酶工程酶制劑制備

1、CH 4 酶制劑的制備和精制 盡管發(fā)酵微生物的種類不同，有的是以胞內(nèi)酶為主，有的以胞外酶為主，無論哪一種，最終得把它們提取出來，并使其達(dá)到一定的純度，這就是酶制劑的制備和精制的任務(wù)。目前我國生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑，普遍純度較低，就丹麥NOVOPectinases), NOVO公司生產(chǎn)的酶制劑的比酶活力較我國最好的產(chǎn)品高510倍，盡管酶制劑的價(jià)格較高，但其在生產(chǎn)上應(yīng)用成本還低于我國的產(chǎn)品。 1 （細(xì)胞破碎） 發(fā)酵液預(yù)處理 酶液脫色 酶蛋白的初步純化與濃縮 （酶蛋白的提純與精制） 酶制劑的成形。CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法2注意事項(xiàng)基本原則：防止生物分子變性、降解 1控制適當(dāng)?shù)膒H 2控制低溫 3

2、注意提取過程中的溶液環(huán)境 4防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基3CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法1 細(xì)胞破碎方法對于胞內(nèi)酶的提取與制備，首先要把細(xì)胞破碎，使局限在細(xì)胞內(nèi)的酶蛋白游離出來，常用的破碎方法有以下幾種：1.1 機(jī)械破碎法：1.2 物理破碎法：1.3 化學(xué)方法：機(jī)械搗碎法：10000轉(zhuǎn)/分。研磨法：只適合于實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模操作。勻漿法：細(xì)胞的破碎程度較高，規(guī)模小。 溫差破碎法： 超聲波（ 20kHz）裂解法：15-25kHz， 100-150W， 0-10， 3-10min； 目前有效的化學(xué)方法主要是加入表面活性劑法常用的有：特里頓X-100和吐溫（Tween），其主要是破壞細(xì)胞膜的

3、結(jié)構(gòu)，增加膜通透性。此法在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)上已成功應(yīng)用 4CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法2 發(fā)酵液的預(yù)處理2.1 發(fā)酵液絮凝發(fā)酵液首先要進(jìn)行過濾除菌，在發(fā)酵液中，由菌體自溶產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、核酸、雜蛋白等大分子物質(zhì)，使得發(fā)酵液很難過濾；在過濾前必須進(jìn)行絮凝處理。 發(fā)酵液的預(yù)處理的常用方法主要是在發(fā)酵液中加入絮凝劑，常用的絮凝劑有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（Polystyrene Sulfonate）；絮凝劑加入，主要有以下三方面的作用：改變發(fā)酵液中懸浮粒子的物理特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；使一些可溶性的膠體物質(zhì)變成不溶性的沉淀粒子；降低發(fā)酵液的黏度。

4、2.2酶液的脫色 這一步驟可根據(jù)酶制劑的要求而定，一般工業(yè)酶制劑允許含有來源中的色素，所以就不脫色；對于醫(yī)用酶制劑、分析用酶等必須進(jìn)行脫色處理；目前大部分工業(yè)酶制劑都要進(jìn)行脫色處理過程。常用的脫色劑有活性炭和離子交換樹脂。 活性炭吸附法，操作效率較高，脫色較徹底，但在脫色的同時(shí)，也有部分酶蛋白被吸附掉了； 離子交換樹脂基本上在脫色的同時(shí)，不吸附酶蛋白。我國生產(chǎn)了一種脫色專用樹脂：通用號脫色樹脂。在弱酸性條件下，其吸附色素，而在堿性條件下便釋放色素。樹脂的再生方便，再生的條件是：先用的NaOH洗脫色素，待色素洗脫干凈后，用蒸餾水洗到中性，再用5%的HCl（二倍樹脂床體積）中和樹脂，再用蒸餾水洗到

5、pH5.0-5.5為止。5CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法3 酶蛋白的初步純化與濃縮 3.1 鹽析法1 鹽析的基本原理： 蛋白質(zhì)在水中的溶解度與其所帶凈電荷的多少呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)的極性越強(qiáng)，其溶解度越大，溶液中的離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分，從而減弱蛋白質(zhì)的水合程度，降低其溶解度； 另一方面，液相中離子的電荷部分地中和蛋白質(zhì)分子上的電荷，使其凈電荷降低或凈電荷消失，促使蛋白質(zhì)析出； 此外，溶液中的鹽離子引起水分子的極化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。在鹽溶液里，蛋白質(zhì)的溶解度的對數(shù)值與溶液里的離子強(qiáng)度成線性關(guān)系，人們總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)公式：logS=-Ks.

