哺乳類動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式

1、哺乳類動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式 深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。 一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 是細胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機械攪拌式生物反應(yīng)器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。 該方式的特點: 操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其他任何控制，因此操

2、作簡單，容易掌握； 直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎(chǔ)條件或小試研究常用的手段； 可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡單，對設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)?？蛇_12000L。 分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學表現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對

3、數(shù)生長期（48-72h）細胞密度達到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進行。 二、流加式培養(yǎng)（feeding culture） 1.流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞，細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/21/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細胞持續(xù)生長至較高的密度，目標產(chǎn)品達到較高的水平，整個培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應(yīng)體

4、系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。 2.流加培養(yǎng)特點： 流加培養(yǎng)根據(jù)細胞生長速率、營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。 培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時間較長，總細胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。 流加培養(yǎng)過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環(huán)境變化時的瞬間行為。流加培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基的設(shè)計和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。 在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放

5、大。 流加培養(yǎng)是當前動物細胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進行流加的時間多在指數(shù)生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)?？梢蕴砑右淮危部商砑佣啻?，為了追求更高的細胞密度往往需要添加一次以上，直至細胞密度不再提高；可進行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進行添加，但為了盡可能的維持相對穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細胞生長的物質(zhì)均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分即不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無

6、效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細胞生長抑制或死亡。 3.流加工藝中的營養(yǎng)成分主要分為三大類： 葡萄糖：葡萄糖是細胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。 谷氨酰胺：谷氨酰胺是細胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳； 大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血

7、清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 氨基酸、維生素及其他：主要包括營養(yǎng)必需氨基酸、營養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續(xù)流加。 4.流加式培養(yǎng)分為兩種類型：單一補料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補料分批式培養(yǎng)。 單一補料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時投入一定量

8、的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時期，開始連續(xù)補加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補加，最后將細胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時間內(nèi)。 反復(fù)補料分批式培養(yǎng)是在單一補料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。 三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 1.半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中

9、，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。 這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/23/4，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩毎鲩L和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由

10、于細胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細胞密度常常會提高。 2.半連續(xù)式特點： 培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進行多次收獲； 細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。 該操作方式的優(yōu)點是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。 四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culture） 1.連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細胞

11、達最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。 2.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細胞和細胞碎片及時清除

12、，細胞活性高最終細胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；尤其是細胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營養(yǎng)物質(zhì)利用率、細胞增長速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。 3.連續(xù)式培養(yǎng)不足： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染； 在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異； 對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。 連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。 4.連續(xù)式培養(yǎng)的特點： 細胞維持持續(xù)指數(shù)增長； 產(chǎn)物體積不斷增長； 可控制衰退期與下降期。 五、灌流式培養(yǎng)（perfusion culture） 1.灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細胞增長

13、和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。 灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細胞，這種反應(yīng)器必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。 中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反

14、應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。 另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應(yīng)，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。 2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點： 細胞截流系統(tǒng)可使細胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細胞密度，一般可達107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，

15、使細胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低； 反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。 連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法最大困難是污染機率較高，長期培養(yǎng)中細胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過程中工程問題。 六、細胞工廠培養(yǎng) 細胞工廠(cell factory)是一種設(shè)計精巧的細胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。 丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細胞工廠是目前應(yīng)用較多的細胞工廠系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙?、單