為主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源。限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動。A.7.2儀器配備熒光定量PCR儀、微量分光