6、S: Protein的溶解度g/l；為溶液離子強(qiáng)度為零時(shí)的logS， 值受蛋白質(zhì)性質(zhì)、鹽離子的種類、溶液的溫度和pH值的影響； Ks為鹽析常數(shù)，因蛋白質(zhì)而性質(zhì)和鹽離子的種類不同而不同； 為溶液的離子強(qiáng)度。 2 鹽析的基本方法：蛋白質(zhì)的鹽析方法主要有以下兩種：Ks鹽析法：即蛋白質(zhì)溶液的pH值和溫度固定不變，改變?nèi)芤旱柠}濃度（離子強(qiáng)度），以達(dá)到沉淀蛋白的作用；此法常用的鹽是硫酸銨。 鹽析法：是在一定的離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H值和溫度，以達(dá)到蛋白沉淀的目的。 在實(shí)際工作中，常用的是Ks鹽析法，利用不同飽和度的(NH4)2SO4濃度，這樣不同的蛋白質(zhì)析出沉淀的(NH4)2SO4 濃度不同；通過這種方

7、法可將部分雜蛋白分離出去，達(dá)到濃縮酶蛋白的目的。3 鹽析曲線：按鹽析經(jīng)驗(yàn)公式，以中性鹽濃度對酶蛋白溶解度作圖，得一條如下曲線：鹽濃度（飽和度）酶蛋白溶解度鹽溶效應(yīng)：4 具體操作方法： 飽和溶液法: 干粉加入法:5 影響鹽析的因素： 溫度： pH：6 鹽析后的脫鹽處理 透析法： 凝膠過濾法：6調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表7CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法3 酶蛋白的初步純化與濃縮3.2 有機(jī)溶劑沉淀法 除用鹽析法沉淀酶蛋白外，還可以用有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白，目前選用的有機(jī)溶劑主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的價(jià)格高，蒸餾回收困難，所以目前多采用乙醇作沉淀劑。 沉淀酶蛋白所需乙醇濃

8、度受很多因素影響，溶液的離子強(qiáng)度、溫度、pH值等都影響蛋白質(zhì)的析出，低濃度的鹽離子有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的作用，即所謂的鹽溶效應(yīng)；所以當(dāng)溶液中有低濃度鹽離子時(shí)，乙醇的濃度要增加；溫度升高蛋白質(zhì)的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇濃度增加；pH值的影響因不同的蛋白質(zhì)而不同，一般情況下，當(dāng)溶液的pH值與酶蛋白的等電點(diǎn)一致時(shí)，需要的乙醇濃度最低，偏離酶蛋白的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，酶蛋白所帶電荷越多，蛋白質(zhì)的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇濃度越高。一般作為沉淀劑的乙醇濃度是95%，沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有差異。如沉淀枯草桿菌的淀粉酶發(fā)酵液時(shí)，要求乙醇濃度為：每體積的發(fā)酵液加0.20.8體積的乙醇；當(dāng)沉淀蛋白酶時(shí)，加

9、0.81.1體積的乙醇沉淀出的主要是中性蛋白酶，加1.11.4體積的乙醇時(shí)，沉淀出的主要是堿性蛋白酶。對于每一種酶蛋白的沉淀要求乙醇的適宜濃度需要實(shí)驗(yàn)確定。8幾種主要沉淀方法比較9CH 4.1 酶制劑的工業(yè)提取方法3 酶蛋白的初步純化與濃縮3.3 噴霧干燥法 此法是利用噴霧干燥技術(shù)，直接將液態(tài)酶濃縮成固體酶制劑，此法的生產(chǎn)效率較高，工藝過程簡單，但此法在生產(chǎn)應(yīng)用上有一定的局限性，在噴霧干燥時(shí)，需要一定的溫度，在噴霧塔里面進(jìn)如一定溫度的熱空氣，對于那些對熱不穩(wěn)定的酶蛋白不宜使用，現(xiàn)用在生產(chǎn)的主要是生產(chǎn)-淀粉酶。 3.4 膜分離技術(shù) 除上述經(jīng)典的濃縮方法外，目前膜技術(shù)的發(fā)展已應(yīng)用到酶蛋白的濃縮和分

10、離上來了，膜分離技術(shù)是以一定孔徑的高分子膜作為過濾介質(zhì)，將不同大小、不同性狀、物質(zhì)顆?；虼蠓肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。 膜分離技術(shù)所使用的膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢、尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分離過程中，膜的作用是有選擇性地小于其孔徑的顆粒通過，將大的顆粒截留，根據(jù)欲分離的物質(zhì)顆粒的大小，選擇不同孔徑的膜。 根據(jù)物質(zhì)顆粒通過膜的原理及和推動力的不同，膜分離技術(shù)可分為以下三種： 加壓膜分離 加壓膜分離是以膜兩側(cè)的流體靜壓差為動力，推動小于膜孔徑的顆粒通過膜孔，大于孔徑的顆粒被截留。根據(jù)膜孔徑大小范圍又分為超濾、微濾和反滲透三種。 超濾：即超過濾，本技術(shù)過濾截留的顆粒直徑

11、在202000A（0.2m)相當(dāng)于分子量10005105Da,并且有多種規(guī)格供選用。此法主要用于酶蛋白的濃縮和部分純化分離，此外，在生化藥業(yè)也常被采用。 此技術(shù)采用的濾膜是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜，膜由兩層構(gòu)成，分表層和基層，表層是濾膜的有效層，其厚度為0.15mm，孔徑大小有多種規(guī)格，現(xiàn)有202000A的系列產(chǎn)品銷售；基層為支持層，主要負(fù)責(zé)膜的強(qiáng)度，其厚度為200250m具有堅(jiān)韌的強(qiáng)度。 影響超濾的因素：膜的過濾效果用膜的流率來表示，即每平方厘米膜每分鐘濾過的流體量，以ml./cm2.min表示，影響流率的主要因素有膜孔徑的大小、顆粒性狀、溶液的黏度

12、、流體靜壓。根據(jù)上述影響因素，可在一定范圍內(nèi)增加流體靜壓（一般控制在50700kPa)、適當(dāng)提高溶液溫度、增加溶液的攪拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。 超濾技術(shù)在目前無論是實(shí)驗(yàn)室研究還是酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用都非常廣泛，其操作簡單，工作效率高，但對于那些有小分子輔酶的酶制劑不宜采用此技術(shù)。 微濾：又稱微孔過濾，其孔徑較超濾膜的孔徑大，一般在0.22.0m范圍，主要用于過濾去除細(xì)菌及其它顯微鏡下可見的顆粒物質(zhì)，此法在酶蛋白的濃縮和分離方面不用，主要勇于礦泉水、無菌水、軟飲料生產(chǎn)方面除菌和除去不溶性顆粒物質(zhì)。 反滲透：反滲透膜的孔徑最小，一般在20A，截留分子量為1000D主要用于分離各種離子

13、和小分子物質(zhì)，此技術(shù)主要用于生產(chǎn)純水，海水的淡化等。 電場膜分離：將膜分離裝置置于電場下，被分離的物質(zhì)在電場的作用下，借助電場力作為推動力，以達(dá)到分離的目的。利用電場膜分離的物質(zhì)，必須具備一個(gè)基本條件，那就是其必須是帶電粒子，如果其不帶電荷，或其靜電荷為零，這樣的粒子就不適宜用此法分離。常用的有以下兩種方法： 電滲析：在一個(gè)電滲槽內(nèi)，用兩塊半通透膜隔成三個(gè)室，中間室裝待分離液，兩側(cè)室裝水或緩沖液，并裝有電極，接通電源后，帶正電荷的粒子向負(fù)極滲透，而帶負(fù)電荷的粒子向正極滲透，從而達(dá)到分離的目的。此法多用于酶液的脫鹽，去除雜質(zhì)等。 離子交換膜電滲析：其裝置與電荷風(fēng)析一致，只是所用的膜較為特殊，兩塊

14、膜上帶有帶電基團(tuán)，且電性相反，使得帶相同電荷的粒子不能靠近膜，不致于影響膜的通透性。其應(yīng)用范圍與電滲析一致，當(dāng)溶液的濃度較高時(shí)，此法工作效率更高。 擴(kuò)散膜分離： 擴(kuò)散膜分離主要是指透析方法，將酶溶液裝在由擴(kuò)散膜制成的透析袋中，再將透析袋置于擴(kuò)散介質(zhì)（緩沖液）中，溶液中的小分子就通過膜擴(kuò)散出來，大分子被截留在袋內(nèi)。此法主要用于沒蛋白的脫鹽；另外此法還可用于酶蛋白的濃縮，當(dāng)濃縮酶蛋白時(shí)，是用高濃度的吸水性較強(qiáng)的擴(kuò)散介質(zhì)，常用的有甘油、聚乙二醇（粉劑）等。10CH4-2酶蛋白的提純與精制 一般情況下，工業(yè)上用的大多是經(jīng)過初步提純和濃縮即可制備成酶制劑；對于多數(shù)醫(yī)用酶制劑或分析用酶制劑或生化試劑等，則

15、需要進(jìn)行高度提純和精制；另外對于開發(fā)出的新的酶制劑，在投入規(guī)?；a(chǎn)前，為研究其各種酶蛋白特性和酶學(xué)特性，也需要將酶進(jìn)一步提純和精制。 酶蛋白提純的經(jīng)典程序包括：離子交換層析分子篩過濾層析電泳檢測純度（必要時(shí)可進(jìn)行制備電泳分離）11各類層析的原理和載體類別 分離原理 基質(zhì)或載體吸附層析 化學(xué)、物理吸附 硅膠、氧化鋁 、羥基磷酸分配層析 兩溶劑相中的溶解效應(yīng) 纖維素、硅藻土 、硅膠凝膠層析 分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng) sepharose 、sephadex離子交換層析 離子基團(tuán)的交換反應(yīng) 離子交換樹脂 、纖維素、 葡聚糖親和層析 分離物與配體之間有 帶配基的sepharose 特殊親和力 或sepha

16、dex聚焦層析 等電點(diǎn)和離子交換作用 多緩沖交換劑（與帶有多種電 荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的 sepharose 6B）12CH4-2酶蛋白的提純與精制1 離子交換層析法 （1）離子交換劑：離子交換劑是借酯化、氧化或醚化等化學(xué)反應(yīng)，在瓊脂糖、纖維素或凝膠分子上某些極性基團(tuán)，通過極性基團(tuán)的靜電吸附作用，對極性大分子進(jìn)行分離。 按離子交換劑上的活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，可分為陽離子交換劑和陰離子交換劑兩種。陰離子交換劑： 當(dāng)離子交換劑攜帶陽性基團(tuán)，用來吸附陰離子時(shí)，交換劑稱為陰離子交換劑。 目前常用的陰離子交換劑有： DEAE纖維素（二乙基氨基乙基纖維素） DEAE纖維素適宜用來分離分子量在10,000-10

17、0,000或以上的蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定性好，裝柱后，在洗脫過程中，柱床體積基本保持不變，交換容量大，每克交換劑可吸附0.11.1毫克酶蛋白。 DEAESephadexA50 DEAESephadexA50的交換容量更大，（5.0毫克/克交換劑），但其有一最大的局限性，就是在洗脫過程中，隨著離子強(qiáng)度的增加柱床體積變小，影響分離效果。 AE纖維素（氨基乙基纖維素）陽離子交換劑： 陽離子交換劑有： CM纖維素（CMC， 羧甲基纖維素）。 弱酸性陽離子交換劑。 磷酸纖維素（PC） 中酸性離子交換劑。13常用的陽離子交換劑離子交換劑 可電離基團(tuán) 可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型） 羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸

18、型） 磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型） 磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型） 磺丙基14常用的陰離子交換劑AE-纖維素（弱堿型） 氨基乙基離子交換劑 可電離基團(tuán) 可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱堿型） 對氨基苯甲酸DEAE-纖維素 二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基DEAE -纖維素（強(qiáng)堿型） 三乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)堿型）二乙基（2-羥丙基） -氨基乙基（中弱堿型）（中弱堿型）15CH4-2酶蛋白的提純與精制1 離子交換層析法（2）離子交換分離酶蛋白的基本原理： 一般情況下，酶蛋白的等電點(diǎn)在pH7以下，所以在偏堿性溶液中，酶蛋白帶負(fù)電荷，所以多用陰離子交換劑；（有些酶

19、蛋白等 電點(diǎn)較高，可以將其置于偏酸性溶液中，這樣酶蛋白就帶正電荷，分離純化時(shí)應(yīng)選用陽離子交換劑）。 在同一pH條件下，由于不同的蛋白質(zhì)所帶電荷不同，其與交換劑的親和力不同，通過梯度增加洗脫劑的離子強(qiáng)度，按蛋白質(zhì)與交換劑親和力的由小到大，依次被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。16離子交換層析原理示意圖蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度17CH4-2酶蛋白的提純與精制1 離子交換層析法 離子交換拄層析基本程序及要點(diǎn)：（以DEAE纖維素為例） 離子交換劑

20、的處理：首先將DEAE纖維素用蒸餾水浸泡溶漲，然后按：0.5N鹽酸處理30分鐘以上（不斷攪拌）蒸餾水反復(fù)洗滌致中性0.5N氫氧化鈉處理30分鐘（不斷攪拌）蒸餾水洗滌致中性。洗脫液pH的確定：采用pH梯度測定。按10交換當(dāng)量加入離子交換劑和酶蛋白振蕩保溫2030min靜止后，測定上清夜的酶活力到?jīng)]有酶活力測出的試管pH1，即為離子交換洗脫液的最適pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7平衡：裝柱后，用洗脫液進(jìn)行平衡過夜，流述稍大于洗脫流述，使流出緩沖液的pH與流入的相同。上樣和平衡：為達(dá)到良好的分離效果，上樣量一般為其交換容量的1020%，樣品的pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)與洗脫液一致。上樣后用洗脫

21、Buffer平衡。洗脫曲線：分部收集：利用自動分部收集器收集。洗脫：上樣后，首先用平衡洗脫液洗脫，主要是洗脫下那些與交換劑結(jié)合力很小或不結(jié)合的雜蛋白；然后，通過改變洗脫液的離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度洗脫梯度洗脫公式為： =C2(C2C1)(1v/V)A2/A1C2：洗脫液的極限離子濃度；C1：初始離子濃度； v：洗脫液流出體積；V：貯液室和混合室的總體積；A2：貯液室的截面積；A1：混合室的截面積； 當(dāng)A2/A1等于1時(shí)，上述公式代表一個(gè)直線梯度變化；當(dāng)小于1時(shí)，為凹形梯度變化；當(dāng)大于1時(shí)，為凸形梯度變化。 裝柱：將交換劑攪拌懸浮起來，抽氣處理，然后用傾倒法裝柱。(8) 收集與濃縮凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大

22、分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形18CH4-2酶蛋白的提純與精制2 分子篩層析法（1）分子篩層析法基本原理 凝膠過濾法是以不同蛋白質(zhì)的分子量大小差異來將不同蛋白質(zhì)分開的方法。最常用的凝膠是葡聚糖凝膠（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2環(huán)氧化丙烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成的中央帶有微孔的球狀凝膠顆粒，根據(jù)凝膠分子的交聯(lián)程度的不同，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8種型號，G50以下的為硬膠，G7

23、5以上的為軟膠。G10的交聯(lián)度最高，分子內(nèi)的網(wǎng)孔最小；G200的交聯(lián)度最低，分子內(nèi)網(wǎng)孔最大。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同，在通過層析柱時(shí)，走的路程不同，從而分開。 （2） 凝膠的選擇： G25以下主要用于脫鹽和氨基酸，或用于分離分子量在5000以下的小肽。 G50 主要用于分離分子量150030000的小分子蛋白。 G75 300080000 G100 4000150000 G150 5000300000 G200 5000600000 （3）凝膠的溶脹： 凝膠規(guī)格 融脹體積（ml/g) 時(shí)間/h .20C 時(shí)間/h . 90-100C G10 23 3 1 G15 2.5-3.5 3 1 G25

24、 4-6 3 1 G50 9-11 3 1 G75 12-15 24 3 G100 15-20 72 3 G150 20-30 72 5 G200 30-40 72 5 (4) 裝柱： 裝柱前必須進(jìn)行凝膠脫氣處理， 裝柱要求同離子交換層析 （5）裝柱效果檢測： 用帶有顏色的大分子上樣，然后洗脫，檢測樣品走柱的介面效果，常用藍(lán)色葡聚糖2000。 （6）上樣： 和離子交換層析有根本不同。 主要考慮上樣體積，一般控制在110。視具體情況而定。 （7）洗脫 洗脫劑可以用低濃度 Buffer，也可用蒸餾水； 在洗脫過程中，主要控制兩個(gè)參數(shù)： 流速和有效操作壓 凝膠規(guī)格 流速（ml/h.cm2) 有效操作

25、壓(cm/H2O) G10 G15 G25 G50 G75 77 160 G100 50 96 G150 23 36 G200 12 16（8） 分部收集： 基本同離子交換層析(9) 凝膠的再生與保存：再生：用0.1mol 鹽酸和0.1mol 氫氧化鈉交替浸泡后，蒸餾水洗到中性，重新裝柱，可反復(fù)使用；保存：用0.1mol 鹽酸和0.1mol 氫氧化鈉交替浸泡后，蒸餾水洗到中性；50乙醇75乙醇95乙醇冰箱保存。19蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系A(chǔ)ndrews的經(jīng)驗(yàn)公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“ 選擇

26、性曲線” G-200G-100logMrKav20 吸附層析（absorption chromatography）原理：載體 ： 硅膠 氧化鋁 羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物質(zhì)以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。21分 配 層 析 （distribuption chromatography） 原理：載體 ：纖維素 硅藻土 硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定 分配

27、層析實(shí)際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑）。當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點(diǎn)時(shí)，樣品點(diǎn)中的溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進(jìn)行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。22逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑 A物質(zhì)Z(Kd=3)的分配情況溶劑 B總量總量總量總量總量總量平衡后轉(zhuǎn)移 1轉(zhuǎn)移 2轉(zhuǎn)移 3分溶管號轉(zhuǎn)移 4上相轉(zhuǎn)移下相轉(zhuǎn)移上相轉(zhuǎn)移管中蛋白質(zhì)總量物質(zhì)Y物質(zhì)Z分溶曲線管號有效分配系數(shù)（Keff） 某一物質(zhì)在A相中的總量某一物質(zhì)在B相中的總量23親和層析（affiuity chromato

28、graphy）應(yīng)用 分離純化酶、 抗原、抗體 分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a. 理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b. 活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑+雜質(zhì)c. 待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d. 偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sepharose、sephadex24親和層析原理示意圖蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的可溶性配基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)25聚焦層析（Chromatofocusing） 該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基

29、礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。 pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí),由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地 遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速

30、率層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖26幾種主要層析方法比較27 酶蛋白經(jīng)分離純化后的純度如何，必須用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定，最常用的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE）,現(xiàn)已發(fā)展成很多方法，如：PAGE圓盤電泳（柱狀電泳）、PAGE垂直板狀電泳等。 28CH4-2酶蛋白的提純與精制3 酶蛋白純度檢測 電泳的基本原理聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺單體（Acr)和N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑的作用下，經(jīng)聚合反應(yīng)而形成的，根據(jù)欲分離的蛋白分子的大小，通過控制Acr和Bis的比例以及總濃度來控制凝膠的孔徑大小，制成各種孔徑的凝膠，這

31、樣蛋白質(zhì)顆粒在電泳時(shí)，兩種作用力，即電場力和蛋白質(zhì)顆粒在電場中運(yùn)動所受的阻力， F= H .Q（1） F/ =6（2） F:電場力； H：電場強(qiáng)度；Q：質(zhì)點(diǎn)所帶電荷； F/ ：質(zhì)點(diǎn)所受阻力；：質(zhì)點(diǎn)半徑；：電解質(zhì)黏度；電泳述度； 29在一定的電場中，蛋白質(zhì)分子的理論電泳遷移述率（即遷移述度） V=Q/6.（3） 從這個(gè)公式中可以看出，V與蛋白質(zhì)所帶電荷的多少成正比，而與蛋白質(zhì)分子的大小成反比。 不同的蛋白質(zhì)，其分子量和所帶電荷的多少都表現(xiàn)出不同程度的差異，從而在電泳時(shí)有不同的遷移輸率，經(jīng)電泳后，不同的蛋白分子遷移到電泳介質(zhì)的不同部位，經(jīng)過蛋白質(zhì)染色處理，在凝膠的不同區(qū)域表現(xiàn)出相應(yīng)的電泳帶。 從這

32、個(gè)原理來講，電泳技術(shù)不僅能對蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定，并且還是分離提純的有效方法。30電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳31聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE） PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性) 或 連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進(jìn)行電泳分離一種方法。 PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺

33、(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。 化學(xué)聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED 光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED 不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)32不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)ABC+-樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-33SDS原理： 當(dāng)SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同

34、時(shí)蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS -蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。可用下式表示： Log Mr=a bmr應(yīng)用: 測定蛋白質(zhì)分子量 測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）Log Mr34等電點(diǎn)聚焦（isoelectric focusing）原理: 在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時(shí)，便形成一個(gè)由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩

35、性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用： 高效率分離純化蛋白質(zhì) 測定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1= pH8pI2= pH7pI3= pH5-+線性梯度35瓊脂糖電泳 瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到450C以下時(shí)，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。 瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應(yīng)，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構(gòu)象及其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，而且與凝膠的濃度也有密切關(guān)系，故可根據(jù)分離

36、對象分子量大小選擇適當(dāng)濃度的凝膠。 瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA， 瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。36不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度(%) 可分辨的線性DNA大小范圍(kb) 0.3 60-5 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物水平型平板電泳槽 37毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE) 毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75m）中裝入緩沖液，從其一端注

37、入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。 毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、 DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細(xì)管電泳原理示意圖 38毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液正極負(fù)極39CH4-2酶蛋白的提純與精制3 酶蛋白純度檢測 基本操作要點(diǎn) 聚丙烯酰胺凝膠濃度確定凝膠的孔徑由丙烯酰胺

38、單體（Acr）和雙體（Bis）的總濃度（T%）和雙體占總濃度的百分比（C%）所決定。 T% （ab）/m100% C%b/（ab） 100% a：單體；b：雙體；m: 凝膠溶液體積T： 凝膠總濃度，主要考慮要分離的蛋白質(zhì)分子量的大小而定；C 決定凝膠的交聯(lián)度的高低；在T確定后；調(diào)整C%，可改變凝膠孔徑的大小。 經(jīng)驗(yàn)公式是：C6.50.3T 還有些學(xué)者主張固定為 C5T 聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表 樣品 分子量范圍 適宜的T% 蛋白質(zhì) 5 105 2 -5 核 酸 104 15-20 104 105 5-10 105 2 106 2 2.6 凝膠的聚合化學(xué)聚合：用過硫酸銨（AP）作催化劑，用四甲基

39、乙二胺（TEMED）作加速劑；用量：TEMED加總體積的0.005倍 PA 加總體積的0.05倍 聚合時(shí)間一般在室溫下30-60min光聚合：用核黃素作催化劑1mg/ 100ml點(diǎn)樣：注意樣品的密度和點(diǎn)樣量；電泳：恒壓電泳和恒流電泳取膠：固定：7% 醋酸或12.5的三氯醋酸染色： 染色液有 氨基黑10B 考馬斯亮蘭G250 考馬斯亮蘭R250 蛋白質(zhì)純度確定：純一譜帶40三、 離心技術(shù)1離心機(jī)類別 普通離心機(jī) 1000轉(zhuǎn)/分 高速離心機(jī) 2-3萬轉(zhuǎn)/分 超速離心機(jī) 3萬轉(zhuǎn)/分2沉降系數(shù)（ sedimentation coefficient, s）3超離心法類別 密度梯度離心法（ density

40、 gradient ） 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）41離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動馬達(dá)真空冷凍42 沉降系數(shù)（sedimentation coefficient） 生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時(shí)間。數(shù)學(xué)定義式為： 沉降系數(shù)單位：由于蛋白質(zhì)、核酸、病毒等的沉降系數(shù)介于110-13介于10-13到20010-13s的范圍，為方便起見，把110-13s作為沉降系數(shù)的一個(gè)單位，用Svedberg單位，用

41、即S表示。沉降系數(shù)（s）與相對分子量（Mr）的關(guān)系:Mr =RTsD(1-)Svedberg方程:d /dt2 s =43密度梯度離心法（density gradient） 生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度441、核酸密度的測定 = o + 4.2 2(2- 02)10-102、測定

42、DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式： = 0.100 xG-C + 1.6583、溶液中核酸構(gòu)象的研究 ：單鏈DNA雙鏈DNA 蛋白質(zhì) 雙鏈DNA RNA4、核酸的制備 氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應(yīng)用45沉降速率法（ sedimentation velocity） 在離心場的作用下，蛋白質(zhì)分子將沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向（徑向）移動，并產(chǎn)生沉降界面，界面的移動速度代表蛋白質(zhì)的沉降速度。在界面處由于濃度差造成折射率不同，可借助適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)，如

43、schlieren光學(xué)系統(tǒng)（也稱暗線光學(xué)照相系統(tǒng)），觀察到這種界面的移動。在schlieren光學(xué)系統(tǒng)中，利用溶液的折射率梯度（d/d）和樣品的濃度梯度（dc/d）成正比這一特點(diǎn)，巧妙地設(shè)計(jì)光路，使移動的界面以峰形曲線呈現(xiàn)在照相圖片上，峰頂代表移動界面。離心機(jī)的裝置允許在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)時(shí)，對界面的移動進(jìn)行觀察和拍照。46分析型超速離心機(jī)光源柔性驅(qū)動軸熱敏溫度計(jì)樣品池準(zhǔn)直透鏡液面沉降界面溶劑配衡池沉降界面聚光透鏡馬達(dá)濾光片溶質(zhì)空氣沉降方向照相機(jī)透鏡園柱型透鏡底板Schlieren光閘真空冷凍12cd /d47沉降平衡法（ sedimentation eguilibrium ） 在較低速度（8,0

44、00-20,000r/min）的離心場中，離心開始時(shí)，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度。因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用，擴(kuò)散力的作用方向正與離心力相反，當(dāng)凈離心力與擴(kuò)散平衡時(shí)，在離心池內(nèi)從液面到池低形成一個(gè)由低到高的恒定濃度梯度。如果測得相關(guān)參數(shù)即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴(kuò)散力x2Mr=(1-)2(22-12)2RTdln(c2-c1)計(jì)算公式如下：48CH4-3 酶制劑的成型與保存1 酶制劑的主要?jiǎng)┬图捌渲苽?酶制劑的主要?jiǎng)┬停捍置钢苿簩?shí)際包括兩類制劑，液體酶制劑和固體粗酶制劑。純酶制劑：經(jīng)過純化后的制劑，通常是結(jié)晶酶制劑，有時(shí)也制成液體制劑，如遺傳工程的工具酶，常加甘油成劑；醫(yī)用酶有液體口服劑、針劑(安瓶)、片劑、酶藥劑、固定化微囊等商品；分析試劑用酶，則常為結(jié)晶酶；工業(yè)用酶多為粉劑、顆粒酶、麩皮酶等粗制酶；液體酶制劑，較不穩(wěn)定，但較經(jīng)濟(jì)，常為某些工業(yè)用戶就近使用而生產(chǎn)。49CH4-3 酶制劑的成型與保存1 酶制劑的主